マウス胸腺上皮細胞のシングルセル懸濁液の調製とフローサイトメトリー解析のための細胞内分子の染色

T細胞は、感染症やがんから私たちの体を守る免疫細胞です。胸腺はT細胞を産生する器官であり、体の自己成分に応じて発生中のT細胞を選択します。私たちは、胸腺が私たちの体を保護しながらも体に耐性のあるT細胞をどのように生成し、選択するかに興味があります。

当研究室では、胸腺におけるT細胞の産生と選択に重要な役割を果たす胸腺上皮細胞の解析に貢献してきました。胸腺上皮細胞のシングルセルレベル解析は、T細胞の発生と選択の分子メカニズムをより深く理解するのに役立ちました。胸腺上皮細胞は非常に多様で、複雑な構造を持っているため、その分離は困難です。

シングルセル懸濁液を単離する現在の技術は限られており、改善が必要です。それでも、胸腺上皮細胞のシングルセル単離は、その発生と機能に関与する分子機構の理解を深めます。本研究が免疫細胞の生成と再生の理解に貢献できることを願っています。

私たちは、それが人間の健康を増進するための重要な礎石として役立つと信じています。マウスから胸腺を採取した後、氷上の60ミリメートルのプラスチック皿に10ミリのHEPESを含む5ミリリットルのRPMI 1640に入れます。解剖顕微鏡下で、湾曲した細い先端のピンセットを使用して、血液、胸腺以外の組織、および脂肪組織を除去します。

胸腺を解剖ハサミで細かく切ります。胸腺片を、1ミリリットルあたり1ミリグラムのコラゲナーゼとディスパーゼ、および2%FBSを含むRPMI 1640の1ミリリットルあたり1ユニットのDNaseを含む15ミリリットルのチューブに移します。チューブを摂氏37度の水浴中で20分間インキュベートします。

次に、3ミリリットルのプラスチック製トランスファーピペットを使用して懸濁液を混合し、約30分間、または組織片が見えなくなるまでインキュベートを続けます。1%FBSを含むHBSSに5ミリリットルの5ミリモルEDTAを追加します。.細胞懸濁液を60ミクロンのナイロンメッシュでろ過し、新しい50ミリリットルのチューブに入れます。

懸濁液を350Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、ペレットを10ミリリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。セルを氷上に保存し、セルカウンターを使用してセル番号を決定します。新生児マウスから胸腺を採取した後、湾曲した細い先端のピンセットを使用して、血液、胸腺以外の組織、および脂肪組織を切除します。

胸腺を、10ミリモルのHEPESを含む0.2ミリリットルのRPMI 1640を含む1.5ミリリットルのチューブに移します。200マイクロリットルのピペットを使用して培地を廃棄し、次に0.5ミリリットル/ミリグラム/ミリグラムのコラゲナーゼおよびディスパーゼを0.5ミリリットル加え、2%FBSを含むRPMI 1640に1ミリリットルのDNA酵素を1ユニット加えます。チューブを摂氏37度のヒートブロックでインキュベートします。

インキュベーション中は、1ミリリットルのピペットを使用して穏やかに混合します。10分後、1%FBSを含むHBSSに0.5ミリリットルの5ミリモルEDTAを加えます。細胞懸濁液を60ミクロンのナイロンメッシュでろ過し、新しい15ミリリットルの円錐管に入れます。

10ミリモルHEPESを含む9ミリリットルのRPMI 1640をチューブに加えます。細胞懸濁液を350Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、ペレットを1〜3ミリリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。セルを氷上に保存し、セルカウンターを使用してセル番号を決定します。

まず、5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに、新生児または出生後のマウス胸腺細胞6個の累乗に10の16倍を加えます。細胞懸濁液を350Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞ペレットをFACS緩衝液中の抗FC受容体モノクローナル抗体の10マイクロリットルの作業濃度に再懸濁します。

チューブを摂氏4度で5分間インキュベートします。抗CD45モノクローナル抗体、抗EpCAMモノクローナル抗体、抗Ly-51モノクローナル抗体、およびUEA-1をそれぞれ40マイクロリットルをFACSバッファーに加えます。チューブの内容物を混合し、摂氏4度で45分間インキュベートします。

インキュベーション後、2ミリリットルのFACSバッファーを添加する。細胞懸濁液を350Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、ペレットを1マイクロリットルのGhost Dye violet 510溶液に再懸濁します。チューブの内容物を混合し、摂氏4度で30分間インキュベートします。

次に、2ミリリットルのFACSバッファーを添加し、細胞懸濁液を遠心分離してから、1ミリリットルの2%パラフォームアルデヒドで室温で10分間細胞を固定します。チューブに3.5ミリリットルのPBSを追加します。細胞懸濁液を700Gで摂氏4度で8分間遠心分離し、1ミリリットルの細胞内固定および透過化緩衝液で細胞を透過処理します。

チューブの内容物を混合し、摂氏4度で20分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞懸濁液を遠心分離し、1ミリリットルの透過処理バッファーを添加します。再度、懸濁液を遠心分離してから、抗β5t抗体または抗CCL21抗体の使用濃度をそれぞれ100マイクロリットル加えます。

室温で60分間インキュベートします。1ミリリットルの透過処理バッファーを添加し、細胞懸濁液を700Gで4°Cで8分間遠心分離します。次に、100マイクロリットルの作業濃度の抗ウサギIgGを加え、室温で30分間インキュベートします。

透過化バッファーを添加した後、細胞懸濁液を遠心分離します。細胞ペレットを200マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁し、よく混合します。フローサイトメトリー解析の前に、60ミクロンのナイロンメッシュで細胞懸濁液をろ過します。

0日齢マウスおよび2週齢マウスのコラゲナーゼおよびディスパーゼ消化胸腺細胞のフローサイトメトリープロファイルにより、粒子シグナルの90%以上が生存細胞であることが示されました。生細胞の蛍光シグナルは、CD45およびEpCAMによって表されました。新生児期では、cTECはmTECよりも頻度が高かったが、出生後はcTECの遊離効率が低かったため、mTECが優勢であった。

細胞の固定と透過化により、TEC内の細胞内分子の検出が可能になります。Beta5tの発現は、大多数のcTECで検出されましたが、mTECでは検出されませんでした。CCL21はmTECの一部で検出されましたが、cTECでは検出されませんでした。

これに対し、空気はmTECの亜集団で発現されました。