Name: 小脳器官型培養物を用いたプルキンエ細胞のDNA損傷応答の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぶ小脳器官型培養を用いたプルキンエ細胞のDNA損傷応答可視化法。ATM欠損マウスモデルで運動失調症の小脳変性メカニズムを解明し、神経変性疾患の治療戦略への貢献を目指す。

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<meta charset="utf8"></head><body>小脳プルキンエ細胞:器官型培養におけるDNA損傷応答

<table><tbody><tr><td>試薬および機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 x 30 cm シャー</td>レ <td>Corning Inc.</td><td>3261</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mmシャーレ</td><td>コーニング社</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-1L</td><td></td></tr><tr><td>接着顕微鏡スライド</td><td>Marienfeld</td><td>48187</td><td>76 x 26 x 1 mm</td></tr><tr><td>チョッパー用ブレード</td><td>TED PELLA</td><td>Model TC752-1</td><td>&nbsp;スタイルカミソリ刃BME</td></tr><tr><td></td><td>GIBCO</td><td>41010-026 500ml.&nbsp;</td><td>L-Glut なし</td></tr><tr><td>細胞培養は</td><td>、ミリポア</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>生物学的インド</td>を挿入します。<td>02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS w/o フェノールレッド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1138-500L</td><td>No Ca+,No Mg+</td></tr><tr><td>HBSS with フェノールレッド</td><td>ザルトリウス</td><td>02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>馬用血清&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>26050088</td><td>熱不活性化</td></tr><tr><td>虹彩鉗子</td><td>CellPath</td><td>GZX-0100-00A</td><td>130mm 鈍い鋸歯状</td></tr><tr><td>虹彩ヘラ</td><td>F.S.T</td><td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322412-1L</td><td></td></tr><tr><td>メタノール&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウント</td><td>(GRIGENE なし)。Ltd、イスラエルK239320A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラコート</td>シ<td>グマ-アルドリッチ</td><td>856177-250MG</td><td>パラコート二塩化物(メチルビオロゲン)</td></tr><tr><td>PARG-ポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ阻害剤</td><td>トクリスバイオサイエンス、英国</td><td>PDD 00017273</td><td>光感受性&nbsp;</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝液</td><td>生物学的インド。</td><td>02-018-1A</td><td></td></tr> は<tr><td>さみ、皮膚組織</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>コーニング社製</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>スペアチョッピングディスク&nbsp;</td><td>TED PELLA</td><td>モデル 10180-01</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュチョッパー</td><td>McIlwain</td><td>モデル TC752</td><td>10180-220</td></tr><tr><td>ピンセット、ポインテッド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウリンナリー カップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 ロバ アンチ ウサギ IgG</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:500; 二次抗体;二次希釈バッファー;&nbsp;室温で2時間のインキュベーション</td></tr><tr><td>抗グリア線維性酸性プロチエン</td><td>ミリフォア</td><td>MAB3402</td><td>1:1500; 一次抗体; ブロッキング;ホスト:マウス</td></tr><tr><td>抗カルビンジン-D-28K</td><td>Swant&nbsp;</td><td>CB300</td><td>1:2000; 一次抗体; ブロッキング; 宿主: ウサギ&nbsp;</td></tr><tr><td>抗カルビンジン-D-28K</td><td>スワント</td><td>CB-38a</td><td>1:2000; 一次抗体; ブロッキング&nbsp;</td></tr><tr><td>抗パン-ADP-リボース試薬</td><td>ミリフォア</td><td>MABE1016</td><td>1:800; 一次抗体; ブロッキング; 室温で 2 時間インキュベーション</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-ジアミジン-2'-フェニルインドール二塩酸塩)</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>4084</td><td>1:1000; 二次希釈バッファー; 室温で 20 分間インキュベーション</td></tr></tbody></table>

小脳器官型培養物を用いたプルキンエ細胞のdna損傷応答の可視化

Visualizing the DNA Damage Response in Purkinje Cells Using Cerebellar Organotypic Cultures

図1は、小脳器官型培養の一般的な外観を示しています。 図1A の上段は培養で維持される小脳葉状化を示し、下段はカルビンジンD-28kで染色されたPC(緑)とNeuNで染色された神経核(赤)を示しています。 図1Bでは、PCのアストロサイト(赤)を、中間フィラメントIII型タンパク質であるGFAP(緑)について染色しています。 図2 および 図3 は、これらの培養物を2つのDNA損傷剤(どちらも強酸化剤)である臭素酸カリウム(最終濃度10 mM、12時間)およびパラコート)で処理した後に観察されたPAR染色を示しています。PAR応答は、対照群と比較して、小脳葉で処理されたPCでマークされました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig01.jpg"> 図1:マウスの小脳器官型培養の概要 (A)上の行は、培養物で維持されている小脳の葉を示しています。一番下の行はPCレイヤーに焦点を当てています。PCはCalbindin D-28k(緑)で強調表示されています。NeuN染色(赤)は、層全体のニューロン核を同定します。(B)PCを詳しく見る(赤)。GFAP(緑)は、アストロサイトを際立たせる中間フィラメントIII型タンパク質です。スケールバー = 968.8 μm (A、上段)、42.1 μm (A、2 段目)、72.7 μm (B、上段)、18.2 μm (B、2 段目)。略語:PC = Purkinje cells;GFAP = グリア線維性酸性タンパク質;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig02.jpg"> 図2:臭素酸カリウムで処理した小脳切片のPAR染色。 小脳切片は、強力な酸化剤である臭素酸カリウム(KBrO3)で、最終濃度10 mMで12時間処理しました。スケールバー = 775 μm。略語:PAR = poly(ADP-ribose);DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig03.jpg"> 図3:スーパーオキシドアニオンの強力な生産者であるパラコートに曝露された小脳切片におけるPAR応答。 (A)小脳葉の一般的な見方。制御器と比較して、特に PC での PAR 応答が堅牢であることに注意してください。(B)より詳細な調査では、PCや他の細胞タイプでのPAR応答が示されています。スケールバー = 193.8 μm (A)、18.2 μm (B)。略語:PAR = poly(ADP-ribose);DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:border="1.5pt solid">ソリューションとバッファー</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid"></td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">解決  </td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">ざいりょう</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">解剖媒体</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0.5%のD-グルコースを含むハンクの平衡塩溶液(HBSS)。0.5 mLの50%D-グルコース溶液を、Mg2+ およびCa2+を含まない50 mLのHBSSに加えます。</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">BME培地</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">フェノールレッドを含み、L-グルタミンまたはHEPESを含まない100 mLのBasal Medium Eagle(BME)を、フェノールレッドを含むHBSS50 mL、熱不活化ウマ血清50 mL、50 mLの50%D-グルコース、および1 mLの200 mM L-グルタミンと混合します。.無菌環境で0.22μmフィルターで混合し、ろ過します。4°Cで保存</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">免疫染色用ブロッキング溶液</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0.1 M リン酸バッファー中:0.5% Triton X-100、10% ヤギ血清を添加してください。</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">二次抗体希釈バッファー</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0.1 M リン酸バッファー、0.2%Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">ウォッシュバッファー</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0.1 M リン酸バッファー、0.2%Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">固定液</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">アクテノ:メタノール (1:1 v:v)</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">透過化ソリューション</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0.1 M リン酸バッファー、1%Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">DAPIソリューション</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">1x PBSで1 μg/mLに希釈したストック溶液(2 mg/mL)</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">リン酸バッファー</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">AとBの2つのソウルをご用意ください(下記参照)。以下に指定される比率に従って溶液を混合し、0.2 Mリン酸緩衝液を作製します。次に、0.2M溶液を重水素減少水(1:1)で希釈して、0.1Mリン酸緩衝液(作業溶液)を作ります。</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">溶液A(0.2 M用)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">12 gのリン酸ナトリウム一塩基性無水物(Na2HPO4 FW 141.96) 500 mLの重水素減少水</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">ソリューションB(0.2 M用)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">14.2 gのリン酸ナトリウム二次塩基性無水物(Na2HPO4 FW 141.96) 500 mLの重水素減少水</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">0.2 Mを作るための混合溶液</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">1Lを調製します:溶液A230mLと溶液B770mL</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">0.1 M リン酸バッファー</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">混合溶液を重水素減少水(1:1)で希釈します。</td>
		</tr></tbody></table>表1:ソリューションとその組成。

小脳器官型培養物を用いたプルキンエ細胞のDNA損傷応答の可視化

Cerebellar Purkinje cells (PCs) exhibit a unique interplay of high metabolic rates, specific chromatin architecture, and extensive transcriptional ...

visualizing-dna-damage-response-purkinje-cells-using-cerebellar

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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