Name: キメラ抗原受容体T細胞におけるIn vitroゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニングの実施 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 学ぶCAR-T細胞治療の抵抗性メカニズムを解明するためのin vitroゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニング手法。健常者由来キメラ抗原受容体T細胞を用いて、遺伝子編集技術による治療効率向上のための重要な知見を得ることができる。

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重要なことに、以下に概説するプロトコルは、メイヨークリニックの治験審査委員会(IRB 18-005745)および施設バイオセーフティ委員会(IBC HIP00000252.43)のガイドラインに従い、承認を受けています。レンチウイルスの産生を含むすべての細胞培養作業は、適切な個人用保護具を備えた細胞培養フードで実施する必要があります。特に、レンチウイルスの作業は、廃棄前に10%漂白剤を使用してアイテムを消毒するなど、バイオセーフティレベル2(BSL-2)の予防措置の下で実施する必要があります。
1. CRISPRライブラリーの増幅
<ol>
	<li>メーカーの推奨に従ってCRISPRライブラリを増幅します。簡単に説明すると、以下を完了することにより、CRISPRライブラリをエレクトロポレートしてエレクトロコンピテントセルの4つのアリコートにします。<ol>
		<li>1.0 mmキュベット中の25 μLのエレクトロコンピテントセルに、2 μLの50 ng/μL CRISPRライブラリープラスミドを添加します。</li>
		<li>10 μF、600 Ω、1,800 V、3.5 ms〜4.5 msの時定数の設定を使用して、サンプルをエレクトロポレートします。</li>
		<li>975 μLのリカバリー培地で回収し、1 mLのリカバリー培地を追加したチューブに移します。</li>
		<li>すべてのアリコートを250 RPMで37°Cで1時間回転させます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>変換をプレートします。<ol>
		<li>エレクトロポレーションセルのすべてのアリコートをプールし、よく混合します。</li>
		<li>予熱した10 cmのLuriaブロス(LB)プレートに400 μLの形質転換ミックスを100 μg/mLのカルベニシリンで広げて、すべてのエレクトロポレーション細胞をプレート化します。プレートを32°Cのインキュベーターに14時間置きます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>コロニーを収穫します。<ol>
		<li>各プレートに1 mLのLB培地+ 100 μg / mLのカルベニシリンをピペットで移します。コロニーを各プレートからこすり落とし、50mLのコニカルチューブに集めます。</li>
		<li>さらに1 mLのLB培地+100 μg/mLのカルベニシリンを各プレートに加え、洗浄して完全に回復させます。</li>
		<li>マキシプレップキットの指示に従って、マキシプレップを実行します。</li>
		<li>得られたプラスミドDNAをプールします。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. CRISPRライブラリーにおけるベースラインgRNAの発現を検証するための次世代シーケンシング
注:このCRISPRライブラリーのNGSプライマーは、以前の論文27で設計されています。サンプルごとに異なるリバースプライマーを使用すると、各サンプルがバーコード化され、シーケンシング中にサンプルをプールできます。
<ol>
	<li>次の反応混合物(総容量= 50 μL)を使用してPCR用のサンプルを調製します:ハイフィデリティPCRマスターミックス、2x:25 μL;プールされたテンプレートDNA、0.5 μg:1 μL;NGSライブラリフォワードプライマー、10 μM:1.25 μL;NGSライブラリリバースプライマー、10 μM:1.25 μL;DNaseフリー水:21.5μL。</li>
	<li>次のサイクリング条件でPCRを実行します:サイクル1:98°Cで3分間変性します。サイクル2-23:98°Cで10秒間変性、63°Cで10秒間アニール、72°Cで25秒間延長。サイクル24:72°Cで2分間延長します。</li>
	<li>各サンプルのPCR反応をプールし、製造元の指示に従ってPCR精製キットでPCR産物を精製することにより、PCR反応を精製します。</li>
	<li>各サンプルについて3 μgのPCR産物を2%(w/v)アガロースゲルで泳ぎます。</li>
	<li>PCR産物(~260-270 bp)をゲルから取り出し、製造元の指示に従ってゲル抽出キットを使用してゲルからDNAを抽出します。少なくとも500 ngのDNAを目指してください。</li>
	<li>抽出したサンプルは-20°Cで保存します。</li>
	<li>サンプルを用いて次世代シーケンシング(NGS)を行い、gRNA27あたり100リードを目指します。</li>
	<li>MAGeCK-VISPRパイプラインでシーケンシング結果を解析し、ライブラリ内のgRNAの99.5%以上が表されていることを確認28。</li>
</ol>
3. CRISPRライブラリーとCAR発現レンチウイルスの作製
<ol>
	<li>前述のようにレンチウイルスを調製します10,29。<ol>
		<li>1日目:10%ウシ胎児血清(FBS)(v / v)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン(PSG)(v / v)、およびダルベッコの修飾ワシ培地で構成されるD10培地で増殖している80〜90%のコンフルエント293T細胞のT175フラスコから始めます。開始する前に、トランスフェクション試薬とDNAを室温まで温め、DNAを定量します。</li>
		<li>293Tフラスコごとに、2本の50 mLコニカルチューブ A と Bを標識します。4.5 mLの還元血清培地をチューブ A とチューブ Bに加えます。.</li>
		<li>滅菌済みの1.5 mL微量遠心チューブで、18 μgのpCMVR8.74(gag、pol、tat、およびrev)、7 μgのpMD2.G(VSV-G)、および15 μgのレンチウイルス発現ベクター(CRISPRライブラリーAまたはCAR19-28ζベクター)を1分間静置します。</li>
		<li>チューブ Aに129 μLのトランスフェクション試薬を添加します。チューブ A をフィンガーボルテックスでよくミックスします。</li>
		<li>DNA混合物をチューブ Bに加えます。チューブ B をフィンガーボルテックスでよく混ぜます。</li>
		<li>111 μLの中性共脂質試薬をチューブ Bに加えます。チューブ B をフィンガーボルテックスでよく混ぜます。</li>
		<li>チューブ A の内容物をチューブ B に加え、フィンガーボルテックスでよく混ぜます。チューブ B を室温で30分間インキュベートします。</li>
		<li>30分間のインキュベーション期間の終わりに向けて、既存の培地を吸引して293T細胞を調製します。10% FBS(v/v)、1% PSG(v/v)、およびロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640で構成されるR10培地16 mLを16 mL加えます。</li>
		<li>30分間のインキュベーション期間後、チューブ B の内容物(約9mL)を293T細胞のフラスコに滴下します。フラスコを下に置き、静かに回転させてから、37°C、5%CO2でインキュベートします。</li>
		<li>2日目(トランスフェクションの約24時間後)に、次のようにレンチウイルスを収集します。 注意: すべての機器と材料を事前に冷やし、氷の上で以下を実行してウイルス上清を冷たく保ちます。<ol>
			<li>トランスフェクションした293Tフラスコから上清を予冷した50mLコニカルチューブに移します。</li>
			<li>予熱したR10培地30 mLを293Tフラスコに加えます。</li>
			<li>50 mLのコニカルチューブを900 × g で4°C、10分間遠心分離することにより、細胞の破片をペレット化します。</li>
			<li>遠心分離後、0.45 μmフィルターで上清をろ過します。濾液を超遠心分離機で112,700 × g 、4°C、2時間回転させます。</li>
			<li>2時間回転後、約5 mLが残るまで上清を吸引します。.ウイルス粒子を10倍に静かにピペッティングして再懸濁します。ウイルス懸濁液を4°Cで一晩保存してください。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>3日目に、次のようにレンチウイルスを収集して保管します。<ol>
			<li>トランスフェクションした293Tフラスコから上清を予冷した50mLコニカルチューブに移します。</li>
			<li>293Tフラスコに10%漂白剤30mLを加えます。</li>
			<li>50 mLのコニカルチューブを900 gで900 × g 、4°Cで10分間遠心分離することにより、上清中の細胞破片をペレット化します。</li>
			<li>遠心分離後、0.45 μmフィルターで上清をろ過します。濾液を超遠心分離機で112,700 × g 、4°C、2時間回転させます。</li>
			<li>2時間の遠心分離後、約2 mLが残るまで上清を吸引し、10回静かにピペッティングして再懸濁します。ウイルス上清を300〜500μLのアリコートに保存し、-80°Cに保ちます。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. CAR発現レンチウイルスのウイルス力価の計算
注:CARレンチウイルスは、前述の10,12と同様に力価が測定されました。
<ol>
	<li>1日目に、T細胞を活性化してプレートします。<ol>
		<li>ネガティブセレクションキットを使用して、健康なドナーPBMCから1×106 T細胞を単離します。</li>
		<li>T細胞を数えます。</li>
		<li>T細胞を刺激するのに十分なCD3+/CD28+ ビーズを3:1のビーズ:セル比で洗浄してください。例えば、1 × 106 T細胞を刺激するには、3 × 106 ビーズを洗浄します。これを行うには、次の3回を完了してビーズを洗います。<ol>
			<li>磁気分離を使用して、懸濁液からビーズを取り除きます。</li>
			<li>上清を取り除きます。</li>
			<li>10%ヒト血清(v/v)、1%PSG(v/v)、造血細胞培地からなるT細胞培地(TCM)1000 μLを添加します。 注:TCMは、使用前に0.45μmの滅菌真空フィルターでろ過し、次に0.22μmの滅菌真空フィルターでろ過して滅菌する必要があります。</li>
			<li>T細胞懸濁液にビーズを3:1のビーズ:セル比で添加します。</li>
			<li>T細胞をTCMで1 × 106 細胞/mLに再懸濁します。</li>
			<li>100 μLの活性化T細胞を96ウェルプレートの10ウェルに添加します。プレートを37°C、5%CO2でインキュベートします。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2日目に、次のように希釈プレートを作成して、CARレンチウイルスの希釈を追加します。<ol>
		<li>100 μLのTCMを96ウェルプレートの7ウェルに添加します。</li>
		<li>最初のウェルに、目的のウイルス50μLを加えます。よく混ぜます。</li>
		<li>ウェル1からウェル2に50μLを添加して、ウイルスをさらに連続希釈します。よく混ぜます。</li>
		<li>ウェル2からウェル3に50μLを加え、このパターンをウェル7まで続けます。</li>
		<li>ウェル7を混合した後、50 μLを取り出し、すべてのウェルの総容量が100 μLであることを確認します。</li>
		<li>希釈プレートの各ウェルから50μLを1日目のT細胞プレートの最初の7つのウェルに加えます。よく混ぜます。</li>
		<li>T細胞プレートの最後の3つのウェルに、50μLのTCMを加えます。よく混ぜます。プレートを37°C、5%CO2のインキュベーターに保管します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3日目に、T細胞プレートのすべてのウェルに100μLのTCMを加えて細胞を給餌します。よく混ぜます。</li>
	<li>4日目に、以下を完了することにより、CAR発現の代替マーカーである抗カッパ鎖抗体でCARを発現する細胞の割合を検出するためにフローサイトメトリーを実施します。<ol>
		<li>T細胞プレートを1,000 × g で3分間スピンダウンし、デカントします。</li>
		<li>200 μLの抗κ鎖抗体バッファーを加え、プレートを1,000 × g で3分間スピンダウンし、デカンテーションして、抗κ鎖抗体バッファー(PBS中の4%ウシ血清アルブミン(w / v)で構成)でプレートを3回洗浄します。</li>
		<li>ビオチン抗κ鎖抗体を各ウェルに添加します。ロッカー上で45分間インキュベートし、4°Cで保存します。</li>
		<li>ステップ4.4.2と同様に、プレートを抗κ鎖抗体バッファーで3回洗浄します。</li>
		<li>フローサイトメトリー用の細胞を、蛍光色素標識ストレプトアビジン抗体と生/死抗体で染色します。サンプルを暗所で室温で15分間インキュベートします。</li>
		<li>200 μLのフローバッファーを加え、プレートを1,000 ×gで3分間スピンダウンし、デカンテーションして、フローバッファー(2% FBS(v / v)とPBS中の1%アジ化ナトリウム(v / v)で構成)でサンプルを一度洗浄します。</li>
		<li>100 μLのフローバッファーに再懸濁し、サイトメーターで実行します。</li>
		<li>3つの未形質導入ウェルでネガティブゲーティングを行います。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. CRISPRライブラリーレンチウイルスのウイルス力価の計算
注:このプロトコルは、CRISPRライブラリーレンチウイルスを滴定するための最小数のT細胞を説明していますが、より多くのT細胞、したがって大量のウイルスに対応するためにスケールアップすることができます。
<ol>
	<li>0日目に、18 × 106 CD3+/CD28+ ビーズ (ビーズ:細胞比 3:1) を 6 × 106 T細胞に添加し、TCM で最終容量を 6 mL にすることで T 細胞を活性化します。0.5 mLのT細胞懸濁液を48ウェルプレートの12ウェルに分注します。インキュベーターに37°C、5%CO2で保存します。</li>
	<li>24時間後の 1日目に、感染の多重度(MOI)が3のCARウイルスをすべてのウェルに追加します。ピペッティングを数回上下させてよく混ぜます。インキュベーターに37°C、5%CO2で保存します。</li>
	<li>48時間後の 2日目に、次のボリュームのCRISPRウイルスのいずれかを各ウェルに追加することにより、活性化CART細胞に一連のCRISPRライブラリウイルスボリュームを追加します(0 μL、0 μL、6.25 μL、6.25 μL、12.5 μL、12.5 μL、25 μL、25 μL、50 μL、50 μL、100 μL、または100 μL)。ピペッティングを数回上下させてよく混ぜます。インキュベーターに37°C、5%CO2で保存します。</li>
	<li>3日目に、次のCRISPRウイルス容量(0 μL、6.25 μL、12.5 μL、25 μL、50 μL、100 μL)をそれぞれ投与したウェルを含む、培地1 mLあたり1 μgのピューロマイシンをウェルの半分に加えます。他のウェルはピューロマイシンで処理されません。</li>
	<li>4 日目から 8 日目まで、毎日 T 細胞をカウントし、最終的な細胞密度を 1 × 106 細胞/mL に調整し、ピューロマイシン処理ウェルの場合は TCM に 1 μg/mL ピューロマイシンを使用し、未処理ウェルには TCM を使用します。</li>
	<li>8日目に、ウェルあたりの生細胞の数をカウントし、次の式を使用してウイルス上清の形質導入単位/ mLを計算します。 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67338/67338eq01.jpg" style="margin: auto;"> ここで、A:ウイルスに形質導入された生細胞数。B:抗生物質選択なしのコントロールウェルでの生細胞数。V:各ウェルの感染に使用されたウイルスの量。D:希釈倍率。</li>
	<li>約 20% の形質導入効率を示すウェルから計算した TU/mL ウェルを使用して、次の式を使用して MOI 0.3 で 1 個× 10個の 6 個の細胞を形質導入するために必要なウイルスの量を計算します。 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67338/67338eq02.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol>
6. CRISPRスクリーニングのCART細胞産生段階(0日目から8日目)
注:以下のプロトコルは、1回の生物学的複製におけるCRISPRスクリーニングの完了を説明しています。しかし、このプロトコルは以前に3つの生物学的複製で検証されており、このプロトコル30を完了する他のものに対しては、少なくとも3つの生物学的複製を使用することを推奨する。
<ol>
	<li>0日目:前述のように、健康なドナーの血液からT細胞を分離して刺激します10。<ol>
		<li>匿名化された健康なドナー血液から末梢血単核細胞(PBMC)を分離します。<ol>
			<li>15 mLの密度グラジエント培地を密度グラジエント分離チューブに加えます。</li>
			<li>1:2 に希釈した血液を密度勾配分離チューブの上部に加えます。1,200 × g で室温で10分間遠心分離します。 </li><li></li><li></ol></li><li> </li><li><ol><li><li></li><li></li><li></li></ol></li></ol></li><li> </li><li> </li><li></li><li></li></ol><ol><li><ol><li></li><li><li><ol><li></li><li><li></li><li> </li></ol></li></ol></li><li></li><li></li><li><ol><li></li><li></li><li></li></ol></li><li></li><li><ol><li></li><li></ol></li></ol><ol><li><li><ol><li><li><li></li><li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></li><li></li><li><li><li></li><li></ol></li></ol>

<meta charset="utf8"></head><body>治療抵抗性を調査するためのCART細胞におけるゲノムワイドCRISPRスクリーニング

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<li>Sakemura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer-associated+fibroblasts+in+the+bone+marrow+prevents+resistance+to+CART-cell+therapy+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer-associated fibroblasts in the bone marrow prevents resistance to CART-cell therapy in multiple myeloma.</a> Blood. 139 (26), 3708-3721 (2022).</li>
<li>Stewart, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+drives+exhaustion+of+CD8%2B+CART+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">IL-4 drives exhaustion of CD8+ CART cells.</a> Nat Commun. 15 (1), 7921(2024).</li>
<li>FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Babraham Bioinformatics. 
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<li>Bbmerge. , 
 <a target="_blank" href=" https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh"> https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh</a> (2019).</li>
<li>Pattanayak, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+profiling+of+off-target+DNA+cleavage+reveals+RNA-programmed+CAS9+nuclease+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed CAS9 nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-CAS9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-CAS9-mediated gene inactivation.</a> Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li>
<li>Dong, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+immunotherapy+target+discovery+using+genome-scale+in+vivo+CRISPR+screens+in+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells.</a> Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+CRISPR+screens+in+vivo+map+T+cell+fate+regulomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell CRISPR screens in vivo map T cell fate regulomes in cancer.</a> Nature. 624 (7990), 154-163 (2023).</li>
<li>Sutra Del Galy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+CRISPR+screens+identify+SOCS1+as+intrinsic+checkpoint+of+CD4%2B+TH1+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide CRISPR screens identify SOCS1 as intrinsic checkpoint of CD4+ TH1 cell response.</a> Sci Immunol. 6 (66), eabe8219(2021).</li>
<li>Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-intrinsic+determinants+of+CAR-T+response+revealed+by+iterative+in+vivo+genome-wide+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Leukemia-intrinsic determinants of CAR-T response revealed by iterative in vivo genome-wide CRISPR screening.</a> Nat Commun. 14 (1), 8048(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>293T 細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>レンチウイルス産生に使用される細胞</td></tr><tr><td>ビオチン プロテイン L 抗体</td><td>GenScript</td><td>M00097</td><td>CAR 検出用抗カッパ鎖抗体</td></tr> ウ<tr><td>シ血清アルブミン</td><td>ミリポア シグマ</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン二ナトリウム塩</td><td>ミリポア シグマ</td><td>C1389-1G</td><td>カルベニシリン抗生物質</td></tr><tr><td>CD4 分離ビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD8 分離ビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-201</td><td></td></tr><tr><td>CTS (細胞治療システム) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>Cytoflex</td><td>Beckman Coulter</td><td>NC2279958</td><td></td></tr><tr><td>DNase-Free Water</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ修飾鷲培地 (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco のリン酸緩衝生理食塩水</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>EasySep ヒト T 細胞分離キット</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951RF</td><td>陰性分離キット</td></tr><tr><td>Endura Electrocompetent Cells&nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td>60242-1</td><td>回収培地付きエレクトロコンピテント細胞</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>ミリポア シグマ</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>GeCKO v2 CRISPR ノックアウト プール ライブラリ A</td><td>AddGene</td><td>1000000048</td><td>CRISPR ライブラリ プラスミド</td></tr><tr><td>Gene Pulser II&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2105</td><td>エレクトロポレーター</td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>ミリポア シグマ</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>JeKo-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>CD19+ 標的細胞&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000トランスフェクション試薬</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000075</td>トランスフェクション試<td>薬キット(Lipofectamine 3000試薬)と中性共脂質試薬(p3000)</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Aqua</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7851</td><td>密度勾配培地</td></tr><tr><td>Machery-Nagel NucleoBond Xtra Maxi キット</td><td>ThermoFisher Scientific 12748412</td><td></td><td>Maxi-prep kit</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2X PCR MasterMix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541S</td><td>High Fidelity PCR mastermix</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 還元血清培地</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>還元血清培地</td></tr><tr><td>pCMVR8.74</td><td>AddGene</td><td>22036</td><td>レンチウイルス包装プラスミド</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>AddGene</td><td>12259</td><td>VSV-G エンベロープ発現プラスミド</td></tr><tr><td>プールされたヒト AB 血清&nbsp;</td><td>革新的な研究</td><td>ISERABHI</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick ゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Gek 抽出キット</td></tr><tr><td>Qucik-DNA Midiprep Plus Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4075</td><td>キットは gDNA の分離に使用されます</td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>自動細胞分離器</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 培地 (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>21870092</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td>密度勾配分離チューブ</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>71448-16</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン抗体 (PE)</td><td>BioLegend</td><td>405203</td><td>二次抗体CAR検出に使用</td></tr><tr><td>T100サーマルサイクラー</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機(Optima XPN-80)</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A99839</td><td></td></tr>真空<tr><td>フィルターシステム、0.22&マイクロ。m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>567-0020</td><td></td></tr><tr><td>真空フィルターシステム、0.45 & micro;m</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>165-0045</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 無血清造血細胞培地</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td>造血細胞培地</td></tr></tbody></table>

キメラ抗原受容体t細胞におけるin vitroゲノムワイドcrisprノックアウトスクリーニングの実施

Performing an In Vitro Genome-Wide CRISPR Knockout Screen in Chimeric Antigen Receptor T Cells

CART細胞の活性を偏りなく改善するために編集可能な遺伝子と経路を調べるために、in vitroゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーンを設計しました(図1)。このスクリーニングには、CART細胞産生期と選択圧期の2つのフェーズがあります。CART細胞の産生段階では、少なくとも110×106 T細胞が最初に健康なドナーPBMCから単離され、CD3+/CD28+ビーズで活性化されます。翌日の1日目に、MOI3.0でCARレンチウイルスを添加し、CD19抗原を標的とするCART細胞(CART19細胞)を作製します。2日目に、CRISPRライブラリーレンチウイルスをMOI0.3でCART細胞に加えます。3日目から8日目まで、CART細胞をTCMの1×106細胞/ mLの濃度に維持し、ピューロマイシンを1μg...

キメラ抗原受容体T細胞におけるIn vitroゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニングの実施

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy is an innovative form of targeted immunotherapy that has revolutionized the treatment of cancer. However, ...

performing-an-vitro-genome-wide-crispr-knockout-screen-chimeric

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオは、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞をex...

キメラ抗原受容体T細胞を作製するex vivo技術

このビデオは、腫瘍抗原特異的キメラ抗原受容体(CAR)T細胞のex...

腫瘍特異的キメラ抗原受容体T細胞を作製するためのex vivo技術

ここでは、抗腫瘍 T 細胞の活動の表現型および機能解析を可能にする T...

キメラ抗原受容体の T 細胞の抗腫瘍機能の予測評価のため培養腫瘍細胞の再投与に

CRISPR-Cas9技術は、あらゆる細胞型の哺乳類ゲノムを正確に編集する効率的な方法を提供し、ゲノム全体の遺伝スクリーンを実行する新しい手段を表します。プールされたゲノム全体のCRISPR-Cas9スクリーンのパフォーマンスを成功させるには必要な手順を説明する詳細なプロトコルをここで提供します。...

哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール

ここでは、子宮胚性レンチウイルス注射で超音波誘導を使用した迅速かつ直接的なin vivo...

In Vivo CRISPR/Cas9スクリーニングによるマウス皮膚と口腔の遺伝子機能の同時評価

ヒトCRISPR設計CAR-T細胞の製造

このプロトコルは、レトロウイルスベクターの生産とマウスT細胞の形質導入を合理化し、マウスCAR-T細胞の効率的な生成を促進します。...

マウスキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の効率的な作製

このプロトコールは、ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞(CAR制御性T細胞)を生成および試験するための合理化されたワークフローを提供します。...

ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞の作製

ここでは、1つのT細胞とがん標的細胞を内包したダブルエマルジョン液滴を作製し、細胞死を1細胞レベルで調べる方法について述べる。この方法により、大規模なT細胞集団内の細胞傷害性分子と標的細胞のアポトーシスの両方を二重に定量できます。...

キメラ抗原受容体T細胞を単一細胞レベルで評価するための液滴ベースの細胞毒性アッセイ

CAR T細胞におけるCRISPR-Cas9スクリーニングの改良:ライブラリー調製のための洗練された方法

学ぶCAR-T細胞治療の抵抗性メカニズムを解明するためのin vitroゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニング手法。健常者由来キメラ抗原受容体T細胞を用いて、遺伝子編集技術による治療効率向上のための重要な知見を得ることができる。

キメラ抗原受容体T細胞におけるIn vitroゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニングの実施

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