Name: 抗体依存性細胞傷害レポーターバイオアッセイを用いたがん細胞における抗体依存性細胞媒介性細胞毒性の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: 学ぶADCCレポーターバイオアッセイを用いたがん免疫療法研究における抗体薬効価評価法。この迅速なミックスアンドリードプロトコルは1日で結果を得られ、高いS/N比で治療用抗体の正確なスクリーニングを可能にする。

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<meta charset="utf8"></head><body>がん免疫療法のためのADCCバイオアッセイにおけるエフェクターとしての甲状腺がん細胞

<ol><li>Zahavi, D., AlDeghaither, D., O'Connell, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity%3A+a+strategy+for+improving+antibody-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Antib+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: a strategy for improving antibody-based immunotherapy.</a> Antib Ther. 1 (1), 7-12 (2018).</li>
<li>Fenis, A., Demaria, O., Gauthier, L., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+immune+cell+engagers+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">New immune cell engagers for cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Immunol. 24 (7), 471-486 (2024).</li>
<li>Pinto, S., Pahl, J., Schottelius, A., Carter, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reimagining+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+cancer%3A+the+potential+of+natural+killer+cell+engagers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reimagining antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer: the potential of natural killer cell engagers.</a> Trends Immunol. 43 (11), 932-946 (2022).</li>
<li>Ochoa, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+cell+cytotoxicity%3A+immunotherapy+strategies+enhancing+effector+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent cell cytotoxicity: immunotherapy strategies enhancing effector NK cells.</a> Immunol Cell Biol. 95 (4), 347-355 (2017).</li>
<li>Wang, W., Erbe, A. K., Hank, J. A., Morris, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cell-mediated+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cell-mediated antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer immunotherapy.</a> Front Immunol. 6, 368(2015).</li>
<li>Chung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+in+vitro+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+activity+of+therapeutic+antibodies+-+impact+of+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of in vitro antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activity of therapeutic antibodies - impact of effector cells.</a> J Immunol Methods. 407, 63-75 (2014).</li>
<li>Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">NK cells for cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).</li>
<li>Cheng, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+reporter-based+ADCC+assay+with+frozen%2C+thaw-and-use+cells+to+measure+Fc+effector+function+of+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies.</a> J Immunol Methods. 414, 69-81 (2014).</li>
<li>Parekh, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity-reporter+gene+assay%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity-reporter gene assay.</a> MAbs. 4 (3), 310-318 (2012).</li>
<li>Hogarth, P. M., Pietersz, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor-targeted+therapies+for+the+treatment+of+inflammation%2C+cancer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (4), 311-331 (2012).</li>
<li>Chung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+fucose+reducing+effects+in+a+humanized+antibody+on+Fcgamma+receptor+binding+and+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+activities%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of fucose reducing effects in a humanized antibody on Fcgamma receptor binding and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activities.</a> MAbs. 4 (3), 326-340 (2012).</li>
<li>Promega. ADCC Reporter Bioassay Core Kit Technical Manual. , 
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<li>Miller, A. S., Tejada, M. L., Gazzano-Santoro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in vitro.</a> Methods Mol Biol. 1134, 59-65 (2014).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.5% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>PBSで10倍希釈して0.05%トリプシン</td></tr><tr><td>を作る 1x トリスバッファー生理食塩水(TBS)</td><td>1st BASE</td><td>BUF-3030-1X1L</td><td>ウェスタンブロッティングでのメンブレン洗浄用</td></tr><tr><td>1.5 Mトリスバッファー、pH 8.8</td><td>1st BASE</td><td>BUF-1419-1L-pH8.8</td><td>SDSゲル調製用</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7522-100ML</td><td>のサンプル調製用ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>30% アクリルアミド/ビス溶液</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610158</td><td>SDSゲル調製用</td></tr><tr><td>4x Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610747</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>96ウェル白色ポリスチレンマイクロプレート、透明平底</td>のサンプル調製用 <td>コーニングインコーポレイテッド</td><td>3610</td><td>ADCC アッセイ用</td></tr><tr><td>ADCC バイオアッセイ エフェクター細胞 (0.65 mL)</td><td>Promega</td><td>G7011</td><td>ADCCレポーターバイオアッセイコアキット(Promega G7010)、1 x 1バイアル</td></tr><tr><td>ADCCレポーターバイオアッセイコアキット</td>に含まれるもの <td>Promega</td><td>G7010</td><td>この実験でADCCアッセイ用のADCCバイオアッセイキットとして言及</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A3678-25G</td><td>SDSゲル調製用</td></tr><tr><td>ベバシズマブ(ヒト化抗VEGF抗体)</td><td>MVASI-ADCC</td><td></td><td>アッセイ</td></tr><tr><td>のネガティブコントロール抗体として使用BHT-101</td><td>ライプニッツ研究所 DSMZ</td><td>ACC279</td><td>ヒト未分化甲状腺乳頭がん細胞株&nbsp;</td></tr><tr><td>Bio-Glo ルシフェラーゼアッセイバッファー</td><td>Promega</td><td>G7941</td><td>ADCC レポーターバイオアッセイコアキット (Promega G7010) に含まれ、1 x 10 mL</td></tr><tr><td>Bio-Glo ルシフェラーゼアッセイ基質 (凍結乾燥済み)</td> <td>Promega</td><td>G7941</td><td>ADCC レポーターバイオアッセイコアキット (Promega G7010)、1 x 1 バイアル</td></tr><tr><td>セルスクレーパー</td><td>GenFollower</td><td>GD00235</td><td>培養フラスコから細胞を除去するには</td></tr><tr><td>セツキシマブ (キメラ抗EGFR抗体)</td><td>ERBITUX-ADCC</td><td></td><td>アッセイの治療用抗体として使用</td></tr><tr><td>化学発光HRP基質</td><td>メルクミリポア</td><td>WBKLS0500</td><td>ウェスタンブロッティングにおけるタンパク質検出用</td></tr><tr><td>蒸留水</td><td>Gibco</td><td>15230-162</td><td>SDSゲル調製用</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>培地サプリメント</td></tr><tr><td>iBright CL1500イメージングシステム</td><td>Thermo Scientific</td><td>2462621100038</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>L-グルタミン、200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>培地サプリメント</td></tr><tr><td>低IgG血清</td><td>Promega</td><td>G7110</td><td>ADCC レポーターバイオアッセイコアキット(Promega G7010)、1 x 4 mL</td></tr><tr><td>Megafuge 8R</td><td>Thermo Scientific</td><td>42876589</td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>Mouse 抗 EGFR モノクローナル抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>610016</td><td>ウェスタンブロッティング中の一次抗体</td></tr><tr><td>マウス抗VEGFRモノクローナル抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>571194</td><td>ウェスタンブロッティング中の一次抗体</td></tr><tr><td>非酵素的細胞解離バッファー</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5789-100ML</td><td>T75フラスコからの細胞回収用</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td>抗菌剤培地</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.2、滅菌ろ過</td><td>1st BASE</td><td>CUS-2048-1x1L</td><td>細胞の洗浄液として使用</td></tr><tr><td>Pierce BCAアッセイキット</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>タンパク質濃度の測定</td></tr><tr><td>プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td>ウェスタンブロッティングPVDFのサンプル調製におけるタンパク質消化用</td></tr><tr><td>メンブレン(Immobilin-P)</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr>ウサギ<tr><td>抗マウスIgG、Fc&γにおけるタンパク質転写用;HRP標識二次抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>315-035-046</td><td>ウェスタンブロッティング中の二次抗体</td></tr><tr><td>ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI) 培地</td><td>Capricorn Scientific</td><td>RPMI-XA</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>プロメガ</td><td>G7080</td><td>ADCC レポーターバイオアッセイコアキット(プロメガ G7010)、36mL</td></tr><tr><td>スキム粉乳</td><td>1個 メルクミリポア</td><td>70166-500G</td><td>ウェスタンブロッティングにおける膜ブロッキング用</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>1st BASE</td><td>BIO-2050-500g</td><td>SDSゲル調製用</td></tr><tr><td>SW-1736</td><td>Cytion</td><td>300453</td><td>ヒト甲状腺扁平上皮がん細胞株</td></tr><tr><td>T75培養フラスコ</td><td>SPL ライフサイエンス</td><td>70075</td><td>細胞培養フラスコ</td></tr><tr><td>Tecan マルチモードリーダーモデル Spark 10M</td><td>Tecan</td><td>1607000294</td><td>ルミニセンス定量</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610801</td><td>SDSゲル調製用</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Promega</td><td>H5151</td><td>ウェスタンブロッティングにおけるメンブレン洗浄用</td></tr><tr><td>Vi-cell XR細胞生存率分析装置</td><td>ベックマン・コールター</td><td>AL15072</td><td>セルカウンター</td></tr></tbody></table>

抗体依存性細胞傷害レポーターバイオアッセイを用いたがん細胞における抗体依存性細胞媒介性細胞毒性の評価

Assessing Antibody-dependent, Cell-mediated Cytotoxicity in Cancer Cells using Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Reporter Bioassay

標的BHT-101およびSW-1736細胞におけるEGFRおよびVEGFRの発現をウェスタンブロッティングを用いて検出しました。BHT-101細胞とSW-1736細胞の両方でEGFRの発現が検出されましたが、VEGFRの発現は検出されませんでした(図3)。
ADCCバイオアッセイキットを用いて、EGFR陽性細胞株BHT-101およびSW-1736を標的細胞として、抗EGFR抗体セツキシマブのADCC反応を検出しました。VEGF不活化剤であるベバシズマブは、ネガティブコントロール抗体として使用されました。異なる濃度の抗体およびエフェクター細胞を標的細胞とインキュベートした。発光信号は、プレートリーダーを使用して検出しました(図2)。セツキシマブ(抗EGFR抗体)群ではADCC活性誘導の倍率が高いことが認められましたが、ベバシズマブ(VEGF拮抗薬)では両細胞株のADCC活性は見られませんでした。これにより、両細胞株のEGFR細胞外膜抗原を標的としたADCC効果が実証されました。この方法を用いて、2つの未分化甲状腺がん細胞株(BHT101およびSW1736)において、セツキシマブの存在下でADCC反応が検証されました(図4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig01.jpg"> 
図1:ADCCバイオアッセイキットを使用したADCC反応を示す概略図。 治療用抗体の抗原結合部位は、標的細胞の表面抗原に結合します。この結合により、抗体のFc部分がエフェクター細胞のFcƳRIIIa受容体に結合し、エフェクター細胞に発光シグナルが生成されます。この図は、ADCC Reporter Bioassay Core kit のマニュアルから許可を得て12 で修正したものです。略語:ADCC =抗体依存性細胞媒介性細胞毒性;Fc =フラグメント結晶化可能領域;NFAT = 活性化T細胞の核因子;RE = 応答要素;luc = ルシフェラーゼ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig02.jpg"> 
図2:ADCC共培養システムの96ウェルプレート設計の発光読み取りと実験図。 発光信号は発光リーダーによって読み取られます。行A:1st-9thウェルにはADCC Bioassay Bufferが含まれています。B列:3rd-8thウェルには、BHT101のADCC反応系(標的細胞+抗体+エフェクター細胞)が含まれています。2番目のウェルは抗体なしです。9番目のウェルには、ADCC Bioassayバッファーのみが含まれています。C列:3rd-8thウェルには、SW-1736のADCC反応系(標的細胞+抗体+エフェクター細胞)が含まれています。2番目のウェルは抗体なしです。9番目のウェルには、ADCC Bioassayバッファーのみが含まれています。行D:1st-9thウェルにはアッセイバッファーが含まれています。略語:ADCC =抗体依存性細胞媒介性細胞毒性;AB = ADCC バイオアッセイバッファー;VEGFR = 血管上皮成長因子受容体;EGFR = 上皮成長因子受容体;mAb=モノクローナル抗体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig03.jpg"> 
図3:ウェスタンブロッティングを用いたBHT-101およびSW-1736甲状腺がんにおけるEGFRおよびVEGFR発現の検出。 EGFRの発現は検出されましたが、VEGFRの発現は検出されませんでした。ローディング制御としてB-アクチンを使用しました。略語:EGFR =上皮成長因子受容体;VEGFR = 血管上皮成長因子。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig04.jpg"> 
(A)甲状腺がん細胞株BHT-101は、抗EGFR抗体セツキシマブの存在下でADCC効果を示す。(B)甲状腺がん細胞株SW−1736は、抗EGFR抗体セツキシマブの存在下でADCC効果を示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

The method for antibody-dependent, cell-mediated cytotoxicity (ADCC) represents an important tool to assess the efficacy of therapeutic antibodies in ...

assessing-antibody-dependent-cell-mediated-cytotoxicity-cancer-cells

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Immunology and Infection

免疫学と感染症

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HA抗体によるFc媒介エフェクター機能の活性化の測定

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固体および造形癌細胞を標的とするキメラ抗原受容体T細胞のリアルタイム効力アッセイ

このプロトコルは、治療用抗HER-2抗体の存在下でナチュラルキラー細胞媒介性乳がん細胞死滅を調節する化合物を同定するための自動化された画像ベースのハイスループット技術を提示します。...

抗体依存性細胞傷害修飾化合物の同定のためのハイコンテントスクリーニングアッセイ(英語)

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ここでは、1つのT細胞とがん標的細胞を内包したダブルエマルジョン液滴を作製し、細胞死を1細胞レベルで調べる方法について述べる。この方法により、大規模なT細胞集団内の細胞傷害性分子と標的細胞のアポトーシスの両方を二重に定量できます。...

キメラ抗原受容体T細胞を単一細胞レベルで評価するための液滴ベースの細胞毒性アッセイ

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抗体依存性細胞傷害レポーターバイオアッセイを用いたがん細胞における抗体依存性細胞媒介性細胞毒性の評価

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