Name: レシオメトリック蛍光共鳴エネルギー移動によるDNase活性の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: 学ぶレシオメトリックFRETアッセイによるDNase活性の定量評価法。pHや温度などの実験条件が酵素活性に与える影響をリアルタイムで解析し、弱いヌクレアーゼ活性の高感度検出に応用できます。

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レシオメトリック蛍光アプローチは、単一のシグナルの強度のみに依存するのではなく、蛍光シグナルの比率を使用する分析方法です1,2。この比率を使用する利点は、内部校正を提供し、サンプルとプローブの濃度、機器パラメータなどの変動など、多くのランダムな要因を補正できることです。これにより、蛍光プローブの精度と感度が向上します。
フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)プローブの特定のコンテキストでは、「レシオメトリック」という用語は、測定がFRETドナーとアクセプター蛍光色素のペアからの2つの発光信号の比率に基づいているという事実を指します。標的分析種の活性を定量するために、レシオメトリックFRETプローブは、アクセプター/ドナー放出強度の比率(または、場合によっては逆ドナー/アクセプター比)を使用します。この比率は、FRET効率に直接関係しています。バックグラウンドノイズを最小限に抑え、照明条件とプローブ濃度の変動を考慮した自己正規化メカニズムを提供します3。
レシオメトリック法の最近の興味深い用途には、循環腫瘍DNA(ctDNA)4,5の検出のためのレシオメトリック電気化学バイオセンサーでの使用、アポトーシスの食作用期のFRET検出のためのブラウン運動動力バイオナノマシンでの使用6、およびFRET標識の発現および食作用クリアランスの分析7が含まれます.この研究で説明されているレシオメトリックFRETアプローチは、DNase活性の定量的評価に役立ちます。アッセイ測定は、FRETペア排出量の比率に基づいています。このアッセイは、わずかで遅いDNA切断も検出できるため、より長い観察期間を必要とする弱い核分解活性の調査や、さまざまなpHレベルでの実験に特に適しています。
ここでは、レシオメトリックFRETアッセイのいくつかの特定の利点が、弱いヌクレアーゼ-白血球エラスターゼ阻害剤(LEI)のDNase活性を研究するためのその応用によって説明されています。レポートには、詳細なプロトコルとステップバイステップの手順とレシオメトリック データ分析の説明が含まれています。
レシオメトリックFRETプローブの説明
レシオメトリックFRETプローブは、FAM-TAM(フルオレセイン-テトラメチルローダミン)のドナー-アクセプターFRETペアを保有する自己相補的な38merDNAオリゴです。その配列は5'-AAGGGT(TAM)CCTGCTGCAGGACCCTTAACGCATTATGCGT(FAM)T-3'です。自己ハイブリダイジング38-merは、23ヌクレオチドと15ヌクレオチドの2つの接続されたヘアピンからなるステープル形状のコンフォメーションを想定し、2つの蛍光色素を互いに23.8 Å位置に配置します。これは、このペアのフェルスター半径、R0 = 55 Å8よりも大幅に近いです。このような位置決めは、ドナーからアクセプターへのエネルギー伝達の非常に高い効率に対応する7:EFRET = 0.993477。その結果、FAM励起波長(488nm)で照射すると、FRETプローブはアクセプタTAMの発光波長(580nm)で蛍光を発光するのに対し、FAM発光(525nm)は抑制されます。
図1A は、UNAFoldが予測したプローブの二次構造を示しており、タイトな曲率による立体障害により、両方のヘアピン頂点に小さなループがあります。FRETプローブによるDNA切断検出の概略図を 図1Bに示します。これは、DNaseによるオリゴプローブの破損がFRETペアを分離することを示しています。この分離により、プローブ内の両方の蛍光色素の発光スペクトルに劇的な変化が生じます。 図1C は、切断前後のプローブ発光スペクトルを示し、DNase IIプローブ切断後のFRETペアの分割が525 nm(ID 525 nm)でのドナー発光を増加させ、同時に580 nm(IA 580 nm)でのアクセプター発光を減少させることを示しています。 図1D は、発光スペクトルに対応するPAGEゲル比とFRET比を示しています。DNase IIプローブの切断により、12-16-mer FAM(緑)および20-24-mer TAM(赤)フラグメントに対応する2つの広いバンドが生成され、ヘアピン間の接続領域の近くでT23 の両側に38-merがランダムに切断されていることを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5.jpg"> 
図1:レシオメトリックFRETプローブの構造と動作。 (A)UNAFoldによって生成されたFRETプローブの予測二次構造。(B)動作中のFRETプローブの概略図。レシオメトリックFRETプローブは、FRETドナー(FAM)とアクセプター(TAM)を23.8 Åの有効FRET距離で標識したステープル形状の38merオリゴヌクレオチドで、&gt;99%のFRET効率を保証します。DNaseによるオリゴプローブの切断はFRET対を分離し、FRETを廃止します。(C)DNase IIを介した切断前後のFRETプローブの発光スペクトル。切断前に、FAM放出が抑制され、TAM放出が顕著になります。DNaseを介した切断により、FAMとTAMが分離され、FAM発光(525 nmピーク)が回復し、TAM発光(580 nmドロップ)が廃止されます。λ励起 = 488 nm。(D)DNase II切断前後のFRETプローブのレシオメトリックおよび電気泳動評価。上のパネル:FRET比(RD/ A = ID 525 nm / IA 580 nm)は、プローブ状態の定量的尺度を表します。赤:未切断;緑:DNase II切断。下のパネル:蛍光データに対応する変性PAGEゲル。DNase II切断により、FAM標識フラグメント(12-16 nt、緑)およびTAM標識フラグメント(20-24 nt、赤)が得られ、T23に隣接するヘアピン間の接続付近で切断が見られます。未切断の対照は黄色の蛍光を示します。ラダー:38-merプローブの5'および3'セグメントに対応するFAMおよびTAM標識オリゴヌクレオチドで、元の位置に蛍光標識があります。反応条件:10 mM酢酸ナトリウムバッファー(pH 5.2)、1 pmol/μL FRETプローブ、0.0033 U/μL DNase II、37°Cで24時間。 RD / A = ID 525 nm / IA 580 nm; λ励起 = 488 nm。UNA変更条件:1 μM FRETプローブ、10 mM Na+、0 mM Mg2+、37°C。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
個々のテスト発光スペクトルの変化は明らかですが、多数の発光スペクトル間の定量的比較には、よりユーザーフレンドリーでコンパクトな定量パラメータが必要です。この役割は、FRET比によって果たされます。提示された蛍光法は、定量的評価のためにFRETペアメンバーの蛍光放出の直接(2チャネル)比に依存するレシオメトリックアプローチのグループに属します2,9。
このアプローチでは、FRET効率に関係するドナー/アクセプター放射比(RD/ A = I D 525 nm / IA 580 nm)を使用し、38-merの状態(破損または無傷)を定量的に特徴付けます。ID / IA比は、プローブ濃度、励起強度、光退色などの要因の変動を本質的に考慮する自己正規化メカニズムを提供します3。このアプローチは、ドナーとアクセプターが同じプローブ内でリンクされており、それらの比率が既知で一定であるFRETプローブにのみ適しています。このため、このアプローチでは、アクセプターまたはドナークロストーク2の直接励起を考慮する必要はありません。プローブの固定ドナー-アクセプター化学量論により、ドナー/アクセプターの放出比がこれらの変動の影響を受けず、プローブの状態を直接反映します。その結果、ドナー-アクセプター放出の比率は、シグナル正規化2,3を内蔵した定量的DNA切断パラメータを提供します。
この比率はプローブ切断後のFRET停止を表し、したがって切断の増加とともにDNase活性が増加するのと同じ方向に変化するため、アッセイは(反対のIA / ID比ではなく)ID / IA比を採用しています。これは、図1Dで示されており、DNase IIによる切断前後のレシオメトリックプローブとそのPAGE電気泳動のFRET比を示しており、どちらも図1Cのスペクトルに対応しています。レシオメトリックFRETアッセイの利便性、時間の経済性、および使いやすさを実証するために、弱いヌクレアーゼ-白血球エラスターゼ阻害剤(LEI)のDNase活性を明らかにし、研究するために適用されました。
弱いヌクレアーゼLEI
プロテアーゼ阻害剤LEIは、自然に準安定、つまりトポロジー的に不均衡です。この機能は、その抑制メカニズムに不可欠です。標的プロテアーゼがLEI反応部位ループ(RSL)を切断すると、プロテアーゼ阻害剤分子は劇的な立体配座変化を起こし、プロテアーゼを機械的に不活性な形態に伸ばします10,11。驚くべきことに、これはLEI分子自体も破壊および膨張させ、そのネイティブフォールドで覆われている不可解なDNase部位のマスクを解除し、LEIを活性エンドヌクレアーゼL-DNase II(LEI由来DNase II)に変換します11,12。不可解なDNase部位は、硫酸10,13中でのpH 2での一晩のインキュベーションによって引き起こされるLEIの変性と破損によっても露出する可能性があります。LEIを研究するためにこのFRETアッセイを利用したことで、LEIの潜在的な核分解活性を明らかにするために、過酷な化学的変性処理と標的酵素切断が厳密に必要ではないことが実証されました。
提示されたレシオメトリックFRETアプローチのアプリケーションとプロトコルは、通常の非変性LEIに本質的に存在する弱いDNase活性の発見を説明しています。未切断LEIの固有の核分解能力の発見とその分析は、異なる酸性pHレベルでの長時間の観察にアッセイが適しているため可能でした。

<table><tbody><tr><td>96ウェルプレート</td><td>隼</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>DNA FRETプローブ</td><td>IDTのDNA</td><td></td><td>5'-AAG GGT(TAM)CCT GCT GCA GGA CCC TTA ACG CAT TAT GCG T(FAM)T- 3';FAM &ndash;フルオレセイン-dT;&nbsp;TAM &ndash;テトラメチルローダミン-dT.&nbsp;</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>EVOLTデジタル一眼レフカメラ</td><td>オリンポス</td><td>E500型</td><td></td></tr><tr><td>電源付きゲル電気泳動装置</td><td>バイオラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レイ</td><td>ノボプロテイン</td><td>CJ01</td><td></td></tr><tr><td>LiCORゲルイメージングシステム</td><td>リコル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>インビトロゲン</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>プレキャストPAGEジェル</td><td>インビトロゲン</td><td>EC68852</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム緩衝液 pH 5.2</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S2899-100MLの</td><td></td></tr><tr><td>分光蛍光光度計</td><td>テカン</td><td></td><td>サファイア2</td></tr></tbody></table>

レシオメトリック蛍光共鳴エネルギー移動によるdnase活性の評価

Assessment of DNase Activity by Ratiometric Fluorescence Resonance Energy Transfer

この代表的な研究は、長時間の観察を必要とする遅い酵素反応を調査するためのレシオメトリックFRETアプローチの特定の利点を強調しています。特に、このアプリケーションは、レシオメトリックFRETシステムを使用して、LEIの固有のDNase活性の検出と分析を実証します。この研究の結果を 図2に示します。
このアプローチを用いて、LEI が弱酸 性条件下で、切断や過酷な化学処理による酵素活性化を必要とせずにDNase活性を示すことを実証しました。この核分解活性はLEIの固有の特性であり、pH≤5.5の溶液中で検出可能であると判断しました。大きさは控えめではありますが、活性は非常に安定しており、pHは4.8〜5.2の間で最適で、DNase IIファミリーメンバーのpHと同様でした15。しかし、DNase IIとは異なり、pH 5.5を超え...

レシオメトリック蛍光共鳴エネルギー移動によるDNase活性の評価

The present protocol describes a simple and sensitive ratiometric F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) assay for the detection and quantitative ...

assessment-dnase-activity-ratiometric-fluorescence-resonance-energy

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