Name: ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞の作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 学ぶヒトキメラ抗原受容体（CAR）制御性T細胞の作製法。自己免疫疾患や移植拒絶、がん治療への応用を目指し、CAR親和性の調節による細胞機能の最適化手法を解説します。

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1. ヒトTregの単離
<ol>
	<li>ロイコパック加工<ol>
		<li>ロイコパックの内容物を50mLのコニカルチューブに移します。ピペットで穏やかに混合することにより、等量のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)+2%ウシ胎児血清(FBS)を追加します。</li>
		<li>室温(RT)で300 × g</li><li></li><li><ol><li></li></ol></li></ol></li><li><ol><li> </li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li> </li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li> </li><li></li><li></ol></li></ol><ol><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol><ol><li></li><li><li> </li><li></li><li><li></li><li> </li><li></ol><ol><li><li><li><li><li></li><li> </li><li></li><li><li> </li><li></li><li> </li><li><li><li> </li><li><li></li><li> </li><li></li><li><ol><li><li><li></li></ol></li><li> </li><li></ol><ol><li><ol><li> </li><li></li><li><li><li> </li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li> </li><li><li></li><li><ol><li><li><li></li><li> </li></ol></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li></li><li><li><li><li></li><li><li></li><li> </li><li><li></li><li></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></li><li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li><ol><li><li><li><li><li><li> </li></ol></li></ol></li><li><ol><li><li></li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li></li><li></li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67200/67200eq01.jpg" style="margin: auto;"> </li></ol></li></ol>

<meta charset="utf8"></head><body>免疫制御療法のためのヒトCAR制御細胞の工学と拡大

<ol><li>Zhang, X., Zhu, L., Zhang, H., Chen, S., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy+in+hematological+malignancies%3A+current+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy in hematological malignancies: current opportunities and challenges.</a> Front Immunol. 13, 927153(2022).</li>
<li>Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+outcomes+following+CAR+T+cell+therapy%3A+what+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Long-term outcomes following CAR T cell therapy: what we know so far.</a> Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).</li>
<li>Choi, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+CARv3-TEAM-E+T+cells+in+recurrent+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intraventricular CARv3-TEAM-E T cells in recurrent glioblastoma.</a> N Engl J Med. 390 (14), 1290-1298 (2024).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locoregional+delivery+of+IL-13Ralpha2-targeting+CAR-T+cells+in+recurrent+high-grade+glioma%3A+a+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Locoregional delivery of IL-13Ralpha2-targeting CAR-T cells in recurrent high-grade glioma: a phase 1 trial.</a> Nat Med. 30 (4), 1001-1012 (2024).</li>
<li>Bagley, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+bivalent+CAR+T+cells+targeting+EGFR+and+IL13Ralpha2+in+recurrent+glioblastoma%3A+phase+1+trial+interim+results%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Intrathecal bivalent CAR T cells targeting EGFR and IL13Ralpha2 in recurrent glioblastoma: phase 1 trial interim results.</a> Nat Med. 30 (5), 1320-1329 (2024).</li>
<li>Ghobadinezhad, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+regulatory+cell-based+therapy+in+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of regulatory cell-based therapy in autoimmune disease.</a> Front Immunol. 13, 1075813(2022).</li>
<li>Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and immune tolerance.</a> Cell. 133 (5), 775-787 (2008).</li>
<li>Sakaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and human disease.</a> Annu Rev Immunol. 38, 541-566 (2020).</li>
<li>Ferreira, L. M. R., Muller, Y. D., Bluestone, J. A., Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+regulatory+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Next-generation regulatory T cell therapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 18 (10), 749-769 (2019).</li>
<li>Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+human+autoimmunity%3A+current+practice+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Treating human autoimmunity: current practice and future prospects.</a> Sci Transl Med. 4 (125), 125sr121(2012).</li>
<li>Sawitzki, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+cell+therapy+in+kidney+transplantation+%28The+ONE+Study%29%3A+a+harmonised+design+and+analysis+of+seven+non-randomised%2C+single-arm%2C+phase+1%2F2A+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Regulatory cell therapy in kidney transplantation (The ONE Study): a harmonised design and analysis of seven non-randomised, single-arm, phase 1/2A trials.</a> Lancet. 395 (10237), 1627-1639 (2020).</li>
<li>Spanier, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tregs+with+an+MHC+class+II+peptide-specific+chimeric+antigen+receptor+prevent+autoimmune+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tregs with an MHC class II peptide-specific chimeric antigen receptor prevent autoimmune diabetes in mice.</a> J Clin Invest. 133 (18), e168601(2023).</li>
<li>Muller, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+engineering+of+an+anti-HLA-A2+chimeric+antigen+receptor+in+regulatory+T+cells+for+transplant+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Precision engineering of an anti-HLA-A2 chimeric antigen receptor in regulatory T cells for transplant immune tolerance.</a> Front Immunol. 12, 686439(2021).</li>
<li>MacDonald, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alloantigen-specific+regulatory+T+cells+generated+with+a+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Alloantigen-specific regulatory T cells generated with a chimeric antigen receptor.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1413-1424 (2016).</li>
<li>Boardman, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellin-specific+human+CAR+Tregs+for+immune+regulation+in+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Flagellin-specific human CAR Tregs for immune regulation in IBD.</a> J Autoimmun. 134, 102961(2023).</li>
<li>Schreeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+design%3A+human+leukocyte+antigen+Cclass+I+molecule+A%28%2A%2902-chimeric+antigen+receptor+regulatory+T+cells+in+renal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int+Rep%22%5BJournal%5D)">Study design: human leukocyte antigen Cclass I molecule A(*)02-chimeric antigen receptor regulatory T cells in renal transplantation.</a> Kidney Int Rep. 7 (6), 1258-1267 (2022).</li>
<li>Zimmerman, C. M., Robino, R. A., Cochrane, R. W., Dominguez, M. D., Ferreira, L. M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+human+conventional+and+regulatory+T+cells+using+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Redirecting human conventional and regulatory T cells using chimeric antigen receptors.</a> Methods Mol Biol. 2748, 201-241 (2024).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+decrease+of+donor-reactive+T%28regs%29+after+liver+transplantation+limits+T%28reg%29+therapy+for+promoting+allograft+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Selective decrease of donor-reactive T(regs) after liver transplantation limits T(reg) therapy for promoting allograft tolerance in humans.</a> Sci Transl Med. 14 (669), eabo2628(2022).</li>
<li>Bender, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+2+randomized+trial+with+autologous+polyclonal+expanded+regulatory+T+cells+in+children+with+new-onset+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A phase 2 randomized trial with autologous polyclonal expanded regulatory T cells in children with new-onset type 1 diabetes.</a> Sci Transl Med. 16 (746), eadn2404(2024).</li>
<li>Ferreira, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conference+report%3A+Advanced+Therapies+Week+2023%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Conference report: Advanced Therapies Week 2023.</a> Regen Med. 18 (4), 297-299 (2023).</li>
<li>Cochrane, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+test+human+CAR+T+cells+in+solid+tumors%2C+the+next+frontier+of+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How to test human CAR T cells in solid tumors, the next frontier of CAR T cell therapy.</a> Methods Mol Biol. 2748, 243-265 (2024).</li>
<li>Roy, A., Krzykwa, E., Lemieux, R., Neron, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+efficiency+of+gamma-irradiated+versus+mitomycin+C-treated+feeder+cells+for+the+expansion+of+normal+human+cells+in+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematother+Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Increased efficiency of gamma-irradiated versus mitomycin C-treated feeder cells for the expansion of normal human cells in long-term cultures.</a> J Hematother Stem Cell Res. 10 (6), 873-880 (2001).</li>
<li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR%2FCas9+enhances+tumour+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li>
<li>Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Bjorklund, T., Davidsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+Production+everywhere%3A+a+simple%2C+fast%2C+and+reliable+protocol+for+in-house+AAV+vector+production+based+on+chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AAV Production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house AAV vector production based on chloroform extraction.</a> Curr Protoc Neurosci. 93 (1), e103(2020).</li>
<li>Velasco Cardenas, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+CD3+diversity+to+optimize+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Harnessing CD3 diversity to optimize CAR T cells.</a> Nat Immunol. 24 (12), 2135-2149 (2023).</li>
<li>Boomer, J. S., Green, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enigmatic+tail+of+CD28+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">An enigmatic tail of CD28 signaling.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (8), a002436(2010).</li>
<li>Suhoski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+artificial+antigen-presenting+cells+to+express+a+diverse+array+of+co-stimulatory+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules.</a> Mol Ther. 15 (5), 981-988 (2007).</li>
<li>Fung, V. C. W., Rosado-Sanchez, I., Levings, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+human+T+cell+subsets+with+lentivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transduction of human T cell subsets with lentivirus.</a> Methods Mol Biol. 2285, 227-254 (2021).</li>
<li>Bailey-Bucktrout, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-antigen-driven+activation+induces+instability+of+regulatory+T+cells+during+an+inflammatory+autoimmune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Self-antigen-driven activation induces instability of regulatory T cells during an inflammatory autoimmune response.</a> Immunity. 39 (5), 949-962 (2013).</li>
<li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+Helios-deficient+Tregs+is+associated+with+conversion+to+a+T-effector+phenotype+and+enhanced+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Instability of Helios-deficient Tregs is associated with conversion to a T-effector phenotype and enhanced antitumor immunity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (22), 6248-6253 (2016).</li>
<li>Dawson, N. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+effects+of+chimeric+antigen+receptor+co-receptor+signaling+domains+in+human+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Functional effects of chimeric antigen receptor co-receptor signaling domains in human regulatory T cells.</a> Sci Transl Med. 12 (557), eaaz3866(2020).</li>
<li>Rana, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-+and+TRuC-redirected+regulatory+T+cells+differ+in+capacity+to+control+adaptive+immunity+to+FVIII%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">CAR- and TRuC-redirected regulatory T cells differ in capacity to control adaptive immunity to FVIII.</a> Mol Ther. 29 (9), 2660-2676 (2021).</li>
<li>Battaglia, M., Stabilini, A., Tresoldi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+human+T+regulatory+cells+with+the+mTOR-inhibitor+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expanding human T regulatory cells with the mTOR-inhibitor rapamycin.</a> Methods Mol Biol. 821, 279-293 (2012).</li>
<li>Brady, B. L., Steinel, N. C., Bassing, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor+allelic+exclusion%3A+an+update+and+reappraisal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor allelic exclusion: an update and reappraisal.</a> J Immunol. 185 (7), 3801-3808 (2010).</li>
<li>Samarasinghe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+alloreactive+T+cells+identifies+CD25+and+CD71+as+optimal+targets+for+a+clinically+applicable+allodepletion+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of alloreactive T cells identifies CD25 and CD71 as optimal targets for a clinically applicable allodepletion strategy.</a> Blood. 115 (2), 396-407 (2010).</li>
<li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP3+protects+conventional+human+T+cells+from+premature+restimulation-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">FOXP3 protects conventional human T cells from premature restimulation-induced cell death.</a> Cell Mol Immunol. 18 (1), 194-205 (2021).</li>
<li>Collison, L. W., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Treg+suppression+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro Treg suppression assays.</a> Methods Mol Biol. 707, 21-37 (2011).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>アデノ随伴ウイルス&nbsp;(AAV)</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CAR標的発現K562細胞</td><td></td><td></td><td>(例:CD19-K562</td></tr>、<tr><td>セシウム-137照射器</td><td></td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>抗ヒトCD8 PerCP(クローンSK1)、</td><td>バイオレジェンド</td><td>344708</td><td></td></tr>、<tr><td>抗ヒトCD4 PE/Cy7(クローンSK3)、</td><td>バイオレジェンド</td><td>344612</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-15磁石</td>サー<td>モフィッシャー</td><td>12301D</td><td></td></tr><tr><td>ゴーストBV510生存率染料&nbsp;</td><td>とんぼ</td><td>13-0870-T100</td><td></td></tr><tr><td>K562 細胞</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15575020</tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム溶液</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD127 PE (クローン hIL-7R-M21)</td><td>BD Biosciences</td><td>557938</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD25 APC (クローン BC96)</td><td>バイオレジェンド&nbsp;</td><td>302610</td><td></td></tr><tr><td>反ヒトCD4 FITC(クローンSK3)</td><td>バイオレジェンド&nbsp;</td><td></td><td></td>344604</tr><tr><td>反ヒトCD71 PE(クローンSK1)</td><td>バイオレジェンド</td><td>334106</td><td></td></tr><tr><td>反ヒトCD8 PerCP(クローンSK1)</td><td>バイオレジェンド&nbsp;</td><td></td><td></td>344707</tr><tr><td>反ヒト CTLA-4 PerCP-e710</td><td>サーモフィッシャー</td><td>46-1529-42</td><td></td></tr><tr><td>反ヒト EGFR APC (クローン AY13)</td> <td>バイオレジェンド</td><td>352905</td><td></td></tr><tr><td>反ヒト FOXP3 eFluor 450</td><td>サーモフィッシャー</td><td>48-4776-42</td><td></td></tr><tr><td>反ヒト HELIOS PE</td><td>バイオレジェンド</td><td>137216</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+およびMg2+遊離ダルベッコ'リン酸緩衝生理食塩水(DPBS)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter (TC20 Automated Cell Counter)</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counting Slides</td><td>Bio-Rad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Violet Cell Proliferation Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>C34571</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep magnet&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human CD4+ T cell Enrichment Kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human CD8+ T cell Enrichment Kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 磁石&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3転写因子染色バッファーセット</td><td>ThermoFisher</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 丸底ポリスチレン試験管、セルストレーナースナップキャップ付き、5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td>40&mu;m</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>CytoFLEX LX U3-V5-B3-Y5-R3-I2</td></tr><tr><td>蛍光活性化セルソーター</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACS Aria III セルソーター</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Human CD3/28 T Cell Expansion and Activation Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen ネオントランスフェクションシステム</td><td>ThermoFisher</td><td>10431915</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen ネオントランスフェクションシステム 100 &mu;Lキット</td><td>ThermoFisher</td><td>10114334</td><td></td></tr><tr><td>レンチウイルス</td><td>VectorBuilder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Myc Tag 抗体 A647 (クローン 9B11)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>2233S</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 還元血清培地</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトインターロイキン-2 (rhIL-2)</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培地,グルタミンなし&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>スペクトルフローサイトメーター</td><td>Cytek</td><td></td><td>Northern Lights</td></tr><tr><td>TRAC gRNA</td><td>Synthego</td><td></td><td>Sequence (CAGGGTTCTGGATATCTGT)</td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 Protein v2</td><td>ThermoFisher</td><td>A36496</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>T8154-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1/10 ロイコパック</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0092</td><td>1-20億PBMC</td></tr></tbody></table>

ヒトキメラ抗原受容体制御性t細胞の作製

Generation of Human Chimeric Antigen Receptor Regulatory T Cells

ここで説明するプロトコルは、自己免疫疾患、移植片対宿主病、臓器移植拒絶反応、およびアレルギーの生きた治療法を作成することを目的として、ヒト制御性T細胞(Treg)における新しいキメラ抗原受容体(CAR)コンストラクトを評価するための合理化された標準化されたパイプラインを提供します。図1は、ex vivo増殖後の高レベルのTreg系統転写因子FOXP3およびHERIOSによって評価された、FACSを使用して末梢血から高純度のヒトTregを取得する方法を示しています(図1A)。
ヒト制御性T細胞で遺伝子改変を行うための2つの方法、レンチウイルス形質導入(図2)とCRISPR/Cas9を介した遺伝子ノックイン(図3)の2つの方法を紹介します。レンチウイルス骨格構造の合成、レン...

ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞の作製

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has reshaped the face of cancer treatment, leading to record remission rates in previously incurable ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、単一のヒトの血液ドナーからの規制は、メモリとナイーブT細胞を生成する方法を説明します。偏Tregsのは、その後もここで詳述抑制アッセイを含む遺伝的均一性を持つ遺伝子や機能のさまざまなアプリケーション内の他のサブセットと比較することができます。...

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

このビデオは、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞をex...

キメラ抗原受容体T細胞を作製するex vivo技術

このビデオは、腫瘍抗原特異的キメラ抗原受容体(CAR)T細胞のex...

腫瘍特異的キメラ抗原受容体T細胞を作製するためのex vivo技術

このビデオでは、レトロウイルス形質導入により抗原特異的なキメラ抗原受容体(CAR)T細胞を作製する技術を紹介しています。活性化マウスCD8+...

抗原特異的CAR-T細胞の作製技術

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞を確実に生成し、その分化と機能をインビトロとインビボでテストするアプローチについて説明します。...

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞の養子免疫療法用

このプロトコルは、適正製造基準(GMP)規格との互換性を確保し、関心のある遺伝子を持つ初代ヒトT細胞を形質導入するプロセスを概説します。...

遺伝子改変T細胞の作製のためのGMP準拠手順

本稿では、臨床用のキメラ抗原受容体T細胞の製造プロセス、特にT細胞のウイルス形質導入および培養を行うことができる自動細胞プロセッサーの使用について詳述する。私たちは、初期段階の臨床試験のプロセス開発と実施中に考慮すべき推奨事項を提供し、落とし穴について説明します。...

自動セルプロセッサーでのキメラ抗原受容体T細胞製造

このプロトコルは、レトロウイルスベクターの生産とマウスT細胞の形質導入を合理化し、マウスCAR-T細胞の効率的な生成を促進します。...

マウスキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の効率的な作製

ここでは、低酸素感受性キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の作製と機能検証のためのプロトコールを紹介します。このプロトコルは、レンチウイルスベースの低酸素感受性CAR-T細胞の作製と、低酸素依存性CAR発現および選択的細胞毒性の検証を含むそれらの特性評価を示しています。...

低酸素感受性キメラ抗原受容体T細胞の作製と機能検証

CD4+制御性T細胞は強力な免疫調節因子であり、免疫恒常性において重要な機能を果たします。末梢血中のこれらの細胞が不足しているため、特にHIV-1感染の状況では、機能研究が困難になっています。ここでは、HIV-1感染者の末梢血から機能的なCD4+...

HIV-1に感染した個体からの制御性T細胞を増殖するための新しいツール

学ぶヒトキメラ抗原受容体（CAR）制御性T細胞の作製法。自己免疫疾患や移植拒絶、がん治療への応用を目指し、CAR親和性の調節による細胞機能の最適化手法を解説します。

ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞の作製

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