酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学
2024年11月29日
このプロトコールは、目的の抗原に結合するタンパク質変異体を濃縮するための酵母表面ディスプレイ選択キャンペーンを実施するための重要なステップを説明しています。
私の研究室では、タンパク質工学と細胞工学を組み合わせ、次世代の細胞治療を行っています。そこで、新しい機能を獲得したり、既存の機能を改良したりするためにタンパク質成分を操作し、これらのヌルタンパク質を細胞治療薬に組み込みます。私たちはさらに、タンパク質安定性工学、低分子制御タンパク質スイッチのエンジニアリング、がん関連活性化受容体の特異的標的化確認など、特殊なアプリケーションのための使用表面ディスプレイを開発しました。
ファージやリボソームディスプレイなどの他のディスプレイ技術と比較した酵母表面ディスプレイの利点は、ソーティングプロセス中のライブラリのフローサイトメトリー可視化と、抗原濃度やソーティングゲートのストリンジェンシーなどの選択条件の正確な制御です。まず、10マイクロリットルのビオチンバインダー磁気ビーズを990マイクロリットルのPBSAに再懸濁することにより、最初のビーズ選択用のビーズを準備します。洗浄するには、蓋を開けた状態でチューブを磁気ラックに2分間置きます。
次に、上清を慎重に取り除きます。洗浄したビーズを、6.7〜33ピコモルのビオチン化抗原を含むPBSA1ミリリットルの1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに再懸濁します。インキュベーション後、チューブを蓋を開けた状態で磁気ラックに2分間置き、上清を取り除き、抗原を充填したビーズを1ミリリットルのPBSAで洗浄します。
ビーズが落ち着いたら、PBSAを取り外します。次に、抗原をロードしたビーズを50マイクロリットルのPBSAに再懸濁します。ネガティブセレクション用の細胞、抗原ビーズ、およびベアビーズの溶液を調製します。
洗浄後、抗原ビーズを50マイクロリットルのPBSAに再懸濁し、ベアビーズを150マイクロリットルのPBSAに再懸濁します。最初のネガティブセレクションでは、PBSA中の950マイクロリットルの洗浄細胞に50マイクロリットルの洗浄ベアビーズを加え、混合物を摂氏4度で1.5時間インキュベートします。インキュベーション後、ベアビーズ細胞懸濁液が入ったチューブを、蓋を開けた状態で磁気ラックに置きます。
蓋の中の液体をチューブにピペットで入れ、2分間待ちます。次に、結合していない細胞を新しいマイクロ遠心チューブに移し、洗浄したベアビーズを50マイクロリットル加えます。ネガティブセレクションを3回行った後、50マイクロリットルの抗原充填ビーズ溶液を細胞に加えます。
摂氏4度で2時間インキュベートします。次に、抗原をロードしたビーズを含む細胞を、蓋を開けた状態で磁気ラックに置きます。蓋の中にある液体をチューブにピペットで入れます。
2分間待ってから、バインドされていないセルを破棄します。最初の抗原ビーズの選択について説明したように、残りのすべてのステップを実行します。3回のネガティブ選択と1回のポジティブ選択の後、細胞を1ミリリットルのSDCAAに急速に再懸濁し、大量のSDCAAを含むシェーカーフラスコに移します。
酵母ライブラリーのSGCAAでタンパク質の表面発現を一晩誘導した後、多様性の10倍をカバーするのに十分な細胞をペレット化し、上清を廃棄します。ペレットをPBSAに再懸濁し、マイクロ遠心チューブに移します。各チューブで3,000万個の細胞を染色します。
抗原を含まないコントロールチューブ1本を含め、多様性に基づいて必要な数のチューブを準備します。次に、チューブを2000 x gで室温で5分間遠心分離します。ペレットを抗原を含む200マイクロリットルのPBSAに再懸濁し、摂氏4度で1時間インキュベートします。
再度遠心分離を行った後、ペレットからPBSAを除去します。次に、ディスプレイ染色および抗原検出のために、100 μリットルの低温PBSA含有抗体に細胞を再懸濁します。摂氏4度で30分間インキュベートします。
インキュベーション後、細胞を2000 x gで4°Cで5分間遠心分離します。ペレットに1ミリリットルのPBSAを加え、遠心分離を繰り返します。次に、ペレットが乾燥するのを防ぐために、上澄みの大部分を取り除き、20〜30マイクロリットルだけを残します。
選別する直前に、ペレットを冷たいPBSAに再懸濁します。次に、細胞を直接SDCAA培地に選別します。選別後、細胞を大量のSDCAA培地を含むシェーカーフラスコに移し、摂氏30度でインキュベートし、180RPMで振とうします。
概要
本プロトコルでは、標的抗原に結合するタンパク質バリアントを濃縮させるための酵母表面提示セレクションキャンペーンの必須手順について説明します。この手法により、セレクション条件の精密な制御と、ソーティングプロセス中のフローサイトメトリーによる可視化が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- タンパク質工学
- 細胞工学
- 治療法の開発
背景
- 酵母表面ディスプレイは、タンパク質工学における強力なツールです。
- これにより、ソーティング中のライブラリの可視化が可能になります。
- 抗原濃度およびソーティングの厳格性を制御することができます。
- タンパク質の安定性工学や標的治療などのアプリケーションに使用されます。
研究目的
- 特定の抗原に結合するタンパク質バリアントを濃縮すること。
- 細胞療法の効率を向上させること。
- 低分子化合物によって制御される新規のタンパク質スイッチを開発すること。
使用した手法
- ビオチン結合磁気ビーズの調製。
- 洗浄済みベアビーズと細胞を用いたネガティブセレクション。
- 抗原負荷ビーズを用いたポジティブセレクション。
- 濃縮細胞のフローサイトメトリーによるソーティング。
主要な結果
- 抗原に結合するタンパク質バリアントの効率的な濃縮。
- 選択条件の制御を確認。
- さらなる研究に向けた、目的のタンパク質バリアントの効率的な回収。
結論
- 酵母表面提示法は、タンパク質変異体の選別に有効である。
- 次世代治療法の開発に向けた堅牢なプラットフォームを提供する。
- タンパク質工学および治療への応用の進展を促進する。
よくある質問
産業界への適合性
酵母表面ディスプレイ法を用いることで、結合特性が向上した、あるいは新規の結合特性を持つタンパク質変異体の迅速かつ高精度なエンジニアリングが可能となり、治療薬探索の初期段階を直接的に支援します。表現型と遺伝型の連動およびフローサイトメトリーによる選択を統合したこの手法により、ターゲット検証およびリード化合物同定における予測の信頼性が向上します。本プラットフォームは汎用性が高くスケーラブルであるため、バイオ医薬品の研究開発におけるタンパク質エンジニアリングパイプラインの再利用可能な機能として位置付けられます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 望ましい結合プロファイルを持つタンパク質変異体を選択することで、治療仮説の検証を可能にします。
- 選択の厳格性と抗原濃度を精密に制御することにより、生物学的なリスク低減（de-risking）をサポートします。
- タンパク質の表現型を遺伝子型に関連付けることで、ダウンストリーム解析のための機能的なターゲットバリデーションを促進します。
- 高親和性バインダーを濃縮させることで、ポートフォリオの選別における予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 下流のスクリーニングワークフローに向けて、検証済みの酵母ディスプレイタンパク質ライブラリを調製します。
- フローサイトメトリーによる可視化およびソートを通じて、アッセイ条件を標準化し、再現性を向上させます。
- 結合親和性と特異性の定量的な評価を可能にし、信頼性の高い化合物評価を実現します。
- 複数のキャンペーンにわたる、エンジニアリングされたタンパク質変異体のスケーラブルな濃縮および再利用をサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 翻訳的な連続性を確保するため、設計されたタンパク質を疾患に関連する標的に適合させます。
- タンパク質ベースの治療薬の前臨床検証のための堅牢なプラットフォームを提供します。
- 安定性と機能活性に基づく選択を可能にすることで、メカニズム上の曖昧さを低減します。
- 定量的な濃縮データを通じて、リスク調整後の推進判断を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
酵母表面ディスプレイは、初期探索、リード化合物の同定、および前臨床バリデーションの接点に位置し、タンパク質治療薬の反復的な最適化を可能にします。
- 発見生物学：機能的なタンパク質バリアントを選択することで、仮説検証とパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：親和性と特異性の評価において、再現性のある定量的なアウトプットを提供します。
- 分析：フローサイトメトリーおよびシーケンシングデータを提供し、異なる条件下でのバリアントの性能を比較します。
- トランスレーショナルリサーチ：結合特性が検証された候補物質を創出することで、発見段階と前臨床段階を橋渡しします。
- 企業レベルでの再利用：多様なタンパク質工学的目的に適応可能な、モジュール式で拡張性の高いプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： タンパク質工学における予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用の価値： 選抜ワークフローを標準化および効率化し、再現性と拡張性を向上させます。
- 戦略的価値： 情報に基づいた意思決定（Go/No-go判断）と、資本効率の高いポートフォリオ管理を可能にします。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整後の優先順位付けと、タンパク質治療薬候補の推進を支援します。
実施上の検討事項
- 最適な実施には、分子生物学およびフローサイトメトリーの専門知識が必要です。
- フローサイトメトリー装置および分析インフラストラクチャへのアクセスが必要です。
- 選択およびソーティングプロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- プロトコルの調整により、さまざまな標的タンパク質やモデルシステムに適応可能です。
- キャンペーンの成功は、ライブラリの多様性と抗原の可用性に依存します。
