Name: 初代T細胞における初期Ca2+ マイクロドメインのイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: 学ぶ 初代マウスおよびヒトT細胞における初期Ca²⁺マイクロドメインの蛍光顕微鏡イメージング法。この手法は免疫細胞内のCa²⁺シグナル伝達経路を調査し、適応免疫応答の初期活性化メカニズムを解明する上で重要なツールとなる。

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<meta charset="utf8"></head><body>T細胞中のCa2+ マイクロドメインを検出するための高分解能イメージング技術

<ol><li>Wolf, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontrunners+of+T+cell+activation%3A+Initial%2C+localized+Ca2%2B+signals+mediated+by+NAADP+and+the+type+1+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Frontrunners of T cell activation: Initial, localized Ca2+ signals mediated by NAADP and the type 1 ryanodine receptor.</a> Sci Signal. 8 (398), 102(2015).</li>
<li>Taguchi, T., Mukai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+signalling+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity signalling and membrane trafficking.</a> Curr Opin Cell Biol. 59, 1-7 (2019).</li>
<li>Trebak, M., Kinet, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in T cells.</a> Nat Rev Immunol. 19 (3), 154-169 (2019).</li>
<li>Diercks, B. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORAI1%2C+STIM1%2F2%2C+and+RYR1+shape+subsecond+Ca2%2B+microdomains+upon+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">ORAI1, STIM1/2, and RYR1 shape subsecond Ca2+ microdomains upon T cell activation.</a> Sci Signal. 11, 0358(2018).</li>
<li>Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sparks%3A+Elementary+events+underlying+excitation-contraction+coupling+in+heart+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Calcium sparks: Elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle.</a> Science. 262 (5134), 740-744 (1993).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+lymphocyte+activation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in lymphocyte activation and disease.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Kummerow, C., Junker, C., Kruse, K., Rieger, H., Quintana, A., Hoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse+controls+local+and+global+calcium+signals+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse controls local and global calcium signals in T lymphocytes.</a> Immunol Rev. 231 (1), 132-147 (2009).</li>
<li>Brock, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X4+and+P2X7+are+essential+players+in+basal+T+cell+activity+and+Ca2%2B+signaling+milliseconds+after+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">P2X4 and P2X7 are essential players in basal T cell activity and Ca2+ signaling milliseconds after T cell activation.</a> Sci Adv. 8 (5), 9770(2022).</li>
<li>Weiß, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+laminin-1+and+collagen+IV+induces+the+formation+of+Ca2%2B+microdomains+that+sensitize+mouse+T+cells+for+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Adhesion to laminin-1 and collagen IV induces the formation of Ca2+ microdomains that sensitize mouse T cells for activation.</a> Sci Signal. 16 (790), 9405(2023).</li>
<li>Diercks, B. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca2%2B+microdomains+for+the+adaptive+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca2+ microdomains for the adaptive immune response.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1871 (5), 119710(2024).</li>
<li>Woelk, L. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DARTS%3A+an+open-source+Python+pipeline+for+Ca2%2B+microdomain+analysis+in+live+cell+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">DARTS: an open-source Python pipeline for Ca2+ microdomain analysis in live cell imaging data.</a> Front Immunol. 14, 1299435(2024).</li>
<li>Diercks, B. -P., Werner, R., Schetelig, D., Wolf, I. M. A., Guse, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+calcium+imaging+method+for+local+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution calcium imaging method for local calcium signaling.</a> Methods Mol Biol. 1929, 27-39 (2019).</li>
<li>Python. Python. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.python.org/downloads/">https://www.python.org/downloads/</a> (2024).</li>
<li>Anaconda. Anaconda. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html">https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html</a> (2024).</li>
<li>git. git. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git">https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git</a> (2024).</li>
<li>DARTS. DARTS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS">https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS</a> (2024).</li>
<li>DARTS. DARTS GitHub Repository. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/">https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/</a> (2024).</li>
<li>Oracle. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/">https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/</a> (2024).</li>
<li>Time-Dependent Entropy Deconvolution. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters">https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters</a> (2024).</li>
<li>Gu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+NADPH+oxidases+DUOX1+and+DUOX2+synthesize+NAADP+and+are+necessary+for+Ca2%2B+signaling+during+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Dual NADPH oxidases DUOX1 and DUOX2 synthesize NAADP and are necessary for Ca2+ signaling during T cell activation.</a> Sci Signal. 14 (709), 3800(2021).</li>
<li>Roggenkamp, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HN1L%2FJPT2%3A+A+signaling+protein+that+connects+NAADP+generation+to+Ca2%2B+microdomain+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">HN1L/JPT2: A signaling protein that connects NAADP generation to Ca2+ microdomain formation.</a> Sci Signal. 14 (675), 5647(2021).</li>
<li>Heßling, L. D., Troost-Kind, B., Weiß, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAADP-binding+proteins+-+Linking+NAADP+signaling+to+cancer+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophy.+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">NAADP-binding proteins - Linking NAADP signaling to cancer and immunity.</a> Biochim Biophy. Acta Mol Cell Res. 1870 (7), 119531(2023).</li>
<li>Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+single-channel+optical+recording+reveals+multiple+Orai1+gating+states+and+oscillations+in+calcium+influx%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (2), 440-445 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&alpha;-CD3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD28</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anaconda</td><td>Anaconda</td><td>https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>細胞ス</td><td>トレーナーBiofil</td><td>CSS-013-070</td><td>70 &micro;m diameter</td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>A49865</td><td></td></tr><tr><td>カバー スリップ</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>101202</td><td></td></tr><tr><td>DARTS</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコS リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EasySep CD4+ T cell Isolation Kit</td><td>Stemcell</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnetic Multistand</td><td>Stemcell</td><td>18010</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Fura Red-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F3020</td><td></td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 medium</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td></td><td></td>11875093</tr><tr><td>Git</td><td>GitHub</td><td>https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git</td><td></td></tr><tr><td>イマージョンオイル</td><td>ライカ</td><td>11513859</td><td></td></tr><tr><td>新生児用子牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4637</td><td></td></tr><tr><td>Oracle</td><td>Oracle https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/&nbsp</td><td>;</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプタマイシン</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Protein G magnetic beads</td><td>Merck</td><td>LSKMAGG02</td><td>10 & micro;M径</td></tr><tr><td>パイソン</td><td>パイソン https://www.python.org/downloads/&nbsp</td><td>;</td><td></td></tr><tr><td>シリコングリース(バシロン)</td><td>Bayer</td><td>291-1220</td><td></td></tr><tr><td>Time-Dependent Entropy Deconvolution</td><td>GitHub</td><td>https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>q-biogene</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr></tbody></table>

初代t細胞における初期ca2+ マイクロドメインのイメージング

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

このプロトコルでは、私たちのグループによる以前の研究に基づいて、初代マウスT細胞の初期Ca2+マイクロドメインを画像化および分析するための更新された方法を概説しました1,13。このアプローチは、初期のCa2+シグナル伝達イベントにおけるORAI1、STIM1、STIM2などのCRACチャネル、およびRyR1などの細胞内Ca2+放出チャネルの関与を解明するのに役立ちました4。
そのために、非刺激初代マウスOrai1-/-、Stim1-/-、Stim2-/-、およびRyr1-/-をイメージングすることにより、自発的なCa2+マイクロドメイン形成を調査し、それらをWT初代マウスT細胞と比較しました。Ca2+マイクロドメイン形成の解析には、シグナル開始速度、Ca2+振幅、共焦点面あたりのシグナル数が含まれていました。特に、Stim2-/-T細胞を除いて、すべてのKO T細胞は、WT細胞と比較して、局所Ca2+シグナルの有意な減少と基礎遊離細胞質Ca2+濃度の低下を示しました。このことから、Ca2+ミクロドメインの形成は、ORAI1、STIM1、およびRyR14の相互作用と複雑に関連していると結論付けました。さらに、原形質膜における自発的なCa2+マイクロドメインの同定と特性評価に成功しました。これらのCa2+マイクロドメインは、290 nm±12 nmのCa2+振幅によって特徴付けられました。Ca2+シグナルに色分けされたアプローチを利用することで、細胞全体のCa2+マイクロドメインを可視化することができました。その結果、Ca2+マイクロドメインが数ミリ秒以内に急速に発現し、この方法が数ミリ秒の長寿命でCa2+シグナルを検出する能力がさらに強調されました4。これらの自発的なCa2+マイクロドメインは、後に接着依存性Ca2+マイクロドメイン(ADCM)として同定され、SOCEだけでなく、FAK/PLC-γ/IP3シグナル伝達カスケード10およびP2X49の関与を介しても作用します。さらに、この技術は、NAADP産生酵素21としてデュアルオキシダーゼ1および2(DUOX1/2)を、新たに発見されたNAADP結合タンパク質23の1つとしてHN1L/JPT22を確認するための基本的なものでした。
図2は、WTおよびP2x4-/-およびP2x7-/-マウスからのビーズ接触時の初代CD4+ T細胞におけるCa2+マイクロドメインの代表的な例を示しています。細胞にCa2+色素Fluo-4 AMおよびFura Red AMをロードし、25 ms(40 frame/s)の取得速度でイメージングしました。T細胞のシナプス形成を模倣するために、細胞を抗CD3/抗CD28コーティングビーズで刺激した。初期のCa2+マイクロドメイン形成は、DARTSパイプラインを使用してビーズ接触の1秒前と最大15秒後に分析しました。ビーズ接触後、WT細胞は、ビーズ接触部位での刺激後の最初の1秒間にCa2+マイクロドメインの急速な形成を示しました(図2A)。これらのCa2+マイクロドメインは、ビーズ接触後15秒で細胞全体にさらに拡大しました。WT細胞とは対照的に、P2x4-/-細胞およびP2x7-/-細胞(図2B)は、ビーズ刺激時にCa2+マイクロドメイン形成の減少を示し、ビーズ接触前のP2x4-/-a下部基底レベルでも減少しました。これらの代表的な知見は、Brockら9が以前に発表した結果と一致しており、ビーズ接触直後のWT T細胞におけるCa2+マイクロドメイン形成が15秒以上で、P2x4-/-およびP2x7-/-細胞のフレームあたりのシグナルが低いことを示しています。さらに、P2x4-/-細胞の振幅は大幅に減少し、接着依存性Ca2+マイクロドメインにおけるプリン作動性シグナル伝達の役割をさらに確立しました。
さらに、この方法は、初代ヒトCD4+ T細胞の初期Ca2+マイクロドメインを可視化するためにも使用できます(図3)。初代マウスT細胞に沿って、ビーズ接触部位に初期Ca2+マイクロドメインが誘発されます。しかし、全体的なCa2+応答は、マウスのCD4+ T細胞とは異なる時間スケールで起こるようです。
ローカルの Ca2+ シグナルを手動で分析することは、個々の研究者にとって非常に面倒で主観的であるため、実行可能ではありません。そのため、MATLAB Simulink で、ローカルの Ca2+ マイクロドメインを解析するための後処理13 用の画像処理および最適化ツールボックスを使用して、アルゴリズムを以前に開発しました。
最近、ソフトウェアプラットフォームPython12を使用した高解像度ライブセルイメージングでのCa2+マイクロドメイン解析のためのDARTSと呼ばれる新しいオープンソースの後処理パイプラインを開発しました。ここでは、ユーザーの好みに応じて、さまざまなデコンボリューションアルゴリズムを選択し、形態学的細胞形状の変化を補正するために実行される細胞形状の正規化、および顕微鏡および測定固有のパラメータ(スケール、フレームレート、測定時間など)を定義できます(図4)。
Ca2+ マイクロドメイン解析のパラメータを選択すると、ビーズの接触を定義するために、個々の測定ごとに2つ目のポップアップウィンドウが開きます(図5)。ビード接触を定義するには、スライダーを使用してtiffファイルを手動でスクロールし、ビード接触フレームを個別に選択します。ビーズ接触は、ビーズ接触部位(図5、ビーズとビーズ接触は黄色のリングと矢印で示される)をクリックし、セルを選択することによって選択されます。この手順は、対象のセルごとに繰り返す必要があります。最後に、自動化された画像後処理が適用され、結果データが集計されてスプレッドシートに保存されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig01.jpg"> 図1:イメージング用のスライド調製のワークフロー。 (A)2枚目のガラスカバースリップを使用して、BSAとPLLの両方をスライドに追加して広げます。(B,C)チャンバーを構築するには、シリコングリースを使用してゴム製のOリングをスライドに接着します。チャンバーを適切に隔離するために、リング全体が薄いグリースの層で覆われていることを確認してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig02.jpg"> 図2:初代マウス野生型(WT)(A)、P2x4-/-またはP2x7-/-(B)CD4+ T細胞におけるT細胞受容体依存性Ca2+マイクロドメインの代表細胞。CD4+ T細胞は、上記のように負に単離され、Fluo-4 AMおよびFura Redがロードされました。T細胞はDARTSパイプラインを使用して分析され、以前に発表された結果と同等の細胞画像が得られました9。(A)WT初代T細胞を抗CD3/抗CD28コーティングビーズによる刺激の1秒前および刺激の最大15秒後(スケールバー5μm)、およびビーズ接触領域の0秒から0.65秒までのズームインの3D表面プロット(スケールバー1μm)。(B)アッパーレーン:ビーズ刺激の1秒前と15秒後までの代表的なP2x4-/-初代T細胞。下側レーン:ビーズ刺激の1秒前と15秒後までの代表的なP2x7-/-初代T細胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig03.jpg"> 図3:TCR刺激後の代表的な初代ヒトT細胞におけるCa2+ マイクロドメイン。 初代ヒトCD4+ T細胞は、バフィーコートからの蛍光活性化細胞選別(FACS)により末梢血単核細胞(PBMC)から単離され、上記のようにFluo-4 AMおよびFura Redをロードした。図は、抗CD3コーティングビーズによる刺激の1秒前と刺激の最大15秒後(スケールバー5μm)の初代ヒトT細胞と、ビーズ接触領域での6.25秒から7.5秒までのズームイン(スケールバー1μm)の3D表面プロットを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig04.jpg"> 図4:DARTSグラフィカルユーザーインターフェース(GUI)。 GUI は 4 つの領域に分かれています。 [Input/Output] 領域では、ソース ディレクトリとイメージ設定 (ファイルごとに 2 つのチャネルまたは個別のチャネル)、結果ディレクトリなど、生データに関する情報を指定する必要があります。 [測定のプロパティ]領域では、スケール(ピクセルあたりのミクロン数)、フレームレート、後で決定された開始点を基準とした測定間隔など、すべての関連情報とともに実験を説明する必要があります。次に、後処理ステップ、形状正規化、および実際の解析(マイクロドメイン検出とダーツボードデータ蓄積)で構成される処理パイプラインを組み立てることができます。最後に、設定をコンピューターに保存したり、コンピューターからロードしたりできます。解析を設定したら、[ 開始 ]をクリックして続行します。セットアップの詳細については、https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/General/Usage.html を参照してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig05.jpg"> 図5:ビード接点の手動定義。実験中にビーズを細胞に添加する場合、目的の細胞との最初のビーズ接触時間と接触位置を手動で定義する必要があります。これは、スライダーでフレームをスクロールし、ある時点 t の位置 (x,y) を見つけることによって行われます。ビーズの連絡先情報フィールドを自動的に入力するには、ユーザーは顕微鏡画像の左半分のビーズ接触位置をクリックします。次に、セルをビード接触に関連付けるために、ユーザーはビーズ接触を持つセル内の位置をクリックします。情報は、[ADD bead]を選択して確認する必要があります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

初代T細胞における初期Ca2+ マイクロドメインのイメージング

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

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Research

JoVE Journal

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