Name: ヒト人工多能性幹細胞からの血管オルガノイド作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: 学ぶ、ヒトiPSC由来血管オルガノイドの均一作製法。ROCK阻害剤とマイクロウェル閉じ込め技術により再現性とスケーラビリティを向上させ、疾患モデリングや形態学的解析への応用が可能となる革新的アプローチです。

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<meta charset="utf8"></head><body>薬物スクリーニングおよび疾患モデリングのための hiPSC 由来血管オルガノイド

<ol><li>Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids-on-a-chip.</a> Science. 364 (6444), 960-965 (2019).</li>
<li>Takebe, T., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+3d+tissue+physiology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Capturing complex 3d tissue physiology in vitro.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 7 (3), 211-224 (2006).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3d+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3d culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Koike, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+human+hepato-biliary-pancreatic+organogenesis+from+the+foregut-midgut+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut-midgut boundary.</a> Nature. 574 (7776), 112-116 (2019).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 26 (2), 215-224 (2008).</li>
<li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li>
<li>Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+blood+vessel+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 14 (11), 3082-3100 (2019).</li>
<li>Wimmer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+vessel+organoids+as+a+model+of+diabetic+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy.</a> Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).</li>
<li>He, S., et al. Mapping morphological malformation to genetic dysfunction in blood vessel organoids with 22q11.2 deletion syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+S+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2021).</li>
<li>He, S., et al. Human vascular organoids with a mosaic akt1 mutation recapitulate proteus syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+S+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+polypharmacology+platform+promotes+cytoprotection+and+viability+of+human+pluripotent+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells.</a> Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).</li>
<li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible%2C+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).</li>
<li>Hwang, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwell-mediated+control+of+embryoid+body+size+regulates+embryonic+stem+cell+fate+via+differential+expression+of+wnt5a+and+wnt11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of wnt5a and wnt11.</a> Proc Natl Acad Sci. 106 (40), 16978-16983 (2009).</li>
<li>Antonchuk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+embryoid+bodies+from+human+pluripotent+stem+cells+using+aggrewell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using aggrewell plates.</a> Methods Mol Biol. 946, 523-533 (2013).</li>
<li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 783-791 (2012).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+brain+microvascular+endothelial+cell-like+cells+suitable+to+study+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Star+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions.</a> Star Protoc. 2 (2), 100563(2021).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Sci Adv. 3 (11), e1701679(2017).</li>
<li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+pericyte-like+cells+induce+blood-brain+barrier+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties.</a> Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).</li>
<li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells%2C+pericytes+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+3D+vascular+and+neuronal+networks+in+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform.</a> Sci Rep. 8 (1), 5168(2018).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Sci Adv. 4 (10), eaat5847(2018).</li>
<li>Sakurai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microengineered+vascularized+bleeding+model+that+integrates+the+principal+components+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis.</a> Nat Commun. 9 (1), 509(2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+biomimetic+pericyte-covered+3d+microvascular+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Engineering of a biomimetic pericyte-covered 3d microvascular network.</a> PLoS ONE. 10 (7), e0133880(2015).</li>
<li>Kosyakova, N., et al. Differential functional roles of fibroblasts and pericytes in the formation of tissue-engineered microvascular networks in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKosyakova%2C+N+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2019).</li>
<li>Whisler, J. A., Chen, M. B., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+perfusable+microvascular+network+morphology+using+a+multiculture+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Control of perfusable microvascular network morphology using a multiculture microfluidic system.</a> Tissue Eng Part C Methods. 20 (7), 543-552 (2013).</li>
<li>Haase, K., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+on-chip+vascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in on-chip vascularization.</a> Regen Med. 12 (3), 285-302 (2017).</li>
<li>Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+models+of+vascular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic models of vascular functions.</a> Annu Rev Biomed Eng. 14 (1), 205-230 (2012).</li>
<li>Boerckel, J. D., Uhrig, B. A., Willett, N. J., Huebsch, N., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+vascular+growth+and+tissue+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of vascular growth and tissue regeneration in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (37), E674-E680 (2011).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nat Methods. 16 (3), 255(2019).</li>
<li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール (1000x)</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>711-546-152</td><td>recomposition with 0.25 mL 50% glycerol,&nbsp; -20 &deg;C 最長 1 年間、希釈倍率: 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>705-606-147</td>は<td>、0.25 mL 50%グリセロールで再構成します。&nbsp; -20°Cで保存します。C 最長 1 年間、希釈倍率:1:1000</td></tr><tr><td>B27 サプリメントからビタミン A を差し引いたもの (50x)</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>4 °C で解凍。C、アリコート、-20°Cで保存。C、凍結融解サイクルを避け</td></tr>てください <tr><td>BMP4</td><td>ProSpec</td><td>CYT-081</td> は、<td>100 ng/&micro の濃度で滅菌 ddH2O で再構成します。L、アリコート、-20°Cで保存。C</td></tr><tr><td>CD31抗体&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab28364</td><td>希釈比:1:400</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>022626001</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>トクリス・バイオサイエンス</td><td>4423/10</td><td>DMSOで12mMで原液を作り、-20°Cで保存します。Cは最長1年間。</td></tr><tr><td>Chroman 1</td><td>Tocris</td><td>7163/10</td>は<td>、100&microでストックソリューションを作成します。MはDMSO付きで、-20°Cで保存します。Cは最長1年間。</td></tr><tr><td>コラーゲンI&nbsp;</td><td>Corning</td><td>40236</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>AXRMP/Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Corning Elplasia プレート</td><td>Corning</td><td>4441</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 自動セルカウンター</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, 粉末</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td>バイオグレードddH2Oで10倍ストック溶液を作成し、0.2&microで滅菌します。mフィルター。4°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>Edi042A</td><td>Cedars Sinai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emricasan</td><td>Medchemexpress LLC</td><td>HY1039610MG</td><td>DMSOを使用して1 mMでストック溶液を作成し、-20°Cで保存します。Cは最長1年間。</td></tr><tr><td>ERG抗体</td><td>Cell Singali Technology</td><td>97249</td><td>希釈比:1:400</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 - プレミアム</td><td>アトランタバイオロジカルズ</td><td>S11150</td><td>4°Cで解凍。C&nbsp;そしてアリコート、で保存&nbsp;-20 °C;Cは最長5年間、または4°Cで保管します。C 最大 1 か月間</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>ProSpec</td><td>CYT557</td> を <td>100 ng/&micro の濃度で滅菌 ddH2O で再構成します。L、アリコート、-20°Cで保存。C</td></tr><tr><td>フルオロディッシュ細胞培養ディッシュ</td><td>ワールド精密機器</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1099</td> は、<td>12 mM の濃度で DMSO で再構成し、分注して -20 °C で保存します。C</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン (50 mg/mL)</td><td>Gibco</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX サプリメント (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Heparin, 100 kU</td><td>MilliporeSigma</td><td>375095100KU</td><td>recomposition with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13998123</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清交換用</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>4°Cで解凍します。C、アリコートと-20°Cで保管。C、凍結融解サイクル</td></tr><tr><td>マトリゲル、GFR基底膜マトリックス</td><td>コーニング</td><td>356230</td>を<td>4°Cで解凍することを避けてください。C、アリコートと-80°Cで保管。C、凍結融解サイクルを避ける</td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (NEAA、100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Biology Grade Water</td><td>Corning</td><td>46000CV</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>1001130</td><td>4 °C で解凍します。C、アリコートと-20°Cで保管。C、凍結融解サイクルN2</td></tr><tr><td>サプリメント(100x)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>4°で解凍しないでください。C、アリコートと-20°Cで保管。C、凍結融解サイクルを避け</td></tr>て<tr><td>NaOH溶液(1 M)</td><td>Cytiva&nbsp;HyClone</td><td>SH31088.01</td><td></td></tr><tr><td>NeuroBasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements, ver 5.42</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>17000121</td><td>10 mL 滅菌 ddH2O で再構成し、4 °C で保存します。C 最大 2 週間の</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、20%</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>15713S</td><td>PBS で希釈</td></tr><tr><td>、20x</td><td>Thermofisher</td><td>28352</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&β; 抗体</td><td>R&D</td><td>AF385</td><td>希釈比: 1:400</td></tr><tr><td>ポリアミンサプリメント (1000x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8483</td><td></td></tr><tr><td>Rapiclear clearing reagent, 1.49</td><td>SUNJIN LAB</td><td>RC149001</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム (7.5%)</td><td>Gibco</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム一水和物</td><td>サーモフィッシャー</td><td>J6228822</td><td>ddH2O で 1% (wt/v) ストック溶液に溶解</td></tr><tr><td>TBST、20x</td><td>Thermofisher</td><td>28360</td><td></td></tr><tr><td>trans-ISRIB</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5284/10</td><td>DMSOで1 mMでストック溶液を作り、-20°Cで保存します。Cは最長1年間。</td></tr><tr><td>トリチン X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルーステイン (0.4%)</td> <td>サーモフィッシャー</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>VEGF-A</td><td>ProSpec</td><td>CYT-116</td> は<td>、100 ng/&micro の濃度で滅菌 ddH2O で再構成します。L、アリコート、-20°Cで保管。ハ</td></tr></tbody></table>

ヒト人工多能性幹細胞からの血管オルガノイド作製

Vascular Organoid Generation from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

図1Aは、各ステージで使用される主要なコンポーネントを含む、このプロトコルのスキームを示しています。分化はEB形成から始まり、中胚葉誘導と血管系譜の仕様が続きました(図1B-D)。凝集体は時間の経過とともに大きくなり、球形が少なくなりました。オルガノイドは5日目から粗いエッジを示し始めました。コラーゲンI基底膜マトリックス混合物に包埋された後、血管内皮細胞と周皮細胞は発芽して成長し、7日目には早くも複雑な血管網を形成しました(図1E)。この修正法の主な目的は、異なる世代のバッチ間のばらつきを最小限に抑えることであるため、2つの独立したバッチからEBサイズを測定し、サイズ測定と統計分析の両方で、この方法の一貫性と均一性を確認しました(図1F)。
血管の分化を検証するために、オルガノイドを包埋前の5日目に採取し、CD31、ERG1、PDGFRβなどの血管マーカーで染色しました。オルガノイドはCD31、ERG1、およびPDGFRβを発現し(図2)、血管内皮細胞と周皮細胞の存在を示しています。
組織をクリアした後、血管ネットワークをホールマウント免疫蛍光顕微鏡で分析しました(図3A)。成熟オルガノイドを、17日目(図3B、ゲルブロック内のサンプル)および28日目(図3C、サンプルをゲルブロックから取り出し、96ウェルプレートで個別に培養した;ゲルブロックから取り出した後、端部の血管網がスフェロイドを包み込むのではなく、ゲルブロックから取り出した後に放射状に拡大するのではなく、CD31、ERG1、PDGFRβで染色した)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig01.jpg"> 図1:血管オルガノイドの生成 (A)血管オルガノイド生成のステップとタイムラインのスキーム。(B-E)さまざまな段階の血管オルガノイドの代表的な明視野画像。スケールバー:100μm.(F)この研究で提示されたマイクロウェル法を使用した2つの異なるEB生成バッチからのEBサイズの統計分析。EB作製ではマイクロウェルあたり1,000細胞を使用し、バッチ1および2ではそれぞれn = 42およびn = 40を使用しました。有意性は ns として表され、有意ではありません。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig02.jpg"> 図2:ゲル包埋前の血管オルガノイドの免疫染色。 内皮マーカー(A)CD31(緑)と(B)ERG1(緑)、および(C)周皮マーカーPDGFRβ(緑)でそれぞれ染色したオルガノイドの代表的な蛍光画像。核をDAPI(青)で対比染色しました。スケールバー:50μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig02large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig03.jpg"> 図3:血管オルガノイドにおける血管ネットワークの免疫蛍光特性評価。 (A)代表的な画像は、組織清浄後のガラス皿にゲルが埋め込まれた血管オルガノイドを示しています。オルガノイドは透明でしたが、385 nmのUV光の下で見えました。(B)17日目の血管オルガノイドの代表的な3Dホールマウント画像。血管オルガノイドは、DAPI(青)、血管内皮細胞マーカーCD31(緑)、および周皮細胞マーカーPDGFRβ(マゼンタ)で染色されました。(C)内皮マーカーCD31(赤)およびERG1(緑)で染色された、28日目に回収された血管オルガノイドの代表的なホールマウント3Dイメージング。スケールバー:150μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig03large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>hiPSC拡張媒体</td>
			<td>500ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>mTeSR Plus 基礎培地</td>
			<td>400ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>mTeSR Plusサプリメント</td>
			<td>100ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>ゲンタマイシン(50 mg / mL)</td>
			<td>1 mLの</td>
		</tr></tbody></table>表1:hiPSC増殖培地の組成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>hiPSC播種培地</td>
			<td>20ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>PSC拡張媒体</td>
			<td>20ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>クロマン1(100μM)</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>エムリカサン (1 mM)</td>
			<td>30μL</td>
		</tr><tr><td>ポリアミンサプリメント(1000x)</td>
			<td>20μL</td>
		</tr><tr><td>trans-ISRIB (1 mM)</td>
			<td>14 μL</td>
		</tr></tbody></table>表2:hiPSC播種培地の組成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>N2B27ミディアム</td>
			<td>100ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F-12、GlutaMAXサプリメント</td>
			<td>48.6ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>ニューロベースルミディアム</td>
			<td>48.6ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>GlutaMAX サプリメント (100x)</td>
			<td>0.5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (NEAA, 100x)</td>
			<td>0.5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>2-メルカプトエタノール (1000x)</td>
			<td>0.1ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>ゲンタマイシン(50 mg / mL)</td>
			<td>0.1ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>N2サプリメント(100x)</td>
			<td>0.5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>ビタミンAを除いたB27サプリメント(50倍)</td>
			<td>1 mLの</td>
		</tr><tr><td>ヘパリン、4 kU/mL</td>
			<td>0.1ミリリットル</td>
		</tr></tbody></table>表3:N2B27培地の組成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>中胚葉誘導培地(MIM)</td>
			<td>3ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>N2B27ミディアム</td>
			<td>3ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>BMP4 (100 ng/μL)</td>
			<td>0.9μL</td>
		</tr><tr><td>CHIR99021 (12 mM)</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr></tbody></table>表4:中胚葉誘導媒体(MIM)の組成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>血管分化培地1(VDM1)</td>
			<td>3ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>N2B27ミディアム</td>
			<td>3ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>フォルスクリン (12 mM)</td>
			<td>0.5μL</td>
		</tr><tr><td>VEGFA(100 ng/μL)</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr></tbody></table>表5:血管分化培地1(VDM1)の組成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>コラーゲンI.混合物</td>
			<td>5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>コラーゲンI.(3.61g/mL)</td>
			<td>2.77ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>10x DMEM/F12 ミディアム</td>
			<td>0.5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>重炭酸ナトリウム、7.5%</td>
			<td>0.5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>HEPES、1メートル</td>
			<td>0.5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>H2O(ヘリウム2O)</td>
			<td>0.73ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>NaOH、1M</td>
			<td>75 μL</td>
		</tr></tbody></table>表6:コラーゲンI混合物の組成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>コラーゲンI - 基底膜マトリックス混合物</td>
			<td>6.5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>コラージュIミックス</td>
			<td>5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>マトリゲル(10 mg / mL)</td>
			<td>1.5ミリリットル</td>
		</tr></tbody></table>表7:コラーゲンI基底膜マトリックス混合物の組成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>血管分化培地2(VDM2)</td>
			<td>5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F-12、GlutaMAX™サプリメント</td>
			<td>3.67ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>ゲンタマイシン(50 mg / mL)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (NEAA, 100X)</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr><tr><td>2-メルカプトエタノール (1000x)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>ヘパリン、4 kU/mL</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>ノックアウトセラム交換</td>
			<td>0.75ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>FBSの</td>
			<td>0.5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>VEGFA(100 ng/μL)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>FGF2 (100 ng/μL)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr></tbody></table>表8:血管分化培地2(VDM2)の組成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ブロッキングバッファ</td>
			<td>50ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>ロバの美容液</td>
			<td>2.5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>トゥイーン 20</td>
			<td>0.25ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>トリトンX-100</td>
			<td>0.25ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム溶液(1%、wt/v)</td>
			<td>0.5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>PBSの</td>
			<td>46.5ミリリットル</td>
		</tr></tbody></table>表9:免疫染色用ブロッキングバッファーの組成。

Vascular organoids derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) recapitulate the cell type diversity and complex architecture of human ...

vascular-organoid-generation-from-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このビデオは、人工多能性幹細胞からヒトの脳オルガノイドを生成する方法を示しています。これは、ニューロスフェアが神経外胚葉層を形成し、それが他の胚葉の形成を抑制する方法を示しています。ニューロスフェアは3Dゲルマトリックスに埋め込まれ、ニューロ上皮芽を形成します。オルガノイド培地とインキュベートすると、これらの神経上皮芽は特定の脳領域に分化し、成熟した脳オルガノイドが形成されます。...

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開発、展開、および<em生体内で&gt;</em&gt;ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）からヒトNK細胞のモニタリングとや人工多能性幹細胞（性IPSC）

学ぶ、ヒトiPSC由来血管オルガノイドの均一作製法。ROCK阻害剤とマイクロウェル閉じ込め技術により再現性とスケーラビリティを向上させ、疾患モデリングや形態学的解析への応用が可能となる革新的アプローチです。

ヒト人工多能性幹細胞からの血管オルガノイド作製

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