Name: 馬の腸管グリア培養と馬疝痛の神経炎症メカニズムの研究への応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学ぶ馬の腸管グリア細胞の分離培養法と、馬疝痛術後の神経炎症メカニズムの解明への応用。腸管バリア機能への影響を評価し、術後合併症予防に向けた再現性のあるプロトコルを確立します。

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<meta charset="utf8"></head><body>疝痛関連炎症における腸管グリア-上皮相互作用の研究

<ol><li>Tinker, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+study+of+equine+colic+incidence+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Prospective study of equine colic incidence and mortality.</a> Equine Vet J. 29 (6), 448-453 (1997).</li>
<li>Morton, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+and+postoperative+factors+influencing+short-term+survival+of+horses+following+small+intestinal+resection%3A+92+cases+%281994-2001%29%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Surgical and postoperative factors influencing short-term survival of horses following small intestinal resection: 92 cases (1994-2001).</a> Equine Vet J. 34 (5), 450-454 (2002).</li>
<li>French, N. P., Smith, J., Edwards, G. B., Proudman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+surgical+colic%3A+risk+factors+for+postoperative+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Equine surgical colic: risk factors for postoperative complications.</a> Equine Vet J. 34 (5), 444-449 (2002).</li>
<li>Lisowski, Z. M., Lefevre, L., Mair, T. S., Clark, E. L., Hudson, N. P. H., Hume, D. A., Pirie, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+the+local+inflammatory+response+in+the+intestinal+mucosa+and+muscularis+of+horses+undergoing+small+intestinal+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative real-time PCR to determine the local inflammatory response in the intestinal mucosa and muscularis of horses undergoing small intestinal resection.</a> Equine Vet J. 54 (1), 52-62 (2022).</li>
<li>Sheats, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+equine+SIRS%2C+sepsis%2C+and+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">A comparative review of equine SIRS, sepsis, and neutrophils.</a> Front Vet Sci. 6, 69(2019).</li>
<li>Mazzotta, E., Villalobos-Hernandez, E. C., Fiorda-Diaz, J., Harzman, A., Christofi, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+ileus+and+postoperative+gastrointestinal+tract+dysfunction%3A+pathogenic+mechanisms+and+novel+treatment+strategies+beyond+colorectal+enhanced+recovery+after+surgery+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharm%22%5BJournal%5D)">Postoperative ileus and postoperative gastrointestinal tract dysfunction: pathogenic mechanisms and novel treatment strategies beyond colorectal enhanced recovery after surgery protocols.</a> Front Pharm. 11, 583422(2020).</li>
<li>Stoffels, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+ileus+involves+interleukin-1+receptor+signaling+in+enteric+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Postoperative ileus involves interleukin-1 receptor signaling in enteric glia.</a> Gastroenterology. 146 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Yu, Y. B., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells+and+their+role+in+the+intestinal+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier.</a> World J Gastroenterol. 20 (32), 11273-11280 (2014).</li>
<li>Savidge, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia+regulate+intestinal+barrier+function+and+inflammation+via+release+of+S-nitrosoglutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Enteric glia regulate intestinal barrier function and inflammation via release of S-nitrosoglutathione.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1344-1358 (2007).</li>
<li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Vet J. 50 (2), 241-248 (2018).</li>
<li>Hellman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+equine+enteroids+and+enteroid-derived+2D+monolayers+that+are+responsive+to+microbial+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of equine enteroids and enteroid-derived 2D monolayers that are responsive to microbial mimics.</a> Vet Res. 52 (1), 108(2021).</li>
<li>Al-Sadi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-6+modulation+of+intestinal+epithelial+tight+junction+permeability+is+mediated+by+JNK+pathway+activation+of+claudin-2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interleukin-6 modulation of intestinal epithelial tight junction permeability is mediated by JNK pathway activation of claudin-2 gene.</a> PLoS One. 9 (3), e85345(2014).</li>
<li>Ochoa-Cortes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells%3A+A+new+frontier+in+neurogastroenterology+and+clinical+target+for+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells: A new frontier in neurogastroenterology and clinical target for inflammatory bowel diseases.</a> Inflamm Bowel Dis. 22 (2), 433-449 (2016).</li>
<li>Ziegler, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cell+network+function+is+required+for+epithelial+barrier+restitution+following+intestinal+ischemic+injury+in+the+early+postnatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cell network function is required for epithelial barrier restitution following intestinal ischemic injury in the early postnatal period.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 326 (3), G228-G246 (2024).</li>
<li>Grubišić, V., Gulbransen, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia%3A+the+most+alimentary+of+all+glia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enteric glia: the most alimentary of all glia.</a> J Physiol. 595 (2), 557-570 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES バッファー</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>10 mM HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>2 mM GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>25050-061</td><td></td></tr><tr><td>4'6-ジアミニジノ-2-フェニルリンドール</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>アルファ平滑筋アクチン抗体</td><td>アブカム</td><td>7817</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシン B</td><td>Sigma</td><td>AA9529</td><td>4.4 g/mL ストックアリコート、最終濃度 1.1 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>抗酸化薬 1x</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Σ</td><td>AA3311</td><td></td></tr><tr><td>BSA 50 mg/mL 原液</td><td>Σ</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>CaCL2</td><td>ACROS Organiics 206791000</td><td></td><td>馬のリンガーのコンポーネント's ストック1:他の材料と組み合わせ、このストック100 mLをメスシリンダーに加え、脱イオン水で1Lに希釈します。5% CO2. Combine with Equine Ringer' で pH を 7.4 に調整します。sストック2を完成させる」リンガー's ソリューション」。</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>Sigma</td><td>9891</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 培地</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>ロバ 抗ウサギ IgG アレクサ フロー 594</td><td>Invitrogen</td><td>21207</td><td></td></tr><tr><td>EVOM EndOhm デュアル電極 TEER-測定チャンバー</td><td>ワールド プレシジョン インスツルメンツ</td><td>EVM-EL-03-01</td><td></td></tr><tr><td>EVOMマニュアル TEER 測定</td><td>ワールド プレシジョン インストゥルメント</td><td>EVM-MT-03-01</td><td></td></tr><tr><td>G5</td><td>Gibco</td><td>17503012</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン溶液</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td>最終濃度 20 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>GFAP抗体</td><td>Abcam</td><td>4674</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>28175</td><td></td></tr><tr><td>IL-1&β;ELISA</td><td>サーモフィッシャー</td><td>ESIL1B</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>サーモフィッシャー</td><td>P330-500</td><td>馬用リンガーのコンポーネントs ストック1:他の材料と組み合わせ、このストック100 mLをメスシリンダーに加え、脱イオン水で1Lに希釈します。5% CO2. Combine with Equine Ringer' で pH を 7.4 に調整します。sストック2を完成させる」リンガー's ソリューション」。</td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液</td><td>Corning</td><td>25-00-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>サーモフィッシャー</td><td>M33-500</td><td>馬のリンガーの成分s ストック1:他の材料と組み合わせ、このストック100 mLをメスシリンダーに加え、脱イオン水で1Lに希釈します。5% CO2. Combine with Equine Ringer' で pH を 7.4 に調整します。sストック2を完成させる」リンガー's ソリューション」。</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>サーモフィッシャー</td><td>BP332-1</td><td>馬リンガーのコンポーネントs Stock 2:他の材料と組み合わせ、このストック100 mLをメスシリンダーに加え、脱イオン水で1Lに希釈します。5% CO2. Combine with Equine Ringer' で pH を 7.4 に調整します。sストック1を完成させる」リンガー's ソリューション」。</td></tr><tr><td>NaCl</td>サー<td>モフィ</td><td>ッシャーS271-10</td><td>馬リンガーのコンポーネント's ストック1:他の材料と組み合わせ、このストック100 mLをメスシリンダーに加え、脱イオン水で1Lに希釈します。5% CO2. Combine with Equine Ringer' で pH を 7.4 に調整します。sストック2を完成させる」リンガー's ソリューション」。</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーBP329-500</td><td>馬リンガーのコンポーネントs Stock 2:他の材料と組み合わせ、このストック100 mLをメスシリンダーに加え、脱イオン水で1Lに希釈します。5% CO2. Combine with Equine Ringer' で pH を 7.4 に調整します。sストック1を完成させる」リンガー's ソリューション」。</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーS637-212</td><td>馬リンガーのコンポーネントs Stock 2:他の材料と組み合わせ、このストック100 mLをメスシリンダーに加え、脱イオン水で1Lに希釈します。5% CO2. Combine with Equine Ringer' で pH を 7.4 に調整します。sストック1を完成させる」リンガー's ソリューション」。</td></tr><tr><td>ペン/溶連菌感染症</td>溶液 <td>Gemini</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td>0.5 mg/mL in 1x ホウ酸バッファー</td></tr><tr><td>プリズムソフトウェア</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ</td><td>Sigma</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム溶液</td><td>Sigma</td><td>S8761</td><td>7.5% ストック溶液</td></tr></tbody></table>

馬の腸管グリア培養と馬疝痛の神経炎症メカニズムの研究への応用

Equine Enteric Glial Culture and Application to the Study of a Neural Inflammatory Mechanism in Equine Colic

ウマの空腸を粘膜下層までマイクロダイセクション(図1)すると、さらに酵素的および機械的消化が行われ、ウマの腸グリアの生存細胞培養が可能になる可能性がある。細胞は、他の種の腸管グリアと一致する紡錘形細胞の優勢を伴う多形性を示しました(図2A)。培養物は、選択的グリアマーカーであるグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)に対して陽性であり、線維芽細胞の汚染は低かった(α SMA、 図2B)。場合によっては、粘膜下層の顕微解剖が十分に制御されておらず、線維芽細胞マーカーである平滑筋アクチンの免疫蛍光法により観察された高割合の線維芽細胞で培養物が汚染されていました(図3)。
次に、ウマ腸グリア培養の有用性の例として、IL-1βに曝露された腸グリアが腸管上皮バリア機能に及ぼす影響を評価した。10 ngおよび25 ngのIL-1βに24時間曝露されたウマ粘膜下腸グリア培養物からの培地への基底外側曝露は、透過性を有意に増加させた(それぞれp = 0.05および0.04、対照培地の平均= 0.9、グリアの平均10 ng IL-1β群= 0.8、95%信頼区間= -0.2〜0.02、グリアの平均25 ng IL-1β群= 0.8、 95%信頼区間 = -0.1995 〜 0.01060、n = 3-4) (図 4A)。しかし、IL-1βに曝露された腸内グリアによって産生され、げっ歯類モデル12において腸細胞透過性の増加を誘導することが実証された炎症性サイトカインである基底外側10〜25 ngのウマIL-6へのウマ上皮単層の曝露は、ウマ腸細胞単層透過性を有意に増加させませんでした(図4B)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig01.jpg"> 図1:マイクロダイセクションと酵素的および機械的消化によるウマ空腸からの腸グリアの分離 (A)空腸は無腸境界に沿って切断され、粘膜側を上にして固定されました。(B)腸絨毛を顕微鏡で視覚化し、細い固有層が視覚化されるまで穏やかに掻き取って除去しました。(C)次に、平滑筋線維が半透明の粘膜下層を通して見えるようになるまで、固有層を除去しました。(D)粘膜下組織をテントで張って筋肉層から剥がし、必要に応じて繊維状タグに切り込みを入れました。画像は10倍解剖顕微鏡(B、C)で取得しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig02.jpg"> 図2:ウマの粘膜下腸グリア培養物のイメージング (A)ウマ腸グリアの星状(矢印)、紡錘状(開いた矢印)、および神経節(閉じた矢印)の形態は、位相差顕微鏡によって評価されました。(B)培養物の純度はGFAPの染色により評価し、線維芽細胞マーカーについては平滑筋アクチンスケールバー= 100 mm(A)、400 mm(B)で評価しました。略語:GFAP =グリア線維性酸性タンパク質;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig03.jpg"> 図3:失敗したウマの粘膜下腸グリア培養のイメージング。 培養物の純度は、GFAP(赤)および線維芽細胞マーカーである平滑筋アクチン(緑)の染色によって評価され、線維芽細胞汚染の割合が高いことが示されました。黄色の矢印はGFAPを示し、白い矢印の先端は平滑筋アクチンを示します。スケールバー= 400 mm。略語:GFAP =グリア線維性酸性タンパク質。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig04.jpg"> 図4:炎症性サイトカインおよび炎症性グリア製品への曝露後のウマ上皮単層TEER. (A)ウマ粘膜下腸グリア培養物からの培地への基底外側曝露は、10 ngおよび25 ngのIL-1βに24時間曝露され、透過性が有意に増加した(*p = 0.05および0.04、それぞれ、n = 3-4)。(B)ウマ腸細胞単層の基底外側25 ngのIL-1βおよび10-25 ngのウマIL-6への急性曝露は、ウマの上皮単層透過性を有意に増加させなかった(n = 2-4)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:単離および培養用の試薬。 以下の試薬を使用して、ウマ腸グリア単離、腸グリア培養、およびウマ腸上皮幹細胞培養用の培地を調製しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244_Table%201_rev.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Inflammatory postoperative conditions of equine colic (acute abdomen) contribute not only to increased client cost, patient discomfort, and ...

equine-enteric-glial-culture-application-to-study-neural-inflammatory

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医学

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人間の腸粘膜の外植片の文化と偏刺激する新規な方法

このビデオは、マウス腸の粘膜下層と固有層から腸管グリア細胞を分離する方法を示しています。粘膜下組織と固有層組織の抽出、それらからの腸内グリア細胞の単離、およびコーティングされたウェルプレート上で細胞を培養して腸内グリア細胞培養を確立するための手順を概説しています。...

マウスの粘膜下層および固有層からの腸管グリア細胞の単離

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不定冠詞<em&gt;インビトロ</em成体マウスの筋層間神経叢から分離腸ニューロンとグリアの&gt;準備

神経可塑性は、胃腸（GI）管のますます認識したが、十分に理解する機能です。ここでは、人間の膵臓疾患の例では、形態学的および機能的レベルでの消化管における神経可塑性の研究のためのin vitro神経可塑性アッセイを提示する。...

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グロボイド細胞は、現在効果的な長期治療を欠いている白質ジストロフィーであるクラッベ病の決定的な病理学的特徴です。私たちは、活性化ミクログリアの自然生物学的および病原性の可能性と、それらがグロボイド細胞に形質転換するための細胞培養モデルを開発しました。...

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腸内神経系(ENS)は、腸壁に位置するニューロンとグリアのネットワークで、腸の反射を制御します。このプロトコルは、Ca2+イメージングを使用してENSのライブ調製物中の腸管ニューロンおよびグリアの活動を記録する方法を説明しています。...

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マウス腸神経系の開発を可視化するために免疫染色

この記事では、成体マウスの結腸運動性の神経調節の変化を特定するためのビデオイメージング技術と高解像度の時空間マッピングについて説明します。このアプローチを用いて、単離された組織調製物を用いて胃腸(GI)機能に対する微妙な影響を検出することができ、消化管疾患の理解を深めることができます。...

マウスにおける胃腸の運動を分析するためにビデオ画像と時空間マップ

感覚機能の異常は、内臓の痛みや機能および炎症性腸病気の他の症状に基づいています。に備えて、前のヴィヴォラット大腸結腸求心性神経の電気生理学的記録のためのプロトコルを次に示します。...

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