Name: 酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 学ぶ酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学の手法。抗原結合タンパク質変異体をフローサイトメトリーで選別し、細胞治療薬開発やタンパク質安定性向上に応用する効率的なプロトコルを解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>酵母表面ディスプレイ技術によるタンパク質機能の最適化

酵母表面ディスプレイは、タンパク質工学の分野における重要な技術の1つです。これにより、親和性や安定性の向上など、必要な特性を持つタンパク質バリアントの選択が可能になります。1997年に初めて導入された1、ファージディスプレイ2,3、リボソームディスプレイ4、および哺乳動物細胞ディスプレイ5,6,7以外で最も一般的に使用されるディスプレイ技術の1つです。目的タンパク質(POI)は、酵母細胞を融合させてアンカータンパク質にすることで、酵母細胞の表面に表示されます。さまざまなアンカータンパク質が利用可能であり、最も一般的には、POIは酵母凝集体交配タンパク質Aga2p 1,8のC末端に融合しています。さらに、POIの側面には通常、ヘマグルチニンタグ(HAタグ)やc-mycタグなどの2つのタグがあり、蛍光標識抗体やフローサイトメトリーを使用してディスプレイレベルを検出することができます(図1A)。一般的な酵母選択キャンペーンには、磁気ビーズ選択とフローサイトメトリーソーティングの組み合わせが含まれます。ビーズの選択により、抗原をロードしたビーズとの多価相互作用が結合効果をもたらし、したがって低親和性変異体の喪失を防ぐことができるため、標的抗原に結合するタンパク質変異体の濃縮と、大きな細胞数の処理が可能になります(図1B)。フローサイトメトリーの解析と選択には、表示されたPOIバリアントと標識抗原の結合を視覚化できるという利点があります。その結果、結合集団を選別および培養することができ、数回の選別ラウンドを通じて所望の特性を持つタンパク質変異体を濃縮することができます。さらに、ランダム突然変異誘発の追加ラウンドを行うことで、多様性をさらに高め、したがって、タンパク質の親和性および/または安定性に寄与する追加の突然変異を見つける可能性を高めることができます。
酵母表面ディスプレイには、(a)酸化的タンパク質のフォールディングおよび真核生物の翻訳後修飾(N-グリコシル化など)を可能にする真核生物の発現機構、(b)タンパク質に隣接する2つのペプチドタグの検出による発現の正常化、(c)フローサイトメトリーによる選択進行の目視検査(例えば、結合細胞の割合や結合強度)、(d)個々のタンパク質変異体を解析する可能性など、特定の利点があります。酵母(例えば、熱安定性や親和性の解析)は、面倒なタンパク質の発現と精製に代わる時間節約の代替手段を提供します9。実際、酵母表面表示タンパク質の親和性(KD値)および安定性(T50値)は、生物物理学的方法および可溶性タンパク質9,10,11,12を用いて得られたデータと良好な相関を示している。酵母表面ディスプレイは、種々のタンパク質、例えば、抗体断片13、14、15、16、10番目のIII型フィブロネクチンドメイン17、18、rcSso7d19、20、またはノッチン21のエンジニアリングに採用されている.同様に、ランダム化された位置およびアミノ酸コドンの使用量17,22,23を変更することにより、酵母ライブラリーの設計を最適化するための広範な研究が行われている。酵母表面ディスプレイは、安定性14,15,24,25、親和性18,26,27、酵素活性28,29,30,31、およびタンパク質発現32の工学に成功したことが証明されています.さらに、低分子の存在下または非存在下での条件付き結合のようなより洗練されたアプリケーションは、酵母表面ディスプレイ20を使用して達成された。
このプロトコルでは、小分子A1120 20の存在下で抗原ヒトレチノール結合タンパク質4(hRBP4)に対して選択されたG4ライブラリ(10番目のIII型フィブロネクチンドメイン、Fn3に基づく)の例を使用して、酵母表面ディスプレイを使用した選択キャンペーンのすべての重要なステップについて説明します20。この選択は、分子スイッチとして使用できる小分子に依存するタンパク質間相互作用を生じさせるために行われました。注目すべきは、酵母表面ディスプレイでは別のアプローチが可能ですが、一般的な酵母の選択は通常、以前の結合親和性なしに標的抗原に結合することを目的としています。酵母ライブラリーの培養、ビーズの選択、フローサイトメトリーソーティング、エラー発生しやすいPCR(epPCR)によるアフィニティー成熟など、酵母選択キャンペーンのすべてのステップをカバーしています。したがって、このプロトコルは、以前の酵母表面表示プロトコル33,34を補完し、任意の所与の酵母ライブラリーおよび選択された標的抗原を用いた酵母表面表示選択（図1）の基礎として使用することができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig1v5.jpg"> 
図1:酵母表面ディスプレイの原理と酵母表面ディスプレイ選択の典型的なワークフロー。 (A)POIは、酵母表面表示ベクトルにクローニングされ、通常はN末端HAおよびC末端c-myc-タグが隣接しています。このコンストラクトは、酵母の交配タンパク質Aga2pに融合して表面に表示します。描かれているタンパク質は、PDB ID:6QBA20の改変バインダー「RS3」です。(B)ビーズ選択とフローサイトメトリーソーティングによるタンパク質バリアントの濃縮と所望の特性、およびアフィニティー成熟のためのepPCRを組み合わせた酵母表面ディスプレイ選択キャンペーンの典型的なワークフローを示すフローチャート。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig1largev5.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>10-βエレクトロコンピテント大腸菌&nbsp;</td><td>NEB</td><td>C3020K</td><td></td></tr><tr><td>寒天、神戸 I</td><td>Carl Roth</td><td>5210.5</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>Carl Roth</td><td>K029.2</td><td></td></tr><tr><td>抗 c-myc 抗体、クローン 9E10、AF488</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A488 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>抗 c-myc 抗体、クローン 9E10、AF647</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A647 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>抗 HA 抗体、クローン 16B12, AF488</td><td>BioLegend</td><td>901509 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>抗HA抗体, クローン 16B12, AF647</td><td>BioLegend</td><td>682404 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン, 冷エタノール画分</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>D-ガラクトース</td><td>カール・ロス</td><td>4987.2</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Difco 酵母 窒素ベース</td><td>ベクトン・ディキンソン (BD)&nbsp;</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム水素七水和物</td><td>カール・ロス</td><td>X987.3</td><td></td></tr><tr><td>DL-ジチオスレイトール</td><td>Sigma-アルドリッチ</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>D-ソルビトール</td><td>カール・ロス</td><td>6213.1</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'リン酸緩衝生理食塩水 (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Biotin Binder</td><td>Invitrogen</td><td>11047 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EBY100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット 1 mm (E.coli用)</td><td>VWR</td><td>732-1135</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット 2 mm (酵母用)</td><td>VWR</td><td>732-1136</td><td></td></tr><tr><td>エタノール アブソリュート</td><td>MERCK</td><td>1070172511</td><td></td></tr><tr><td>GeneMorph II ランダム変異導入キット</td><td>Agilent Technologies</td><td>200550</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Casamino Acids</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>223120</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>131339.1211</td><td></td></tr><tr><td>LE アガロース&nbsp;</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>酢酸リチウム二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>Monarch DNA ゲル抽出キット</td><td>NEB</td><td>T1020S</td><td></td></tr><tr><td>Monarch PCR &DNAクリーンアップキット</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge 1S-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>伸長培地</td><td>NEB</td><td>B9035S</td><td></td></tr><tr><td>pCTCON2</td><td>Addgene</td><td>#41843</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Penta-His 抗体、AF488</td><td>Qiagen</td><td>35310</td><td></td></tr><tr><td>Penta-His 抗体、AF647</td><td>Qiagen</td><td>35370</td><td></td></tr><tr><td>ペプトン ex カゼイン、トリプティックに消化された</td><td>Carl Roth</td><td>8986.3</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>SaII-HF</td><td>NEB</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>カール・ロス</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム一水和物</td><td>カール・ロス</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>ステリトップねじ付きボトルトップフィルター</td><td>MERCK</td><td>S2GPT01RE</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン、AF488</td><td>Invitrogen</td><td>S32354 (サーモフィッシャー)</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン、AF647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357 (サーモフィッシャー)</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン硫酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム二水和物</td><td>カール・ロス</td><td>4088.1</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis分光光度計</td><td>アジレント</td><td>8453</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物、微量顆粒カール</td><td>ロス</td><td>2904.4</td><td></td></tr><tr><td>Zymoprep 酵母プラスミドMiniprep II</td><td>Zymo Research</td><td>D2004&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学

Protein Engineering by Yeast Surface Display

G4ライブラリーは、低分子医薬品A1120に結合した抗原hRBP4に対して選択されました。フローサイトメトリーソーティングのためのライブラリーの染色は、方法6に記載したように行い、適用されたゲーティング戦略を 図2Aに示します。最初のゲートには、細胞形態に基づくすべての細胞が含まれ、2番目のゲート(FSC-Widthのヒストグラム)は、単一細胞を選択し、細胞凝集体を除去するために適用された厳格なゲーティング戦略を示しました。3番目と最後のゲートは、タンパク質変異体(x軸)と抗原結合(y軸)の表示を示しました。ディスプレイシグナルと結合シグナルの両方を示す酵母細胞を選別しました。重要なことに、ソーティングゲートは、高い結合シグナル、したがって高い親和性を持つ結合ドメインを濃縮するために、厳密な方法で設定されました。この厳格な選択により、選択キャンペーン全体を通じて標的抗原に特異的に結合する酵母細胞を表示することの濃縮がもたらされました(図2B)。その後のフローサイトメトリーソーティングラウンドでは、抗原濃度が10倍(100 nMから10 nM)に減少しました。したがって、全体的な結合シグナルは減少し、親和性の高いバインダーのみが依然として検出可能で選別されました(図2C)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig2v5.jpg"> 
図2:抗原(A1120の存在下でのhRBP4)に結合するためのFn3ベースのG4ライブラリーの酵母表面表示選択からの代表的な結果。 (A)酵母ライブラリーのソーティングのための一般的なゲーティング戦略。最初のゲート(FSCとSSC)は、すべての酵母細胞を選択し、散乱イベントを除外することです。2番目のゲート(FSC-Wのヒストグラム)は、細胞凝集体を除去し、単一の酵母細胞のみを選択することを目的としています。3 番目のゲートは、表面の表示レベル(HA タグまたは c-myc-タグの検出)と抗原への結合(ここでは 5 μM A1120 存在下での hRBP4、抗 His 抗体によって検出)をプロットします。ライブラリーは、抗原結合が期待されない二次抗体のみ(抗原なし)で追加的に染色しました。ソートされたセルは青色で強調表示されます。(B)3ラウンドのフローサイトメトリーソーティングにおけるG4ライブラリーの進化。結合集団の濃縮は、各選択ラウンドで観察できます。(C)より低い抗原濃度の使用により、標的抗原に対する親和性が高いタンパク質変異体の選択が可能になる。抗原濃度(ここではhRBP4)を10倍に減少させると、異なる対角線が現れ、親和性が高い(選別された細胞、青)またはより低い親和性を持つクローンが存在することを示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig2largev5.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

protein-engineering-by-yeast-surface-display

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

私たちは、Saccharomyces cerevisiaeの指向性進化キャンペーンのための突然変異体ライブラリを構築し、スクリーニングするための詳細なプロトコルを提示します。...

指向進化方法で<em&gt;サッカロマイセス・セレビシエ</em&gt;：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング

ここでは、酵母表面表示基質を酵素修飾アッセイに使用するためのプロトコールを紹介します。このプラットフォームは、代表的な酵素修飾アッセイとして、チロシンホスファターゼSHP-2の基質の1つに対する脱リン酸化活性の分析を使用して実証されました。...

酵母表面表示タンパク質の酵素修飾およびフローサイトメトリー評価

私たちは、脱細胞肺癌細胞外マトリックスと機能的な肺組織を生成するために使用することができる新規バイオミメティックバイオリアクターを開発している。バイオリアクターにおけるマトリックスと培養に細胞を播種することにより、我々は短期間のためのin...

肺のエンジニアリングのための手順

我々は、三次元組織のような凝集体中の細胞間、組織の表面張力として表現結合エネルギーを、測定する方法を説明します。組織の表面張力の違いは、肺、筋肉、脳の腫瘍の侵襲性と相関することが実証され、異なる種類の細胞間の空間関係を確立するための基本的な決定要因であるされています。...

組織の表面張力測定ごとの集計凝集力の測定

汎用性の高いプラズマのリソグラフィ技術は、細胞付着を導くための安定した表面のパターンを生成するために開発されました。この手法は、自然の組織を模倣する、いくつかの、異なる細胞タイプを研究するために使用されているものを含め、携帯ネットワークを作成するために適用することができます。...

細胞ネットワークの作成のためのプラズマのリソグラフィ表面パターニング

分泌装置とcurli繊維構造モノマーの両方をコードする合成オペロンの設計について説明する。これらのアミロイドと接着ポリマーの過剰産生の付着の測定可能なゲインを許可...

単一の合成Curliオペロンを作成して付着細菌を工学

生体適合性のpH応答性ゾル - ゲルナノセンサーは、ポリ（乳酸 - コ - グリコール酸）（PLGA）エレクトロスパン足場に組み込むことができる。産自己申告足場は、足場上に細胞を培養しながら微小環境条件の現場モニタリングのために使用することができる。 3D構築物が細胞の実験を妨害することなく、リアルタイムでモニターすることができるので、これは有益である。...

3次元細胞培養のための自己申告足場

単一または複数の細胞外マトリックスタンパク質からナノファイバーおよび複合ナノ構造体を得るための方法が記載されている。この方法は、組織工学及びバイオテクノロジーの様々なアプリケーションで使用するために調整可能な組成物およびアーキテクチャに自立タンパク質ベースの材料を作成するために、タンパク質 - 表面相互作用を使用する。...

表面開始アセンブリの使用ECMタンパク質のナノファイバーおよびナノ構造エンジニア

ここでは、高解像度のナノスケール表面電位マップを生成するためのツールとしてのケルビンプローブ力顕微鏡の使用を説明するプロトコルを提示します。このツールは、微生物の基質表面への結合能力に対する表面電位の役割を評価するために適用されました。...

ケルビンプローブフォース顕微鏡を用いて細菌の表面電位測定

これは、組織工学チャンバー内の顕微動動静脈ループまたはフロースルー椎弓根構成を使用して、in...

中に組み込み血管新生による組織工学<em&gt;インビボ</em&gt;ティッシュ・エンジニアリング商工会議所

学ぶ酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学の手法。抗原結合タンパク質変異体をフローサイトメトリーで選別し、細胞治療薬開発やタンパク質安定性向上に応用する効率的なプロトコルを解説します。

酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学

さらに動画を探す