心血管バイオマーカー探索のための血漿由来細胞外小胞の単離、特性評価、およびプロテオミクス解析

バイオマーカーとしての細胞外小胞の循環は、バイオマーカー研究において比較的新しい分野であり、大きな可能性を秘めています。私たちのプロトコルは、救急部門の設定で細胞外小胞結合バイオマーカーの発見と検出を実装するための実践的なアプローチを提供することを目的としています。新たな証拠は、細胞外小胞と循環に見られる分子貨物には、複数の疾患状況で関心のあるタンパク質とRNAが含まれていることを示しています。

いくつかの新しい細胞外小胞の封入バイオマーカーは、さまざまな心血管疾患実体の診断と予後に関連しています。循環する細胞外小胞バイオマーカーの発見の分野における主要な課題は、細胞外小胞の保存とEV放出ダイナミクスに依存する血漿獲得です。したがって、特にプロテオミクスなどの広範な分析方法を適用する場合は、EVの劣化を回避し、再現性のある結果を維持するために、臨床ルーチンに組み込まれた厳格なプロトコルが必要です。

循環EV内に含まれるタンパク質バイオマーカーの発見は、症状の発症に対する最初の採血時間、および自然なEV分解によるサンプルの保存期間に大きく依存します。このプロトコルは、血漿 EV の分離とプロテオミクス分析への導入の実践的なプロトコルを提供し、救急部門の臨床ワークフローに統合します。私たちの今後の研究は、非代償性心不全、不整脈、または頻脈心筋症の患者を含むさまざまな患者集団を方法論に統合することに焦点を当てます。また、バイパス手術を受ける患者の縦断的研究も行います。

このプロトコルを使用して、前述の病状の診断と予後に貢献する新しいEV結合バイオマーカーを特定することを目指しています。人間の血液血漿の遠心分離を開始するには、固定角度ローターを備えた超遠心分離機を使用して、壊れないようにします。破片およびアポトーシスボディが沈殿した後、細胞外小胞を分離するために壊れることなく、100、000 Gで4°Cで2時間のための新しい管そしてultra遠心分離機に上清を移す。

超遠心分離後、チューブを慎重に取り外してください。電動ピペットを使用して上清を穏やかに吸引し、約1ミリリットルの細胞外小胞が枯渇した血漿を残します。1000マイクロリットルのピペットに切り替えて、細胞外小胞ペレットを乱さずに残りの血漿を慎重にピペットします。

ピペッティング中にチューブを徐々に傾けて血漿が残らないようにし、ペレットをPBSに再懸濁します。次に、細胞外小胞ストック溶液を氷冷PBSでさまざまな比率で希釈し、トラッキング中にフレームあたり10〜100ナノ粒子の最終カウント範囲を達成します。NTA機器の電源を入れ、接続されたコンピューターで該当するソフトウェアを起動します。

チャンバーをレーザーケースに挿入し、スタートカメラをクリックしてアクティブにします。1ミリリットルのPBSをシリンジに引き込み、フロントチューブに接続します。チューブシステムを完全に洗い流し、チャンバー内に気泡が残らないようにします。

カメラを監視して、気泡や汚染粒子を検出します。次に、調製した細胞外小胞の作業希釈液を1ミリリットルのシリンジに引き上げ、チャンバーに注入します。[キャプチャ]タブと[プロセス]タブに移動して、モニターの明るさに一致するように画面ゲインを調整します。

カメラレベルを変更して、画面上のナノ粒子の分化を強化します。[プロセス]タブで適切な検出しきい値を設定して、パーティクルをバックグラウンドノイズと区別します。装置の両側にあるフォーカスホイールを使用して、ナノ粒子が画面上に鮮明に表示されるまでカメラの焦点を合わせます。

ハードウェア設定ですべての測定を摂氏22度の一定温度に設定した後、実行ボタンをクリックして測定を開始します。サンプルの実行ごとに、それぞれ30秒のビデオを少なくとも3つ録画します。「変更」をクリックしてサンプルの希釈係数を入力し、最後に「エクスポート」をクリックして結果を保存します。

ナノ粒子追跡分析を使用して、ブラウニーと動きに基づいて細胞外小胞を同定し、視覚化しました。分析により、健康な個人の血漿中の平均粒子濃度は10の10の10の10倍であることが明らかになり、細胞外小胞の存在が実証されました。血漿細胞外小胞の平均サイズは184.7ナノメートルで測定され、典型的な細胞外小胞の寸法と一致しました。