Name: マウス網膜神経節細胞のホールマウント免疫染色および自動計数(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 学ぶマウス網膜ホールマウント免疫染色とAI自動計数法。緑内障研究における網膜神経節細胞の迅速かつ正確な定量化を可能にし、治療評価の効率化に貢献します。

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<meta charset="utf8"></head><body>マウスホールマウント網膜におけるRGCの免疫染色とAIベースのカウント

<ol><li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li>
<li>Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial-ethnic+disparities+in+concurrent+rates+of+peripapillary+%26+macular+OCT+parameters+among+a+large+glaucomatous+clinical+population%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population.</a> Eye. , (2024).</li>
<li>Atkinson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+measure+of+patient+satisfaction+with+ocular+hypotensive+medications%3A+the+Treatment+Satisfaction+Survey+for+Intraocular+Pressure+%28TSS-IOP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Qual+Life+Outcomes%22%5BJournal%5D)">A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP).</a> Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mouse-fixation+device+for+IOP+measurement+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice.</a> Vision Res. 219, 108397(2024).</li>
<li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+counting+of+retinal+ganglion+cells+in+the+entire+mouse+retina+based+on+improved+YOLOv5%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Res%22%5BJournal%5D)">Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5.</a> Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).</li>
<li>Al-Khindi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Tbx5+regulates+direction-selective+retinal+ganglion+cell+development+and+image+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization.</a> Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).</li>
<li>Claes, M., Moons, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cells%3A+Global+number%2C+density+and+vulnerability+to+glaucomatous+injury+in+common+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice.</a> Cells. 11 (17), 2689(2022).</li>
<li>Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-based+whole-mount+preparation+for+the+investigation+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (194), e65222(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1&times;PBS</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa594-conjugated ヤギ抗ウサギIgG&nbsp;(H+L)</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>抗BRN3A抗体 [EPR23257-285]</td><td>Abcam</td><td>ab245230</td><td></td></tr><tr><td>AutoCountソフトウェア</td><td></td><td></td><td>https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs</td></tr><tr><td>クラウドディスク</td><td>Googleドライブ リンク</td><td></td><td>https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6&nbsp;</td></tr><tr><td>クラウドディスク</td><td>Baiduリンク</td><td>抽出コード:g44k</td><td>https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg&nbsp;</td></tr><tr><td>マーカー</td><td>シャーピー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ノーマルロバ血清</td><td>バイオシャープ、ラボジック</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒドマッ</td><td>クリン</td><td>P804536</td><td></td></tr><tr><td>ProClean 300</td><td>Beyotime</td><td>ST853</td><td></td></tr>ショ<tr><td>糖</td><td>BBI、サンゴン</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td>バイオ<td>フロックス、neoFroxx</td><td>1139ML100</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス網膜神経節細胞のホールマウント免疫染色および自動計数(英語)

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells

このプロトコールでは、マウス網膜のホールマウント免疫染色の方法論を詳しく説明し、綿密な組織調製、正確な抗体インキュベーション、信頼性の高い自動細胞カウントを保証します。この手順により、網膜神経節細胞(RGC)の堅牢な標識と定量が容易になり、さまざまな実験状況での細胞集団の正確な評価が可能になります。この方法は、野生型および緑内障モデルマウスのRGCをカウントするために使用され、一貫した結果が得られました。代表的な結果から、生後2ヶ月の時点での正常な成体マウスのRGC数は約45,000であることが示されています(図6)。
AIソフトウェアが正常モデルと疾患モデルでBRN3a標識RGCを正確に定量できるかどうかを評価するために、緑内障7のN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)誘導マウスモデルを生成しました。このモデルのホールマウント網膜を抗BRN3Aで免疫染色し、自動計数ソフトウェアを使用してRGCを定量しました。その結果、バックグラウンド染色が比較的高いことが示されました(図7)。それにもかかわらず、ソフトウェアはほぼすべてのRGCを正確に識別することができました。この網膜では合計15,231個のRGCが同定されましたが、正常なマウス網膜では約45,000〜50,000個のRGCが同定され、重度の変性を示しています。したがって、AIソフトウェアは、最適な染色品質が低い網膜のRGCをカウントするためにも効果的に使用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig01.jpg"> 図1:RGC準備の概略図。 (A)眼球を取り出し、1x PBSに入れます。(B)眼球を氷上で4%PFAに3時間固定します。(D)レンズの抽出。(E)アイカップはハサミで4つのフラップに分割します。(F)強膜を剥がし、柔らかいブラシで網膜表面から破片をやさしく取り除きます。(G)網膜は抗BRN3Aで免疫標識されています。(H)蛍光シグナルは、共焦点顕微鏡を使用してイメージングされます。(I) RGCの自動カウント <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig02v3.jpg"> 図2:ホールマウントマウス網膜の分離 (A)マウスは頸部脱臼により安楽死させられる。(B)マウスを平らな面に置きます。(C)ハサミで眼球を丁寧に取り除きます。(D)眼球を1x PBSにそっと置きます。(E)眼球は角膜の縁に鉗子で固定されています。(F)角膜の端に針で小さな切開を行います。(G)角膜を取り外した後、ボウル状の構造を取り除きます。(H)レンズは鉗子で慎重に取り外します。(I)網膜の損傷を避けるために、角膜の縁に沿って強膜の視神経に向かって小さな切開が行われます。(J)強膜は、鉗子で切開部に沿って引き裂かれます。(K)網膜を平らにし、絵筆でクリーニングします。(L)網膜を平らにし、氷冷したメタノールで急速に固定します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig03.jpg"> 図3:ホールマウントマウス網膜の免疫染色 (A)1x PBSで洗浄した後、網膜をブロッキングバッファーでブロックします。(B)網膜を一次抗体と4°Cで一晩インキュベートします。(C)網膜を1x PBSで3回洗浄します。(D)網膜を二次抗体と室温で2時間インキュベートします。(E)網膜は、RGCが上を向いたスライドガラスに取り付けられています。(F)画像はレーザー共焦点顕微鏡を使用して取得されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig04.jpg"> 図4:自動カウントソフトウェアのインストール。 (A) ステップ 1 では、ファイルパスを "yolov5_cpu" ディレクトリに更新します。(B)グラフィカルインターフェースが起動します。(C) ドライブ C のルート ディレクトリにモデル ファイルが存在することを確認します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig05.jpg"> 図5:自動RGCカウントソフトウェアの操作 (A)カウントソフトウェアが開いた状態。(B)[ 画像を開く ]ボタンをクリックして、画像をインポートします。(C) RUN ボタンをクリックすると、自動カウントが開始されます。(D)カウントされたセルは赤い四角いボックスでマークされ、セル番号は右上隅に表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig06.jpg"> 図6:マウスRGCの自動カウント。 トップパネル(左)は、抗BRN3Aで免疫染色したフラットマウント網膜の代表的な結果を示しています。トップパネル(右)は、以前に開発されたソフトウェアによるRGCの自動カウントを示しています。スケールバー:100μm。上部パネルからの挿入図は拡大され、それぞれ下部パネルに表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig07.jpg"> 図7:NMDA誘導緑内障マウスモデルにおけるRGCカウント。 左パネル:AIソフトウェアによって認識されたRGCを示すホールマウントRetinaの概要。右パネル:網膜の一部を拡大した画像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Glaucoma is a leading cause of blindness globally, characterized by a complex pathogenic mechanism that makes vision restoration challenging. Mice serve ...

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、フローサイトメトリーを使用してマウスの初代網膜神経節細胞(RGC)を単離する手順を示しています。この方法は、神経変性疾患における機能的なRGCの喪失に起因する視力の大幅な低下をよりよく理解することを目標に、RGCの将来の研究を可能にします。...

蛍光活性化細胞選別を用いたマウス網膜神経節細胞の単離

出典:Lani-Louzada, R., et al. げっ歯類の外科的に誘発された緑内障に対する大脳辺縁血管神経叢の全円焼灼。J. Vis. Exp.

焼灼誘発性眼圧亢進症後の網膜神経節細胞体腫の定量化

出典:Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (2021).このビデオでは、2光子顕微鏡を用いたin vivo網膜イメージングの技術を紹介しています。麻酔マウスは、頭部を固定し、眼の潤滑剤を塗布し、眼にカバースリップを貼ることでイメージングの準備をします。蛍光タンパク質を発現する網膜神経節細胞(RGC)は、まず落射蛍光を用いてアラインメントして可視化します。最後に、2光子イメージングが採用されており、RGCの高解像度の視覚化が可能です。...

マウス網膜のTwo-Photon In Vivoイメージング

Source：&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'&gt;Laboissonniere,  et. al.網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-seq. J. Vis. Exp. (2017).

蛍光トレーシングによるマウス網膜神経節細胞サブタイプの同定

新生児マウスの網膜は血管新生を調節する別の遺伝子や薬剤の役割の調査を可能にし、血管新生のよく特徴付け生理学的モデルを提供...

血管新生を調査するために新生児マウス網膜の全体のマウント免疫蛍光染色<em生体内で&gt;</em

免疫組織化学プロトコルは、網膜中の特定のタンパク質の局在化を研究するために使用される。カルシウムイメージング技術は、網膜神経節細胞および軸索のカルシウム動態を研究するために使用される。...

ホールマウントラット網膜における免疫組織化学的およびカルシウムイメージング法

何百万人もの人々が不可逆的な失明をもたらす網膜変性疾患に苦しんでいます。これらの疾患の多くの共通要素は、網膜神経節細胞（RGC）の喪失である。この詳細なプロトコールは、フローサイトメトリーによる陽性および陰性選択による原発性ネズミRGCの単離を記載する。...

フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離

この記事では、実装網膜製剤全体に対する確立された再現性のあるレクチン染色アッセイと、増殖性および不拡散性網膜症において頻繁に変化する血管パラメータの定量的測定に必要なプロトコルについて説明する。...

不拡散性網膜症を有するマウスの全型網膜における血管パラメータの定量化

この原稿は、げっ歯類の眼球からのスライドの組織学的調製のためのプロトコルを提示します。提案手法により、内側の網膜を光学顕微鏡で容易に可視化し、評価することができる。この手順は、マウスとラットの眼球に提示されます。...

網膜を評価するためのラットおよびマウス眼球の組織学的スライドの調製と分析

網膜は、その層状構造全体で複雑な空間構成を示します。最新の空間トランスクリプトミクスおよびシーケンシング技術では、厚さ20μm&lt;組織切片が必要であり、網膜研究の適用性は限られています。この新鮮凍結凍結切片法は、平面的な空間的関係を維持しながら、マウス網膜の薄い 顔...

顔面 高次元空間分子解析のためのマウス網膜の凍結切片

学ぶマウス網膜ホールマウント免疫染色とAI自動計数法。緑内障研究における網膜神経節細胞の迅速かつ正確な定量化を可能にし、治療評価の効率化に貢献します。

マウス網膜神経節細胞のホールマウント免疫染色および自動計数(英語)

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