Name: ラットの正中開腹術による可逆性内臓動脈虚血、静脈うっ血、および複合灌流不良の制御 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 57 s
Description: 学ぶラットの正中開腹術による可逆性内臓動脈虚血・静脈うっ血の制御法。ハイパースペクトルイメージングを用いて4種類の灌流不良状態を検証し、生体内での診断技術向上に貢献する標準化された手術プロトコルです。

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ここに記載されているすべての動物活動は、認定施設で実施され、ドイツのカールスルーエにあるバーデン・ヴュルテンベルク州地域評議会の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました(35-9185.81 / G-62 / 23)。実験動物は、制度上の基準、動物の使用と世話に関するドイツの法律、欧州共同体理事会の指令(2010/63/EU)、およびARRIVEガイドラインに従って管理されました。注文重量400グラムの雄Sprague Dawleyラットを、1週間順応させた後、使用しました。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。
1.麻酔と鎮痛
<ol><li>施設のプロトコルに従って、ラットに薬を麻酔します。イソフルランは鎮静の誘導に推奨されます 100 mg / kg体重ケタミンと4 mg / kg体重キシラジンのi.P注射。.追加の鎮痛は、5 mg / kg体重カルプロフェンの皮下注射で達成できます。.詳細については、Studier-Fischer et al.13を参照してください。</li>
	<li>眼科用軟膏を目に塗布して乾燥を防ぎます。</li>
	<li>外科用鉗子によるつま先ピンチテストを使用して、適切な鎮痛深さを保証します。</li>
	<li>手術中の麻酔の深さを定期的に再評価し、調整してください。</li>
</ol>2. 手続きの準備
<ol><li>取り外し可能な微小血管クランプとアプリケーター(図2A-C)、鈍いオーバーホルトクランプ、細かい準備はさみ、鉗子など、必要なすべての材料と器具を使用してスクラブテーブルを準備します。<ol><li>カニューレを先端から1cmの角度で135°の角度で折りたたんで手術準備フックを準備し、ルアーロック を介して プラスチック製の灌流チューブに接続し、外科用蚊クランプを使用して張力を加える準備ができています(図2D、E)。</li>
	</ol></li>
	<li>Studier-Fischer et al.13で指定されているように、Y字型の固定ロッドと加熱パッドを含むげっ歯類の外科的曝露装置を準備します。</li>
	<li>新生児用フェイスマスクを使用して100%酸素を吸入 することにより 、適切な酸素化が達成されることを確認します(図2F)。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67171/67171fig02.jpg"> 図2:実験装置と動物実験のセットアップ(A)必要な手術器具と材料。(B,C)取り外し可能な微小血管クランプとアプリケーター。(D,E)灌流チューブに接続された折り畳まれたカニューレは、外科的準備フックとして使用されます。(F,G)ネズミモデルにフェイスマスクで酸素を投与し、髭を剃りました。(H)腹部全体の長さにわたる皮膚切開。(I-M)剣状突起の切除と止血。(N-Q)肝動員と鎌状靭帯の解剖(矢印1)。(R)開腹術後の臓器の露出のための準備フックと金属のスタンドの適用。(S)鈍いフック(矢印2)、シリコン血管ループ(矢印3)、および外科的湿布(矢印4)を使用した腹部主要血管の完全な内臓露出。(T,U)腹部大動脈と大静脈。(V)非外傷性調製器具。(W)加湿コットンスワップ(矢印5)。(X)鉗子(矢印6)と鈍いオーバーホルトクランプ(矢印7)の加湿湿布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67171/67171fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
3. 手術の準備
<ol><li>正中線開腹術のために外科的アクセス部位を剃ります(図2G)。目的の腹部の長さ、つまり約7cm(図2H)にわたって皮膚切開を行い、筋膜を解剖して開腹術を進め、付属のプラスチックチューブと外科用蚊クランプで外科用準備フックを皮膚に縫い付けます。手術準備フックを使用して手術現場を露出させ、組織に張力を加えます。</li>
	<li>腹膜が胸骨の始点から数ミリメートル下までのみ頭蓋で解剖され、腹膜の一部が無傷のままであることを確認してください。外科的湿布の一部を胸骨の下に置き(図2I)、強力な材料ハサミで剣状突起を切除します。外科的湿布を使用して切除領域に圧力をかけ、この十分に灌流された領域の十分な止血を達成します(図2I-M)。</li>
	<li>肝臓を背尾方向に動員して鎌状靭帯を露出させ(図2N)、靭帯を解剖します(図2O-Q)。</li>
	<li>止血制御のために、主要な血管のクランプを行う場所に応じて、腹部の主要な血管(図2R)とシリコン血管ループで吊り下げられた血管(図2S-U)の完全な内臓露出を行います。加湿綿スワップ(図2W)、鉗子の加湿湿布、鈍いオーバーホルトクランプ(図2X)など、非外傷性の準備器具のみを使用する必要があります(図2V)。</li>
</ol>4. 動脈虚血に対する腹部大動脈の作製と結祥
<ol><li>非外傷性調製器具を使用して上腹部臓器の左内側形成を行い、左副腎動脈にアクセスします(図3A-D)。</li>
	<li>通常、左副腎動脈の頭蓋伸展の内側にある脈動部位を特定し、大動脈の経過を示します(図3E)。腹部大動脈にアクセスするために、鈍的解剖用のオーバーホルトクランプを使用して軟部組織を進行します(図3F、G)。</li>
	<li>鈍いオーバーホルトクランプ(図3H-L)を使用して腹部大動脈を最も頭蓋端にトンネルし、シリコン血管ループ(図3M-T)を使用して大動脈をスリングします。</li>
	<li>シリコンループを使用して適切な動脈瘤微小血管クランプを適用し、大動脈を腹側にわずかに脱臼させ、動脈瘤微小血管クランプをシリコンループに沿ってガイドして、孤立した大動脈クランプを保証します(図3U)。研究課題によっては、微小血管クランプを再度解放することができます。</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67171/67171fig03.jpg"> 図3:腹部大動脈の準備とクランプ(A)内臓の露出。(B-E)左副腎動脈にアクセスするための非外傷性製剤器具を使用した上腹部臓器の左内側形成。(F,G)腹部大動脈にアクセスするために、脈動部位 (灰色の矢印) で左副腎動脈の内側を鈍く解剖します。(H-L)鈍いオーバーホルトクランプを使用した腹部大動脈のトンネリング。(M-T)シリコン製の血管ループを使用して大動脈を吊り下げます。(U)シリコーンループをガイダンスとして使用した取り外し可能な動脈瘤微小血管クランプの適用。(V-Z)腹腔動脈(オレンジ)を大動脈(赤)とシリコン血管ループを基準にした視覚化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67171/67171fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
5.静脈うっ血のための肝上腹部腔静脈の準備とクランプ
<ol><li>非外傷性調製器具を使用して肝臓を右に動員し、肝靭帯を鋭く解剖し、さらに肝臓を側方化します(図4A-C)。</li>
	<li>鈍いオーバーホルトクランプを使用して、ダイヤフラムの左心筋で肝後腔を開きます(図4D-G)。</li>
	<li>鈍いオーバーホルトクランプ(図4H-K)を使用してキャバル静脈をトンネルし、シリコンベッセルループ(図4L-O)を使用してキャバル静脈をスリングします。</li>
	<li>シリコンループを使用して適切な動脈瘤微小血管クランプを適用し、大静脈を腹側にわずかに脱臼させ、動脈瘤微小血管クランプをシリコンループに沿ってガイドして、大静脈の孤立したクランプを保証します(図4R)。</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67171/67171fig04.jpg"> 図4:肝上腹部大静脈の準備とクランプ。 (A)頭蓋内臓の露出。(B)肝臓の組織保護動員と非外傷性調製器具を使用した肝臓靭帯の鋭い解剖。(C)肝臓の側方化。(D-G)横隔膜の左腱部での肝後腔の開口部と準備。(H-K)鈍いオーバーホルトクランプを使用したキャバル静脈(青)のトンネリング。(L-O)シリコン製の血管ループを使用してキャバル静脈をスリングします。(P、Q)キャバルの血流を一時的に制限するための緊張の働き。(R)シリコーンループをガイダンスとして使用した取り外し可能な動脈瘤微小血管クランプの適用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67171/67171fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
6.腹部大動脈と腹部上腹部大静脈のクランプによる複合灌流
<ol><li>大動脈と大静脈の両方がシリコン血管ループで吊り下げられるまで、上記の手順を実行します。両方の血管に動脈瘤微小血管クランプを再度適用し、シリコンループをガイダンスとして使用します。最初に大動脈をクランプし、その後のキャバルクランプまでに必要な時間を数秒に抑えることをお勧めします。 注:所望のシナリオと研究目的に応じて、灌流不良は定義された期間を超えて継続または解放することができ、動物は鋭い心臓摘出術(施設が承認したプロトコルに従う)によって安楽死させることができる 非生存アプリケーションの場合、または計画されたフォローアップと生存実験の場合には外科的縫合糸を使用して段階的な腹部閉鎖を受けることができる。本研究では、動物を安楽死させました。</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>内臓臓器灌流研究のためのラットモデル

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<li>Łagosz, P., Sokolski, M., Biegus, J., Tycinska, A., Zymlinski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+intra-abdominal+pressure%3A+A+review+of+current+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Clin+Cases%22%5BJournal%5D)">Elevated intra-abdominal pressure: A review of current knowledge.</a> World J Clin Cases. 10 (10), 3005-3013 (2022).</li>
</ol>

局所的または全身的な組織灌流障害の形での組織灌流剥奪の影響は長い間認識されてきましたが、米国とヨーロッパの両方で罹患率と死亡率の主要な原因の1つとして存続しています1。これらの灌流不良状態は、悪性腫瘍と敗血症性炎症に次ぐ組織劣化の3番目に主要な原因ですが、後者の2つと比較してはるかに幅広い起源を持っています2。
このスペクトルは、血栓塞栓性閉塞を伴う心房細動、血管収縮、医原性または外傷性解離などの局所的なメカニズムから、心不全やショック、敗血症、血液量減少、盗み現象などの全身的なメカニズムまで多岐にわたります。これらの多様なメカニズムは、さまざまな医学的および外科的状態の根底にあります。これらの状態に関連する重大な罹患率と死亡率は、壊死を未然に防ぎ、臓器機能を回復させるために、数十年にわたって灌流不良組織への血流を回復させる手順に医学的注意を向けてきました3。
この研究努力は、バイパス手術4、血管内手術5、体外膜型人工肺6,7、移植中の臓器器灌流8、人工血液代替品9の進歩など、生理的臓器灌流を回復するためのさまざまな医薬品、医療、および外科的解決策をもたらしました。
しかし、これらの重要な進展にもかかわらず、特に内臓の灌流不良は、患者ケアにおける差し迫った問題であり、生物医学的プロセスとレスキュー戦略に関するさらなる研究に対する需要は高いです。この種の研究を可能にするためには、有効な生物学的モデルが最も重要です。組織灌流研究には、細胞生物学だけでなく、血管の微小解剖学やレオロジーも含まれる多因子的な側面があるため、適切なモデルには、完全なモデル生物のみが提供できるある程度の生物学的複雑さが必要であり、げっ歯類は当然の選択肢となるモデルです。
組織灌流不良は、孤立性動脈虚血、孤立性静脈鬱血、および複合灌流障害の3つの異なる状態に区別できます10。これらの状態の臨床的に関連するシナリオには、(1) 動脈虚血: 血栓塞栓を伴う心房細動、敗血症性塞栓症、血管収縮、医原性または外傷性血管解離またはクランプ、心不全またはショック、大動脈解離、敗血症および血液量減少、外部狭窄による極端な動脈閉塞、肺動脈塞栓症、慢性動脈血管閉塞性疾患、または盗用現象;(2)静脈うっ血:医原性または外傷性の血管解離または結穹、心不全、肝線維症または肝硬変、外部狭窄による静脈閉塞、静脈血栓症、静脈不全、およびBudd-Chiari症候群;(3)複合灌流不良:虚血性線維症による二次性静脈うっ血や鬱血性貯留による二次性動脈虚血など、上記の状態と前述の状態の進行段階の組み合わせ、および虚血性炎症(虚血性大腸炎など)などの特定の臓器状態11,12。
したがって、この記事では、図 1 に示すように、ラットの正中線開腹術による制御された可逆的な内臓動脈虚血、静脈うっ血、および複合灌流誤を誘発するための段階的なモデルを提供することを目的としています。この実験モデルは、動脈虚血、静脈うっ血、およびそれらの複合的な後遺症の多面的なダイナミクスを研究するための制御された環境を提供し、さまざまな条件で遭遇する臨床的に関連性のあるシナリオをエミュレートします。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67171/67171fig01.jpg"> 図1:プロトコルの概要。 血管ラットの解剖学的構造の概略図とクランプ部位の描写(灰色の矢印)。(A)生理的灌流。(B)動脈虚血。(C)静脈うっ血。(D)複合灌流不良。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67171/67171fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>非外傷性調製鉗子</td><td>Aesculap</td><td>FB395R</td><td>DE BAKEY ATRAUMATA 非外傷性鉗子、ストレート</td></tr><tr><td>ブラントオーバーホルトクランプ</td><td>Aesculap</td><td>BJ012R</td><td>BABY-MIXTER 調製および結紮クランプ、曲げ、180 mm</td></tr><tr><td>カニューレ</td><td>BD (Beckton, Dickinson)</td><td>301300</td><td>BD Microlance 3 カニューレ 20 G</td></tr><tr><td>固定ロッド</td><td>legefirm</td><td>500343896</td><td>Y字型金属固定ロッドとして使用される音叉</td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>Royal Gardineer</td><td>IP67</td><td>Royal Gardineer 加熱パッド サイズ S、20ワット</td></tr><tr><td>プラスチックパフューザーチューブ</td><td>M. Schilling GmbH</td><td>S702NC150</td><td>接続チューブ COEX 150 cm</td></tr><tr><td>シリコン容器ループタイ</td><td>SERAG WIESSNER</td><td>SL26</td><td>シリコン容器ループタイ 2,5 mm 赤</td></tr><tr><td>Spraque Dawley ラット</td><td>Janvier Labs</td><td>RN-SD-M</td><td>Spraque Dawley rat</td></tr><tr><td>Steel plate</td><td>Maschinenbau Feld GmbH</td><td>C010206</td><td>亜鉛メッキシートプレート、40 x 50 cm、厚さ 4.0 mm</td></tr><tr><td>Yasargil クリップ</td><td>Aesculap</td><td>FE795K</td><td>YASARGIL 動脈瘤クリップ System Phynox Temporary (Standard) Clip</td></tr><tr><td>Yasargil clip applicator</td><td>Aesculap</td><td>FE558K</td><td>YASARGIL Aneurysm Clip Applicator Phynox (Standard)</td></tr></tbody></table>

ラットの正中開腹術による可逆性内臓動脈虚血、静脈うっ血、および複合灌流不良の制御

Controlled Reversible Visceral Arterial Ischemia, Venous Congestion and Combined Malperfusion via Midline Laparotomy in Rats

このプロトコルは、非生存環境の10匹の雄ラット(平均体重403g±26g)で実施されました。成功率は、動脈クランプ、静脈クランプ、および5分間の併用クランプと10分間の再灌流の併用クランプの20分後の生存率によって定義され、それぞれが100%でした。皮膚切開から両方の血管がシリコンループで吊り下げられるまでの調製の平均期間は、11分45秒±3分23秒であった。
4つの異なる灌流異常状態を検証するために、5つの内臓にわたるハイパースペクトルイメージング(HSI)を使用して、酸素化(StO2)および灌流(NIR)の指標パラメータを測定しました(図5)。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67171/67171fig05.jpg"> 図5:灌流不良モデルの検証 (A,B) n = 10匹の動物を用いた4つの異なる灌流状態と5つの異なる内臓におけるHSIの酸素化と灌流値の定量化。(C-F)4つの異なる灌流状態にわたる内臓を含むHSI記録のRGBおよび色分けされたインデックス画像。エラーバーは標準偏差を示します。スケールバーは5cmを示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67171/67171fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
値は任意の単位で提供され、生理学的臓器の状態と比較して、灌流不良状態の有意な減少が示されました(表1)。ハイパースペクトルの結果は、組織の生存率と灌流を、この研究で見られた値と一致する臓器特異的なHSI StO2カットオフ値を使用して評価できることを示す最近の出版物と一致していました14,15。例えば、胃では、生理的灌流が64.1%(±9.4%)、動脈虚血が43.1%(±7.4%)、静脈うっ血が40.5%(±5.4%)、複合灌流が39.3%(±4.5%)であった。
これらは非生存実験であったため、動物の長期的な結果に関する実験データはありません。しかし、他の研究では、上腸間膜動脈クランプ16,17を30分および60分受けたラットの24時間にわたる100%および57%の生存率が報告されており、それを熱ショックタンパク質70の血清レベルとうまく相関させています。したがって、これは、異なるクランプ時間に従って将来の生存研究の結果を評価するための可能な方法である可能性があります。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>パラメーター</td>
			<td>器官</td>
			<td>ベースライン</td>
			<td>動脈虚血</td>
			<td>静脈のうっ血</td>
			<td>複合灌流不良</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">ストリウム2</td>
			<td>胃</td>
			<td>64.1%(±9.4%)</td>
			<td>43.1%(±7.4%)</td>
			<td>40.5%(±5.4%)</td>
			<td>39.3%(±4.5%)</td>
		</tr><tr><td>小腸</td>
			<td>78.4%(±5.1%)</td>
			<td>44.8%(±5.5%)</td>
			<td>38.0%(±7.9%)</td>
			<td>41.9%(±6.9%)</td>
		</tr><tr><td>コロン</td>
			<td>74.6%(±5.0%)</td>
			<td>56.0%(±6.3%)</td>
			<td>51.3%(±4.1%)</td>
			<td>51.8%(±2.9%)</td>
		</tr><tr><td>肝臓</td>
			<td>39.5%(±9.7%)</td>
			<td>16.9%(±2.6%)</td>
			<td>9.5%(±0.8%)</td>
			<td>9.3% (±1.1%)</td>
		</tr><tr><td>腎臓</td>
			<td>71.0%(±3.8%)</td>
			<td>26.3%(±3.0%)</td>
			<td>18.6%(±2.5%)</td>
			<td>21.2%(±2.6%)</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">近赤外</td>
			<td>胃</td>
			<td>20.0%(±9.3%)</td>
			<td>8.3% (±6.7%)</td>
			<td>6.8%(±5.1%)</td>
			<td>7.5%(±8.1%)</td>
		</tr><tr><td>小腸</td>
			<td>38.6%(±17.4%)</td>
			<td>12.9%(±11.0%)</td>
			<td>6.3%(±6.5%)</td>
			<td>5.7%(±5.9%)</td>
		</tr><tr><td>コロン</td>
			<td>12.6%(±13.7%)</td>
			<td>5.3% (±8.7%)</td>
			<td>3.8%(±7.5%)</td>
			<td>2.6%(±4.7%)</td>
		</tr><tr><td>肝臓</td>
			<td>40.4%(±13.1%)</td>
			<td>0.3% (±0.7%)</td>
			<td>0.0%(±0.1%)</td>
			<td>0.0%(±0.0%)</td>
		</tr><tr><td>腎臓</td>
			<td>10.4%(±5.2%)</td>
			<td>0.0%(±0.0%)</td>
			<td>0.0%(±0.1%)</td>
			<td>0.0%(±0.0%)</td>
		</tr></tbody></table>表1:組織パラメータ。 HIS StO2 酸素化と NIR 灌流の値は、5 つの内臓と 4 つの異なる灌流状態にわたる任意の単位で得られます。

Besides sepsis and malignancy, malperfusion is the third leading cause of tissue degradation and a major pathomechanism for various medical and surgical ...

controlled-reversible-visceral-arterial-ischemia-venous-congestion

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