Name: マウス胸腺上皮細胞のシングルセル懸濁液の調製とフローサイトメトリー解析のための細胞内分子の染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学ぶマウス胸腺上皮細胞のシングルセル懸濁液調製とフローサイトメトリー解析手法。細胞内分子染色によりT細胞発生と選択の分子メカニズムを解明し、免疫学研究の基盤技術として活用できます。

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原稿を読んでくださった大東泉先生に感謝いたします。この研究は、国立衛生研究所、国立がん研究所、およびがん研究センターの学内研究プログラムZIA BC 011806によって支援されました。

すべてのマウス実験は、国立がん研究所の動物管理および使用委員会(ASP21-431、ASP21-432、およびEIB-076-3)の承認の下で行われました。
1. 胸腺細胞懸濁液の調製
注:マウスの個体発生は、胸腺からのTECの酵素的遊離の効率に影響を与えます。マウスの年齢に応じた3つの方法を以下に説明します。
<ol>
	<li>生後3週間以上の出生後マウスの場合
	<ol>
		<li>1匹のマウスから胸腺(2つの胸腺葉)を収穫します。氷上の60mmプラスチック皿に10mM HEPESを含む5mLのRPMI1640に胸腺を入れます。</li>
		<li>血液、胸腺以外の組織、脂肪を、湾曲した細い先端のピンセットで解剖顕微鏡で取り除きます。胸腺を解剖ハサミで細かく切ります(サイズは約1〜2 mm)。</li>
		<li>胸腺片を、3 mLの1 mg/mLコラゲナーゼ/ディスパーゼと、2%ウシ胎児血清(FBS)を含むRPMI1640中の1 U/mL DNase溶液を含む15 mLのコニカルチューブに移します。ウォーターバスまたはヒートブロックで37°Cで20分間インキュベートします。</li>
		<li>3 mLのプラスチック製トランスファーピペットを使用して穏やかに混合します。組織片がまだ見える場合に備えて、さらに20分間インキュベートします。</li>
		<li>3 mLのプラスチック製トランスファーピペットを使用して穏やかに混合します。組織片がまだ見える場合に備えて、さらに10分間インキュベートします。</li>
		<li>3 mLのプラスチック製トランスファーピペットを使用して穏やかに混合します。5 mLの5 mM EDTAを1% FBSを含む1x HBSSに添加します。</li>
		<li>細胞懸濁液を60μmのナイロンメッシュでろ過し、新しい50mLコニカルチューブに入れます。細胞懸濁液を350 × g、4°Cで5分間遠心分離します。</li>
		<li>細胞ペレットを10mLのFACS緩衝液(1%ウシ血清アルブミン[BSA]および0.1%NaN3を含む1x HBSS)に再懸濁します。</li>
		<li>セルを氷上に保存し、セルカウンターを使用してセル番号を決定します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生後1〜2週齢の新生児マウスの場合
	<ol>
		<li>手順 1.1.1 を実行します。</li>
		<li>解剖顕微鏡で解剖ピンセットを使用して血液と胸腺以外の組織を取り除きます。胸腺を200μLのRPMI1640 10mM HEPESが入った1.5mLのプラスチックチューブに移し、胸腺を解剖ハサミで細かく切開します(サイズは約1〜2mm)。</li>
		<li>胸腺の断片がチューブの底に沈殿するのを待ってから、200 μLのマイクロピペットで懸濁液を静かに取り除きます。</li>
		<li>胸腺片を、2 mLの0.5 mg/mLコラゲナーゼ/ディスパーゼと1 U/mL DNase溶液(2% FBSを含むRPMI1640)を含む5 mLのポリプロピレン丸底チューブに移します。.ウォーターバスまたはヒートブロックで37°Cで10分間インキュベートします。</li>
		<li>3 mLのプラスチック製トランスファーピペットを使用して穏やかに混合し、次にプラスチックチップを取り付けた1 mLのマイクロピペットでさらに均質化します。</li>
		<li>1% FBSを含む1x HBSSに2 mLの5 mM EDTAを加えます。細胞懸濁液を60μmのナイロンメッシュでろ過し、50mLのコニカルチューブに入れます。10 mM HEPESを含む16 mLのRPMI1640を加えます。</li>
		<li>細胞懸濁液350 × gを4°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを10 mLのFACSバッファーに再懸濁します。</li>
		<li>セルを氷上に保存し、セルカウンターを使用してセル番号を決定します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生後1週齢までの胚性マウスおよび新生児マウス用
	<ol>
		<li>1匹のマウスから胸腺(2つの胸腺葉)を収穫します。胸腺を60mmのプラスチック皿に入れ、解剖顕微鏡下で湾曲した細い先端ピンセットで血液、胸腺以外の組織、脂肪を取り除きます。</li>
		<li>胸腺を10 mM HEPESを含む0.2 mLのRPMI1640に入れ、1.5 mLの微量遠心チューブに入れます。200 μLのマイクロピペットで液体を捨てます。</li>
		<li>0.5 mLの0.5 mg/mLコラゲナーゼ/ディスパーゼと1 U/mL DNase溶液を2% FBSを含むRPMI1640に加えます。ウォーターバスまたはヒートブロックで37°Cで10分間インキュベートします。プラスチック製の先端が付いた1 mLのマイクロピペットを使用して穏やかに混合します。</li>
		<li>1% FBSを含む1x HBSSに0.5 mLの5 mM EDTAを加えます。細胞懸濁液を60μmのナイロンメッシュでろ過し、新しい15mLコニカルチューブに入れます。10 mM HEPESを含む9 mLのRPMI1640を加えます。</li>
		<li>細胞懸濁液を350 × g、4°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを1〜3 mLのFACSバッファーに再懸濁します。</li>
		<li>セルを氷上に保存し、セルカウンターを使用してセル番号を決定します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>代替方法:リベラーゼ消化
	<ol>
		<li>手順 1.1.1 と 1.1.2 を実行します。</li>
		<li>胸腺の断片がチューブの底に沈殿するのを待ってから、200 μLのマイクロピペットで懸濁液を静かに取り除きます。胸腺片を、1 mLの0.5 U/mLリベラーゼと1 U/mL DNase(10 mM HEPESを含むRPMI1640)が入った5 mLチューブに移します。ウォーターバスまたはヒートブロックで37°Cで15分間インキュベートします。</li>
		<li>プラスチック製の先端が付いた1 mLのマイクロピペットを使用して穏やかに混合します。組織片がまだ見える場合に備えて、さらに15分間インキュベートします。</li>
		<li>プラスチック製の先端が付いた1 mLのマイクロピペットを使用して穏やかに混合します。1% FBSを含む1x HBSSに5 mM EDTA1 mLを加えます。</li>
		<li>細胞懸濁液を60μmのナイロンメッシュでろ過し、新しい50mLコニカルチューブに入れます。10 mM HEPESを含む18 mLのRPMI1640を加えます。</li>
		<li>細胞懸濁液を350 × g、4°Cで5分間遠心分離し、10 mLのFACSバッファー(1% BSAと0.1% NaN3を含む1x HBSS)に細胞を再懸濁します。</li>
		<li>セルを氷上に保存し、セルカウンターを使用してセル番号を決定します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胸腺細胞の抗体染色
<ol>
	<li>16個×10個の6個の細胞を5mLのポリスチレン丸底チューブに入れます。細胞を350 × g、4°Cで5分間遠心分離します。上清を捨てます。</li>
	<li>FACSバッファーに10 μLの作動濃度の抗Fc受容体モノクローナル抗体(mAb、クローン2.4G2)を添加して、染色性IgGの細胞表面Fc受容体への非特異的結合をブロックします。4°Cで5分間インキュベートします。</li>
	<li>FACSバッファーに抗CD45 mAb(造血細胞特異的、BV421標識など)、抗EpCAM mAb(上皮細胞特異的、PE-Cy7標識など)、抗Ly51 mAb(cTEC検出、AF647標識など)、およびUlex europaeus 凝集素I(UEA-1)(mTEC検出、AF594標識など)の各使用濃度を40 μL加えます。並行して、フローサイトメーターをセットアップするための単色染色細胞と未染色細胞用のチューブを準備します。</li>
	<li>4°Cで45分間インキュベートし、10分ごとによく混合し、2 mLのFACSバッファーを加えます。</li>
	<li>細胞350 × gを4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。</li>
	<li>Ghost Dye Violet 510 1 μL を添加します (固定細胞および透過処理細胞のフローサイトメトリー解析で生細胞と死細胞を区別するため)。原液のGhost Dye試薬を使用してください。よく混ぜます。4°Cで30分間インキュベートします。10分ごとによく混ぜます。</li>
	<li>2mLのFACSバッファーを加えます。細胞350 × gを4°Cで5分間遠心分離します。上清を捨てます。</li>
	<li>1 mLの2%パラホルムアルデヒド(PFA)をPBSに添加し、室温で10分間インキュベートして細胞を固定します。</li>
	<li>3.5 mLのPBSをチューブに加え、細胞を700 × g、4°Cで8分間遠心</li>分離します。
	<li>1 mLのIntracellular Fixation/Permeabilization Bufferを添加し、4°Cで20分間インキュベートすることにより、細胞を透過処理します。</li>
	<li>細胞を700 × g、4°Cで8分間遠心分離し、上清を捨てます。</li>
	<li>1x Permeabilization Bufferを1 mL加えます。細胞を700 × g、4°Cで8分間遠心分離します。上清を捨てます。</li>
	<li>1x透過化バッファーに、使用濃度の抗β5t抗体または抗CCL21抗体の使用濃度をそれぞれ100 μL、または使用濃度の抗Aire抗体(AF488標識など)を40 μL加え、よく混合し、室温で60分間インキュベー</li>トします。
	<li>1x Permeabilization Bufferを1 mL加えます。細胞を700 × g、4°Cで8分間遠心分離します。上清を捨てます。</li>
	<li>手順2.14を繰り返します。</li>
	<li>100 μLの作動濃度の抗ウサギIgG(AF555標識など)を加え、室温で30分間インキュベー</li>トします。
	<li>1x Permeabilization Bufferを1 mL加えます。細胞を700 × g、4°Cで8分間遠心分離します。上清を捨てます。</li>
	<li>細胞を200 μLのFACS Bufferに再懸濁し、よく混合します。</li>
	<li>細胞を4°Cの暗所で保存し、フローサイトメトリー分析を行います。</li>
	<li>フローサイトメトリー解析の前に、60 μmナイロンメッシュで細胞をろ過します。</li>
</ol>

Preparing Mouse Thymic Epithelial Cells for Analysis of Intracellular Molecules

<ol><li>Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+the+T+cell+repertoire%3A+what+thymocytes+see+%28and+don%27t+see%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see).</a> Nat Rev Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).</li>
<li>Takahama, Y., Ohigashi, I., Baik, S., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+diversity+in+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of diversity in thymic epithelial cells.</a> Nat Rev Immunol. 17 (5), 295-305 (2017).</li>
<li>Hozumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta-like+4+is+indispensable+in+thymic+environment+specific+for+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Delta-like 4 is indispensable in thymic environment specific for T cell development.</a> J Exp Med. 205 (11), 2507-2513 (2008).</li>
<li>Koch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta-like+4+is+the+essential%2C+nonredundant+ligand+for+Notch1+during+thymic+T+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Delta-like 4 is the essential, nonredundant ligand for Notch1 during thymic T cell lineage commitment.</a> J Exp Med. 205 (11), 2515-2523 (2008).</li>
<li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CD8%2B+T+cell+development+by+thymus-specific+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes.</a> Science. 316 (5829), 1349-1353 (2007).</li>
<li>Ripen, A. M., Nitta, T., Murata, S., Tanaka, K., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+thymic+cortical+epithelial+cells+expressing+the+thymoproteasome+subunit+%CE%B25t%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of thymic cortical epithelial cells expressing the thymoproteasome subunit β5t.</a> Eur J Immunol. 41 (5), 1278-1287 (2011).</li>
<li>Gommeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+serine+protease+regulates+positive+selection+of+a+subset+of+CD4%2B+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific serine protease regulates positive selection of a subset of CD4+ thymocytes.</a> Eur J Immunol. 39 (4), 956-964 (2009).</li>
<li>Viret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+serine+protease+contributes+to+the+diversification+of+the+functional+endogenous+CD4+T+cell+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific serine protease contributes to the diversification of the functional endogenous CD4 T cell receptor repertoire.</a> J Exp Med. 208 (1), 3-11 (2011).</li>
<li>Anderson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).</li>
<li>Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Aire.</a> Annu Rev Immunol. 27, 287-312 (2009).</li>
<li>Takaba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fezf2+orchestrates+a+thymic+program+of+self-antigen+expression+for+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fezf2 orchestrates a thymic program of self-antigen expression for immune tolerance.</a> Cell. 163 (4), 975-987 (2015).</li>
<li>Takaba, H., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+T+cell+selection+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of T cell selection in the thymus.</a> Trends Immunol. 38 (11), 805-816 (2017).</li>
<li>Lammers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ehf+and+Fezf2+regulate+late+medullary+thymic+epithelial+cell+and+thymic+tuft+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ehf and Fezf2 regulate late medullary thymic epithelial cell and thymic tuft cell development.</a> Front Immunol. 14, 1277365(2024).</li>
<li>Ushio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+diverse+thymic+medullary+epithelial+cells+interplay+to+direct+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Functionally diverse thymic medullary epithelial cells interplay to direct central tolerance.</a> Cell Rep. 43 (4), 114072(2024).</li>
<li>Kozai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+CCL21+in+establishment+of+central+self-tolerance+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Essential role of CCL21 in establishment of central self-tolerance in T cells.</a> J Exp Med. 214 (7), 1925-1935 (2017).</li>
<li>Lkhagvasuren, E., Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+%CE%B2+receptor+regulates+the+development+of+CCL21-expressing+subset+of+postnatal+medullary+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin β receptor regulates the development of CCL21-expressing subset of postnatal medullary thymic epithelial cells.</a> J Immunol. 190 (10), 5110-5117 (2013).</li>
<li>Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellularity+of+thymic+epithelial+cells+in+the+postnatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellularity of thymic epithelial cells in the postnatal mouse.</a> J Immunol. 200 (4), 1382-1388 (2018).</li>
<li>Hirakawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+parameters+of+the+developing+thymic+epithelium+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fundamental parameters of the developing thymic epithelium in the mouse.</a> Sci Rep. 8 (1), 11095(2018).</li>
<li>Venables, T., Griffith, A. V., DeAraujo, A., Petrie, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+epithelial+cell+morphology+control+thymic+organ+size+during+atrophy+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in epithelial cell morphology control thymic organ size during atrophy and regeneration.</a> Nat Commun. 10 (1), 4402(2019).</li>
<li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+nurse+cells+provide+microenvironment+for+secondary+T+cell+receptor+%CE%B1+rearrangement+in+cortical+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor α rearrangement in cortical thymocytes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (50), 20572-20577 (2012).</li>
<li>Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thymic+stromal+cell+populations+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 260 (1-2), 15-28 (2002).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).</li>
<li>Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+T+cell+maturation+on+defined+thymic+stromal+cell+populations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro.</a> J Exp Med. 176 (3), 845-853 (1992).</li>
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<li>Farr, A. G., Anderson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+heterogeneity+in+the+murine+thymus%3A+fucose-specific+lectins+bind+medullary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epithelial heterogeneity in the murine thymus: fucose-specific lectins bind medullary epithelial cells.</a> J Immunol. 134 (5), 2971-2977 (1985).</li>
<li>Wells, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+transient+ablation+and+single-cell+RNA-sequencing+reveals+the+development+of+medullary+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Combined transient ablation and single-cell RNA-sequencing reveals the development of medullary thymic epithelial cells.</a> eLife. 9, e60188(2020).</li>
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<li>Nishikawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+lineage+tracing+of+Aire-expressing+cells+reveals+a+requirement+for+Aire+in+their+maturation+program%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Temporal lineage tracing of Aire-expressing cells reveals a requirement for Aire in their maturation program.</a> J Immunol. 192 (6), 2585-2592 (2014).</li>
<li>Jenkinson, W. E., Rossi, S. W., Parnell, S. M., Jenkinson, E. J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFR+alpha-expressing+mesenchyme+regulates+thymus+growth+and+the+availability+of+intrathymic+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">PDGFR alpha-expressing mesenchyme regulates thymus growth and the availability of intrathymic niches.</a> Blood. 109 (3), 954-960 (2007).</li>
<li>Cosway, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+thymus+medulla+specialization+for+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Redefining thymus medulla specialization for central tolerance.</a> J Exp Med. 214 (11), 3183-3195 (2017).</li>
<li>Farr, A. G., Eisenhardt, D. J., Anderson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+thymic+epithelium+and+an+improved+method+for+its+propagation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine thymic epithelium and an improved method for its propagation in vitro.</a> Anat Rec. 216 (1), 85-94 (1986).</li>
<li>Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J., Anderson, G., Jenkinson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+both+cortical+and+Aire%2B+medullary+thymic+epithelial+compartments+from+CD205%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors.</a> Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).</li>
<li>Ohigashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+conversion+of+thymocyte-attracting+cells+into+self-antigen-displaying+cells+in+embryonic+thymus+medulla+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Developmental conversion of thymocyte-attracting cells into self-antigen-displaying cells in embryonic thymus medulla epithelium.</a> eLife. 12, RP92552(2024).</li>
</ol>

著者には利益相反はありません。

コラゲナーゼは、ディスパーゼの有無にかかわらず、マウス胸腺を消化してTECを調製するために広く使用されています4,5,9,18,21。コラゲナーゼを含むプロテアーゼのブレンドを含むリベラーゼは、胸腺を消化してTECを調製するためにも使用されます17,22。コラゲナーゼとリベラーゼを使用すると、マウス胸腺からのcTECとmTECの収量と品質が本質的に同等になりますが、酵素の製品バッチによってはわずかな違いが現れる場合があります。トリプシンは効率的な胸腺消化にも使用されますが21,23、TECによって発現するEpCAMおよびCD80を含む多くの細胞表面分子は、トリプシン消化の影響を受けやすいことが示されています21。胸腺の酵素消化のために、損傷した細胞からのDNA放出により粘度を下げるためにDNaseがしばしば添加されます17,21。
胸腺の酵素消化は、胸腺からTECを解放するために不可欠です。胸腺は、組織断片が見えなくなり、細胞懸濁液が均一に見えるまで十分に消化されるべきです。ただし、過度の酵素処理は細胞に損傷を与え、細胞の生存率を低下させるため、消化を長く放置しないでください。すべての実験において、胸腺消化中の潜伏期間とピペッティング強度に細心の注意を払うことが重要です。また、現在の酵素消化技術では、はじめに詳述されているように、および以前に報告されているように、TECのごく一部しか遊離できないことを認識することも重要です17,18,19。
TECは全胸腺細胞懸濁液ではまれであるため、全胸腺細胞懸濁液を使用したTECのフローサイトメトリー分析では、多くの細胞(通常、測定ごとに8×106 〜16×106 細胞)の染色が必要です。
酵素消化胸腺細胞に由来するTECは、抗CD45磁気ビーズ22 および/またはPercoll密度勾配遠心分離31を用いて濃縮してもよい。これらの濃縮手順は、特にTECをその後フローサイトメトリーセルソーターで精製する場合に時間を節約できます。また、抗CD45濃縮は、CD45発現胸腺細胞20 と密接に関連するTECの亜集団を除去し、Percoll遠心分離はTECの予期せず高密度の亜集団を除去する可能性があることにも注意する必要があります。
TECの固定については、PFA処理により細胞が縮小し、フローサイトメトリー解析において前方散乱強度が低下することが知られています。2%PFAを添加した直後に細胞を穏やかにピペッティングし、その後PBSを添加すると、過度の細胞収縮を防ぐのに役立つ可能性があります。
フローサイトメトリー分析では、胸腺内でTECがまれに発生することを考えると、胸腺細胞や脾細胞と比較してTECの描写には異なるアプローチが必要です。最初の分類は、胸腺細胞および樹状細胞やマクロファージを含む他の造血細胞に遍在する造血パンマーカーであるCD45の利用に基づいています。逆に、TECは造血起源ではないため、CD45発現が欠けています。代わりに、TECは表面にEpCAMを発現するため、CD45陰性とEpCAM陽性の簡単なゲーティング戦略でTECを識別できます。フローサイトメトリー分析では、この集団を定義することから始め、TECと胸腺細胞の間の大きなサイズの不一致、およびTECのサイズと高い自家蛍光を考慮して、前方および側面散乱パラメーターの適切なスケーリングを確保します。
その後、CD45 陰性の EPCAM 陽性集団内の cTEC マーカーおよび mTEC マーカーの評価に注意が向けられます。この集団のサイズが小さいため、このステップは cTEC と mTEC を補償するために不可欠になります。全染色パネル(例えば、cTECマーカーLy51およびmTECマーカーUEA-1、およびTECを定義するCD45およびEpCAM)の検査により、散乱スケーリングの妥当性がさらに保証されます。フローサイトメトリーのセットアップでは、私たちの主な目的は、各抗体の陽性集団と陰性集団を識別することです。
Aire、beta5t、およびCCL21の共染色では、TECサブセット内の異なる集団が同定されます。mTECによるAireの選択的発現を考慮して、CD45陰性/EPCAM陽性/UEA-1陽性/Ly51陰性細胞の4色染色に焦点を当てます。ここでは、UEA-1陽性細胞を利用してAireの陰性対照を確立し、Aire陽性細胞の明確な同定を容易にします。同様のアプローチが CCL21 にも採用されており、mTEC 内で発現します。逆に、cTECのみで発現するβ5tについては、β5tのバックグラウンドレベルを確認するために、4色染色内のLy51陽性細胞に重点を置いた同等のゲーティング戦略が適用されます。抗β5tで染色されたサンプルのその後の分析は、陽性集団の同定を容易にします。
抗ベータ5t抗体と抗CCL21抗体はウサギ抗体であるため、これらの抗体は事前の蛍光標識なしに混合しないでください。抗体の作業濃度は、抗体の連続希釈液で染色した対照細胞(例えば、野生型マウスおよびノックアウトマウスのTECs)のフローサイトメトリー分析を行うことによって事前に決定する必要があります。
フローサイトメトリー解析では、cTECおよびmTECは、cTECの場合はLy51またはCD205、mTECの場合はUEA1およびCD80の細胞表面発現によって定義されることがよくあります。ただし、cTEC と mTEC は、最終的に胸腺における微細解剖学的局在によって定義されなければならないことに留意する必要があります。胚性胸腺では、Ly51およびCD205の発現がcTECに限定されず、cTEC/mTECバイポテント前駆細胞や未熟mTECを含むTECの他の集団にまで及ぶことが新たな証拠が示唆されています32,33。さらに、cTECにおけるLy51の発現は、図1および図2にも示されているように、出生後33と比較して、胚形成および周産期の間は低いままです。
結論として、酵素的に遊離されたTECの単一細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析は、TECの遊離効率が限られているにもかかわらず、TECおよびその亜集団を単一細胞分解能で定量分析するための強力な技術を提供します。特に、シングルセルTEC懸濁液中の細胞内分子のフローサイトメトリー分析は、TECとその亜集団の発生と機能に重要なさまざまな分子の発現を研究するのに役立ちます。

胸腺は、Tリンパ球の発達とレパトア選択を促進する上皮間葉系器官です。胸腺内の皮質および髄質微小環境では、胸腺上皮細胞(TEC)がT細胞の発生と選択を指示する上で重要な役割を果たします。胸腺皮質の皮質TEC(cTEC)は、主に初期のT細胞発生の誘導と、新たに生成されたT細胞抗原受容体(TCR)発現胸腺細胞の正の選択に寄与していることは広く認められています。対照的に、胸腺髄質の髄質TEC(mTEC)は、自己反応性T細胞を排除し、制御性T細胞を生成することにより、皮質から正に選択された胸腺細胞を引き付け、中枢自己寛容を確立するために不可欠です1,2。T細胞の発生と選択をサポートするTECのこれらの機能は、cTECおよびmTECで発現するさまざまな分子を介して媒介されます。
これらには、リンパ系前駆細胞のT細胞系統指定に重要なデルタ様リガンド4(DLL4)が含まれます)3,4、beta5t(Psmb11とも呼ばれ、CD8 T細胞の正の選択に重要)5,6、およびPrss16(胸腺特異的セリンプロテアーゼ、またはTSSP、CD4 T細胞の正の選択に重要)7、8はcTECで発現し、自己免疫調節因子(Aire、自己遺伝子の無差別発現に重要)9,10、フェズファミリージンクフィンガー2(Fezf2、Aire非依存性自己遺伝子の無差別発現と胸腺房細胞の生成に重要)11,12,13,14、およびC-Cモチーフケモカインリガンド21(CCL21、髄質遊走および正に選択された胸腺細胞の蓄積に重要)14,15,16はmTECで表されます。フローサイトメトリーは、TEC中のこれらの機能的に重要な分子を定量的に検出する手段を提供し、cTECおよびmTECの発生と機能の両方の評価を容易にします。TECsの分子の多くは、細胞質(例:プロテアソーム成分β5t)や核(例:転写調節因子Aire)など、主に細胞内で発現しているため、フローサイトメトリーを用いてcTECsやmTECsの細胞内分子を定量的に解析することは有利です。
TECは胸腺ではまれです。生後5週齢の雌マウスには、約1×106 cTECと約2.5 × 106 mTECがありますが、胸腺皮質には約3 ×10 8 CD4 + CD8 +胸腺細胞が含まれ、胸腺髄質には約5 × 107 CD4 + CD8-およびCD4-CD8 +胸腺細胞が含まれています17.したがって、胸腺の細胞の大部分(>99%)は、若年成人マウスのTECではなく、胸腺細胞を含む造血細胞です。さらに、TECは胸腺内の隣接する細胞(胸腺細胞など)や構造的な細胞外成分(コラーゲンなど)と密接に関連しているため、TECの細胞懸濁液への遊離には胸腺のプロテアーゼ消化が必要です。従来の酵素消化法では、TECのごく一部しか得られません。生後5週間齢のマウス胸腺から、それぞれcTECおよびmTECで約1%(1×104)および10%(2×105)17,18,19。胸腺からのTECの遊離効率が低いのは、TECがタンパク質分解酵素や機械的ストレスに感受性を持っていること、およびTECと隣接細胞、特にcTECとCD4+CD8+胸腺細胞20との間の密接な関連によるものと考えられます。この点、現在の酵素消化を介した細胞調製法に基づくフローサイトメトリー解析やシングルセルRNAシーケンシング解析など、マウスTECのシングルセル解析の結果は、TECのごく一部を代表しているに過ぎず、網羅的とは言い難いものです。それにもかかわらず、TECの酵素賦活化におけるこのような制限にもかかわらず、シングルセル懸濁液中のマウスTECのフローサイトメトリー解析は、cTECおよびmTEC中の機能的に重要な分子の定量解析に依然として有用です。細胞懸濁液では、TECは上皮表面分子EpCAM陽性(CD326)および造血表面分子CD45陰性細胞と定義されています。EpCAM+CD45-TECs内では、Ly51分子(BP-1およびCD249としても知られる)およびUlex Europaeus 凝集素I(UEA1)結合能(主に糖タンパク質およびα結合フコースを含む糖脂質に結合する)の細胞表面発現レベルを使用して、cTEC(Ly51高UEA1低)およびmTEC(Ly51低UEA1高)を表現型的にマーキングしています).ここでは、マウスTECのシングルセル懸濁液の従来の調製とフローサイトメトリー解析のための細胞内分子の染色に関する実験プロトコルについて、新たに調製したマウスTECにおける細胞内分子β5t、CCL21、Aireの定量解析に焦点を当てています。

<table><tbody><tr><td>コラゲナーゼ/ディスパーゼ&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>11097113001</td><td></td></tr><tr><td>リベラーゼ TM</td><td>ロシュ</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 / 転写因子染色バッファーセット</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>ゴースト染料 バイオレット 510&nbsp;</td><td>とんぼ</td><td>13-0870-T500</td><td></td></tr><tr><td>BV421 抗マウス CD45 モノクローナル抗体, Clone 30-F11</td><td>BD Horizon</td><td>563890</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 抗マウス Ly51 モノクローナル抗体, Clone 6C3</td><td>BioLegend</td><td>108312</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 抗マウス EpCAM/CD326 モノクローナル抗体, Clone G8.8</td><td>BioLegend</td><td>118216</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)</td><td>ベクターLaboratories</td><td>DL-1067-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗マウス Aire モノクローナル抗体, Clone 5H12</td><td>eBioscience</td><td>53-5934-82</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス Psmb11/beta5t ウサギモノクローナル抗体, Clone CPTC-PSMB11(マウス)-1</td><td>NIH NCI</td><td>CPTC-PSMB11(マウス)-1</td><td>https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal</td></tr><tr><td>抗マウス CCL21/exodus 2 ウサギポリクローナル抗体</td><td>Bio-Rad</td><td>AAM27</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 抗ウサギ IgG 重鎖ヤギ組換え抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A27039</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス CD32/CD16;精製された(FCブロック抗体)</td><td>Leinco Technologies</td><td>C247</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ 60ミクロン</td><td>コンポーネント供給</td><td>W31436</td><td></td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>エッペンドルフ</td><td>ヒートブロック</td><td></td></tr><tr><td>セロメーター オート2000 細胞生存率カウンター</td><td>Nexcelom</td><td>生存細胞計数</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa セルアナライザー</td><td>BDBiosciences</td><td>Flow cytometer</td><td>5つのレーザー(355、408、488、595、および637 nm)</td></tr><tr><td>FACSDivaソフトウェアバージョン9.0.1</td><td>BD Biosciencesフロー</td><td>サイトメトリー分析</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.9.0</td><td>BD Biosciences</td><td>フローサイトメトリーデータ分析</td><td></td></tr><tr><td>抗体</td><td>希釈率(使用濃度)</td><td>希釈バッファー抗</td><td></td></tr><tr><td>マウスCD32 / CD16 &ndash;精製済み (Fc Block Antibody)</td><td>1:40</td><td>FACS Buffer</td><td></td></tr><tr><td>BV421 anti-mouse CD45 monoclonal antibody</td><td>1:25</td><td>FACS Buffer</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-mouse EpCAM/CD326 monoclonal antibody</td><td>1:100</td><td>FACS Buffer</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly51 モノクローナル抗体</td><td>1:100</td><td>FACS Buffer</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)</td><td>1:400</td><td>FACS Buffer</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CCL21/exodus 2 rabbit polyclonal antibody</td><td>1:200</td><td>1x Permeabilization Buffer</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Psmb11/beta5t rabbit monoclonal antibody, Clone CPTC-PSMB11(mouse)-1</td><td>1:1000</td><td>1x Permeabilization Buffer</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anti-rabbit IgG heavy chain goat recombinant antibody</td><td>1:400</td><td>1x Permeabilization Buffer</td><td></td></tr><tr><td>Buffer</td><td>目的</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 10 mM HEPESを含む&nbsp;</td><td>細胞調製</td><td></td><td></td>用</tr><tr><td>RPMI1640 2% FBS含有</td><td>細胞調製</td><td></td><td></td></tr>用<tr><td>FACSバッファー(1% BSA含有1x HBSS&nbsp;および0.1%アジ化ナトリウム)</td><td>細胞調製および抗体染色</td><td></td><td></td>用</tr><tr><td>2% FBSを含むRPMI1640中の1 mg/mlコラゲナーゼ/ディスパーゼおよび1U/ml DNase溶液</td><td>酵素消化</td><td></td><td></td>用</tr><tr><td>PBS中の2% PFA</td><td>細胞固定</td><td></td><td></td>用</tr><tr><td>固定/透過化緩衝液(1部の固定/透過化濃縮液と3部の固定/透過希釈液)</td><td>細胞固定用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x 透過化バッファー (10倍濃縮液 1 部と蒸留水 9 部)</td><td>細胞間抗体染色用&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス胸腺上皮細胞のシングルセル懸濁液の調製とフローサイトメトリー解析のための細胞内分子の染色

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis

胸腺上皮細胞(TEC)は、T細胞の発生とレパトア選択を促進する上で重要な役割を果たします。胸腺皮質の皮質TEC(cTEC)は、初期のT細胞の発生と皮質胸腺細胞の正の選択を誘導します。対照的に、胸腺髄質の髄質TEC(mTEC)は、皮質から正に選択された胸腺細胞を引き付け、T細胞の自己寛容を確立します。cTECで発現するDLL4やβ5t、mTECで発現するAireやCCL21など、さまざまな分子がT細胞の発生と選択をサポートする胸腺の機能に寄与しています。現在の方法では、TECのシングルセル懸濁液を調製するための現在の方法では、若年成体のマウス胸腺からTECのごく一部(cTECで約1%、mTECで約10%)しか回収できませんが、cTECおよびmTECの機能的に関連する分子のフローサイトメトリー解析は、TECの生物学の理解を深めるのに役立ちます。TECのこれらの機能的に関連性のある分子の多くは細胞内に局在しているため、マウスTECのシングルセル懸濁液の調製とフローサイトメトリー分析のための細胞内分子の染色に関するプロトコルについて説明します。

この解析には、前方散乱光および側方散乱光パラメータに加えて、少なくとも6つの蛍光チャネル（CD45、EpCAM、Ly51、UEA1、Ghost Dye、およびbeta5t、CCL21、および/またはAire用）の検出が可能なフローサイトメーターが必要です。0日齢および2週齢のマウスからCollagenase/Dispaseで消化した胸腺細胞の代表的なフローサイトメトリープロファイルを、それぞれ図1および図2に示します。両図のパネルAのドットプロットは、全粒子信号の前方散乱光（FSC）強度とGhost Dye Violet 510の蛍光強度を示しています。Ghost Dye試薬による陰性染色および細胞サイズを反映する前方散乱光による判定により、粒子信号の90%以上が生細胞であることがわかります。パネルBは、造血細胞に発現する分子であるCD45と、上皮細胞に発現する分子であるEpCAMの、生存している胸腺細胞の細胞表面蛍光信号を示しています。少なではありますが、CD45- EpCAM+という特徴的な細胞集団が存在し、これがTECを表しています。
<img alt="フローサイトメトリー解析、EpCAM-PE-Cy7、CD45-BV421、細胞集団、cTEC、mTEC、データの可視化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66945/66945fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="図 1"> 
図 1: 0日齢の野生型C57BL/6背景マウスからCollagenase/Dispaseで消化した胸腺細胞の代表的なフローサイトメトリープロファイル。 (A) 全粒子シグナルの前方散乱光強度（Forward scatter intensity）およびGhost Dye Violet 510蛍光強度。赤色の枠は生存細胞のシグナルを示す。 (B) 生存細胞（パネルAの赤色枠）におけるCD45およびEpCAMの蛍光シグナル。赤色の枠はCD45- EpCAM+ TECsを示す。 (C) TECs（パネルBの赤色枠）におけるLy51およびUEA1の細胞表面染色シグナルにより、2つの主要な集団、すなわちcTECsが富化したLy51high UEA1low 細胞と、mTECsが富化したLy51low UEA1high 細胞が認められる。 (D-F) パネルCで定義されたcTECs（上段パネル）およびmTECs（下段パネル）における(D) beta5t、(E) CCL21、および(F) Aireの検出。グレーのヒストグラムは、(D,E) 二次抗体のみで染色したコントロールプロファイル、および(F) Aire欠損マウス由来の細胞を用いて染色したプロファイルを示す。略語：FSC = 前方散乱光（forward scatter）；TECs = 胸腺上皮細胞（Thymic epithelial cells）；cTECs = 皮質TEC（cortical TECs）；mTECs = 髄質TEC（medullary TECs）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66945/66945fig01large.jpg" target="_blank">こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
<img alt="フローサイトメトリー解析、TEC細胞のゲーティング、CD45-BV421、EpCAM-PE-Cy7、散布図、ヒストグラム。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66945/66945fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="図 2"> 
図 2: 2週齢の野生型C57BL/6背景マウスからCollagenase/Dispaseで消化した胸腺細胞の代表的なフローサイトメトリープロファイル。 (A) 全粒子信号の前方散乱光強度およびGhost Dye Violet 510蛍光強度。赤色の枠は生存細胞の信号を示す。 (B) 生存細胞（パネルAの赤枠）におけるCD45およびEpCAMの蛍光信号。赤色の枠はCD45- EpCAM+ TECを示す。 (C) TEC（パネルBの赤枠）におけるLy51およびUEA1の細胞表面染色信号により、cTECが濃縮されたLy51high UEA1low 細胞と、mTECが濃縮されたLy51low UEA1high 細胞の2つの主要な集団が示されている。 (D-F) パネルCで定義されたcTEC（上段パネル）およびmTEC（下段パネル）における(D) beta5t、(E) CCL21、および(F) Aireの検出。グレーのヒストグラムは、(D,E) 二次抗体のみで染色したもの、および(F) FITC標識アイソタイプコントロールIgGで染色したコントロールプロファイルを示す。略語：FSC = 前方散乱光; TECs = 胸腺上皮細胞; cTECs = 皮質TEC; mTECs = 髄質TEC; FITC = フルオレセインイソチシアネート。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66945/66945fig02large.jpg" target="_blank">こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
パネル C に示す Ly51 および UEA1 の細胞表面染色のシグナルから、TEC には2つの主要な集団が存在することがわかります。すなわち、Ly51 が比較的高く UEA1 が低い cTEC に富む集団と、Ly51 が比較的低く UEA1 が高い mTEC に富む集団です21,22,23,24,25。生後0日目を含む胚および新生児期では、cTEC の頻度が mTEC よりも高くなります。出生後の段階では、主に cTEC の胸腺からの回収効率が極めて低くなるため（単一細胞懸濁液として回収できるのは cTEC の約 1% および mTEC の 10% である）、mTEC の頻度が支配的になります17。
細胞の固定と透過処理を行うことで、TEC内部の細胞内分子の検出が可能になります。パネルDは、cTECの大部分で検出されたbeta5tの発現を示しており、mTECでは検出されていません。パネルEは、mTECの一部で検出されたCCL21を示しており、cTECでは検出されていません。また、パネルFは、mTECのサブポピュレーションで発現しているAireを示しています。
マウスTECにおける細胞内分子の追加のフローサイトメトリープロファイルは、既報の論文で確認できます。例えば、beta5t6,20、CCL2114,16,26、Aire27,28のほか、keratin22,29やFezf211,30を含むその他の細胞内分子に関するデータが公開されています。

マウス胸腺上皮細胞の単一細胞懸濁液の調製とフローサイトメトリー分析のための細胞内分子の染色のためのプロトコルについて説明します。

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