Name: iPSC由来の上皮細胞、間葉系、内皮細胞、免疫細胞の共培養による肺の健康と疾患における気道バリア完全性のモデル化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 学ぶiPSC由来多細胞共培養モデルによる気道バリアの構築法。上皮細胞、間葉系、内皮細胞、マクロファージを含む複雑なモデルで、環境毒素応答や気道リモデリングの研究に応用可能です。

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<meta charset="utf8"></head><body>肺バリアの完全性、疾患、および創薬を研究するための気道モデル

<ol><li>Wu, M., Zhang, X., Lin, Y., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+airway+basal+stem+cells+in+lung+homeostasis+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Roles of airway basal stem cells in lung homeostasis and regenerative medicine.</a> Respir Res. 23 (1), 122(2022).</li>
<li>Blackburn, J. B., Li, N. F., Bartlett, N. W., Richmond, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+in+club+cell+biology+and+its+potential+relevance+to+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">An update in club cell biology and its potential relevance to chronic obstructive pulmonary disease.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (5), L652-L665 (2023).</li>
<li>Fahy, J. V., Dickey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+mucus+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Airway mucus function and dysfunction.</a> N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).</li>
<li>Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+differentiation+and+mucociliary+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance.</a> Ann Am Thorac Soc. 15 (Suppl 3), S143-S148 (2018).</li>
<li>Khalilgharibi, N., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+form+and+function%3A+On+the+role+of+basement+membrane+mechanics+in+tissue+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">To form and function: On the role of basement membrane mechanics in tissue development, homeostasis and disease.</a> Open Biol. 11 (2), 200360(2021).</li>
<li>Mcdonald, D. M., Yao, L. C., Baluk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+airway+blood+vessels+and+lymphatics%3A+Lessons+from+development+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Dynamics of airway blood vessels and lymphatics: Lessons from development and inflammation.</a> Proc Am Thorac Soc. 8 (6), 504-507 (2011).</li>
<li>Parker, D., Prince, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+the+respiratory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in the respiratory epithelium.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 45 (2), 189-201 (2011).</li>
<li>Davis, J. D., Wypych, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+functional+heterogeneity+of+the+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium.</a> Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).</li>
<li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+airway+epithelium%3A+Soldier+in+the+fight+against+respiratory+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses.</a> Clin Microbiol Rev. 24 (1), 210-229 (2011).</li>
<li>Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+emerging+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in emerging viral infections.</a> Front Cardiovasc Med. 8, 619690(2021).</li>
<li>Wang, Y., Zheng, J., Wang, X., Yang, P., Zhao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+and+airway+hyperresponsiveness+associated+with+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages and airway hyperresponsiveness associated with respiratory syncytial virus infection.</a> Front Immunol. 13, 1012048(2022).</li>
<li>Costa, A., De Souza Carvalho-Wodarz, C., Seabra, V., Sarmento, B., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+co-culture+of+human+alveolar+epithelium%2C+endothelium+and+macrophages+for+studying+the+interaction+of+nanocarriers+with+the+air-blood+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Triple co-culture of human alveolar epithelium, endothelium and macrophages for studying the interaction of nanocarriers with the air-blood barrier.</a> Acta Biomater. 91, 235-247 (2019).</li>
<li>Leibel, S. L., Mcvicar, R. N., Winquist, A. M., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+whole+lung+organoids+from+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+lung+developmental+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease.</a> J Vis Exp. (170), e62456(2021).</li>
<li>Mccauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 45 (1), e51(2018).</li>
<li>Choi, K. -Y. G., Wu, B. C., Lee, A. H. -Y., Baquir, B., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+organoid+and+air-liquid+interface+models+as+a+screening+method+in+the+development+of+new+host+defense+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Utilizing organoid and air-liquid interface models as a screening method in the development of new host defense peptides.</a> Front Cell Infect Microbiol. 10, 228(2020).</li>
<li>Fulcher, M. L., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nasal+and+tracheo-bronchial+respiratory+epithelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture.</a> Methods Mol Biol. 945, 109-121 (2013).</li>
<li>Hao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+modeling+of+SARS-COV-2+infection+of+in+vitro+cultured+polarized+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Long-term modeling of SARS-COV-2 infection of in vitro cultured polarized human airway epithelium.</a> mBio. 11 (6), e02852-e02920 (2020).</li>
<li>Patsch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascular+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Cell Biol. 17 (8), 994-1003 (2015).</li>
<li>Van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient%2C+long-term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient, long-term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), e71098(2013).</li>
<li>Pouyanfard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+ameliorate+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human-induced pluripotent stem cell-derived macrophages ameliorate liver fibrosis.</a> Stem Cells. 39 (12), 1701-1717 (2021).</li>
<li>Ardini-Poleske, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lungmap%3A+The+molecular+atlas+of+lung+development+program%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lungmap: The molecular atlas of lung development program.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 313 (5), L733-L740 (2017).</li>
<li>Ronaghan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1-like%2C+but+not+m0-+or+m2-like%2C+macrophages%2C+reduce+RSV+infection+of+primary+bronchial+epithelial+cells+in+a+media-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">M1-like, but not m0- or m2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion.</a> PLoS One. 17 (10), e0276013(2022).</li>
<li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 3 (3), 394-403 (2014).</li>
<li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nat Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li>
<li>Firth, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multiciliated+cells+in+functional+airway+epithelia+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Generation of multiciliated cells in functional airway epithelia from human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), E1723-E1730 (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>12ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルインサート、0.4 & マイクロ;m、半透明&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>アクチビンA</td><td>R&Dシステム</td>ズ<td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>オールトランスレチノイン酸(RA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 レチノイン酸なし&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BMP4&nbsp;</td><td>R&D Systems</td><td>314-BP/CF</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA) フラクション V、7.5% 溶液&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CD 14 (FITC)</td><td>BioLegend</td><td>982502</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 PECAM-1(APC)</td><td>R&D System</td><td>FAB3567A</td><td></td></tr><tr><td>CD 45 (PE)</td><td>BD Biosciences 560975</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD 68 (PE)</td><td>BioLegend</td><td>33808</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021&nbsp;</td><td>アブカム</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>CPM</td><td>富士フイルム</td><td>014-27501</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ&nbsp;</td><td>ステムセルテック</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>ドルソモルフィン</td><td>R&Dシステム</td>ズ<td>3093</td><td></td></tr><tr><td>E-CAD / CD 324(APC)</td><td>BioLegend</td><td>324107</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>EGM2 Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM/CD 326 (APC)</td><td>BioLegend</td><td>324212</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>ギブコ</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ345-FG / CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R&D Systems</td><td>251-KG/CF</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>フィッシャー</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Abcam</td><td>ab120058</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ<td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>ハム」s F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>IBMX (3-イソブチル-1-メチルキサンチン)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>Peprotech</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's 変性ダルベッコ's Medium (IMDM) + Glutamax&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清補充薬(KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>モノチオグリセロール&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus キット (10個/ケース)</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/strep</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 12633012</td><td></td></tr><tr><td>SB431542&nbsp;</td><td>R&D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>SMA</td><td>Invitrogen</td><td>50-9760-80</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5275</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>VEGF165</td><td>Preprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Cell Signaling</td><td>5741S</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632(ロックインヒビター)&nbsp;</td><td>R&Dシステムズ</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>339100</td><td></td></tr></tbody></table>

ipsc由来の上皮細胞、間葉系、内皮細胞、免疫細胞の共培養による肺の健康と疾患における気道バリア完全性のモデル化

iPSC-Derived Epithelial, Mesenchymal, Endothelial, and Immune Cell Co-Culture to Model Airway Barrier Integrity in Lung Health and Disease

iPS細胞由来気道オルガノイド、内皮細胞、免疫細胞、共培養の分化が成功したと評価できる段階は複数あります。分化は異なるiPS細胞系統で行うことができ、このプロトコルは少なくとも5つの異なる系統で試験されています。このプロトコルは、特に播種密度を変更および最適化することにより、すべての新しいiPS細胞株に適合させる必要があります。
iPS細胞由来気道オルガノイドの良好な収量は明視野 で 評価でき、境界/エッジの明確化、半透明/嚢胞性の形態、増殖/拡大能力、壊死細胞の欠如という4つの特性があります。ぼやけて見える気道オルガノイドは、培養の2週間でサイズが大きくなることはなく、壊死がある場合は、共培養実験に使用しないでください。周辺に厚い管腔層を持つオルガノイド vs.半透明/嚢胞性オルガノイドは、その後の実験にも使用できます。しかし、半透明/嚢胞性気道オルガノイドは主に基底細胞で構成されているのに対し、厚い二重膜オルガノイドは主にクラブ細胞で構成されています。基底細胞は増殖・増殖しやすいため、気液間培養や分極に適しています。iPS細胞由来肺オルガノイドの成功収量を評価する他の方法は、表面マーカーCPM(表1)の肺前駆細胞段階(分化16日目)でのフローサイトメトリー分析であり、成功した分化収量&gt;50%CPM+細胞です。
気道オルガノイド解離および気液間期培養では、ECMポリマーがすべて除去されていることを確認してください。そうしないと、細胞がメンブレン上で増殖するのを防ぐことができます。細胞は、空輸前の培養3日目までにコンフルエントになるはずです。iAirwaysの細胞タイプの確認は、それぞれの細胞タイプ特異的マーカー(基底細胞(p63+)、クラブ細胞(SCGB1A1+)、杯細胞(MUC5AC+)、繊毛細胞(AcTub+)を染色することで評価できます。LungMAP21では、肺細胞タイプ特異的マーカーの特性評価と特徴的なマーカーが検証されています。間葉は、ビメンチンまたは平滑筋アクチンに対する抗体で検出できます。より繊毛細胞を生成するために、培養物はより長い期間の空中吊り上げまたはDAPTの添加を必要とする場合があります。
iPS細胞由来内皮細胞の良好な収量は、明視野 を介して 評価でき、丸石のような形態を示しています(iPS細胞由来内皮分化の6日目)。iPS細胞由来の内皮培養が成功すると、&gt;50%のCD31+細胞が含まれ、選別後の収量が500,000細胞を超えるのに十分な細胞が生成される必要があります。細胞は継代または凍結保存することができ、CD31マーカーは、継代または新しい培養ごとにフロー を介して 試験する必要があります。細胞はP4を超えて継代しないでください。参考までに、iPSC由来内皮細胞のCD31ソート前/後(図1C)を参照してください。内皮細胞は平らで、細長い紡錘形の形態を持つ大きな細胞体を持ちます。
マクロファージの分化のためには、胚様体はULAウェルの底に留まり、各ウェルには1つのEBのみが存在するべきです。彼らは5-7日目までに嚢胞性変化を示すはずです。遠心分離後にEBが形成されない場合は、スピンせずにiPS細胞を96ウェルULAプレートに播種します。iPS細胞の数を増やす必要があるかもしれません。iPS細胞由来免疫細胞の収量は、胚様体(EB)が嚢胞に発達する能力に完全に依存しています(分化7日目)。嚢胞を生じないiPS細胞由来免疫EBは、ゼラチンに播種しても間質を形成せず、骨髄性前駆細胞を産生しません。ゼラチンコーティングされたプレートに移した後、EBはプレートの底に付着したままにする必要があります。プレートの動きは、プレートが外れないように慎重に行う必要があります。プレートは週に2回手動で交換し、懸濁した細胞はMac-CM2に継代するか、凍結保存する必要があります。さらに、懸濁した骨髄系前駆細胞を採取した後、それらはコーティングされていないプラスチックフラスコに付着し、マクロファージを示す液胞で明視野の下で明るい細胞を生成する必要があります。単球のマーカーであるCD14+は、懸濁細胞で&gt;90%である必要があります。マクロファージマーカーであるCD68は時間の経過とともに増加し、マクロファージの~50%が2週間後にCD68+を発現します(図1D)。接着効率は、各細胞株について決定する必要があります。平均20%の接着効率を達成しています。分極については、M0マクロファージを分化培地IIで48時間M1(iPSC-M1)またはM2(iPSC-M2)マクロファージのいずれかに分極させ、M1分極のために100 ng/mL LPSおよび20 ng/mL IFN-g、またはM2分極のために50 ng/mL IL-4および20 ng/mL IL-13を添加します。M1偏光のマーカーはCD80+、M2偏光のマーカーはCD206+です。
三重共培養の成功した作製は、上皮タイトジャンクションマーカーEPCAM、ECAD、またはZO-1、または内皮タイトジャンクションマーカーCD31の免疫蛍光 法によって 評価できます(図2C、 表1)。三重共培養の機能は、経電気的上皮/内皮抵抗(TEER) によって も評価できます。適切に組み立てられた気道オルガノイドと内皮共培養は、より大きな電気抵抗を持ち、最適な細胞コミュニケーションと接続を示します。電子タバコやウイルスの侵入などの環境破壊は、上皮および内皮バリアの完全性を損ない、共培養の電気抵抗の減少(図3A、B)および無秩序なタイトジャンクション(図3C)をもたらします。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig01v2.jpg"> 
図1:iPS細胞由来気道上皮、内皮、免疫培養物の鑑別と特性評価。 (A)iAirwayの組み立てのためのiPS細胞指向の鑑別方法の概略図。(B)明視野を特徴とするiPS細胞由来気道上皮オルガノイド(左)およびEPCAMおよびECADのフローサイトメトリー解析(右)。(C)CD31の明視野、免疫蛍光、およびフローサイトメトリー解析(右)を特徴とするiPS細胞由来気道内皮。CD31ソート後のそれぞれの明視野を右側に示します。(D)iPS細胞由来マクロファージは、汎造血マーカーCD45、単球メーカーCD14、およびマクロファージマーカーCD68の明視野解析(左)およびフローサイトメトリー解析(右)によって特徴付けられます。スケールバー:100μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig01largev2.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig02.jpg"> 
図2:iPS細胞由来の上皮細胞、間葉系細胞、内皮細胞、マクロファージ細胞の共培養。 (A)iAirwayの組み立ての概略図。(B)それぞれの上皮および内皮の単一培養、上皮および内皮の二培養、および上皮、内皮、およびマクロファージの共培養の明視野画像。レッドサイトトラッカーでタグ付けされたマクロファージ。スケールバー:100 μm. (C) 細胞培養インサートの頂端側にタイトジャンクションマーカーZO-1、基底外側にCD31の免疫蛍光染色。スケールバー:100 μm. (D) 細胞培養インサートの断面で、頂端側に解離した気道オルガノイドがある、エアリフト後1週間。黒矢印でH&amp;E染色を行った左のパネルは、繊毛細胞を示しています。免疫蛍光イメージングを行った中央のパネルには、上皮マーカーE-カドヘリン(ECAD)が示されています。免疫蛍光イメージングを行った右側のパネルは、ビメンチン(VIM)や平滑筋アクチン(SMA)などの間葉系マーカーを示しています。スケールバー:100μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig02large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig03.jpg"> 
図3:電子タバコとウイルスに曝露されたiAirwaysの気道バリア機能の変化(A)経電気的上皮/内皮抵抗(TEER)測定ツールの概略図。(B)メントール電子タバコを培地に添加してから7日後のTEERの棒グラフ。平均 +/- 95% 信頼区間。N = 5 回の生物学的複製と 3 回の技術的複製。p 値 &lt;0.001。(C)SARS-CoV-2感染前後のタイトジャンクションタンパク質ZO-1の免疫蛍光染色。感染後のZO-1のレイアウトが乱れていることに注目してください。スケールバー:50μmこの<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig03large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>抗体</td>
			<td>アプリケーション</td>
			<td>希釈</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 PECAM-1(APC)</td>
			<td>フローサイトメトリー(FC)</td>
			<td>100 μlバッファー中</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPCAM/CD 326 (APC)</td>
			<td>FCの</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-CAD/CD 324 (APC)</td>
			<td>FCの</td>
			<td>100 ulバッファーに5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>インプレッション 単価</td>
			<td>FCの</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 45 (PE)</td>
			<td>FCの</td>
			<td>100 ulバッファーに5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14(FITC)</td>
			<td>FCの</td>
			<td>100 ulバッファーに5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 68 (PE)</td>
			<td>FCの</td>
			<td>100 ulバッファーに5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ゾ-1</td>
			<td>免疫蛍光法(IF)</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ビメンチン</td>
			<td>もし</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMAの</td>
			<td>もし</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:FACSおよび免疫蛍光法で使用される抗体。
補足ファイル1:メディアとバッファの組成物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Research

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