キメラ抗原受容体T細胞におけるIn vitroゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニングの実施

カー T 細胞療法は、10 年以上にわたって寛解をもたらしてきた革新的なタイプのがん免疫療法です。ただし、永続的な応答の割合は依然として限られています。このプロトコルにより、耐性の背後にあるメカニズムの理解を深め、CAR T 細胞療法に対する反応を改善するツールを作成することを目指しています。

現在、CAR T 細胞療法を改善するために、併用療法や CAR 設計の最適化など、多くのアプローチが採用されています。しかし、注入前のCAR T細胞産物のエピジェネティックプロファイルが重要な決定反応であるという証拠が増えているため、遺伝子編集技術が一般的なツールになっています。

CAR T 細胞のゲノム編集は、前臨床および臨床研究で毒性を予防し、CAR T 細胞の増殖と持続性を高めることに成功していることが示されています。ゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニングのプロトコルは、CAR T細胞機能を改善するための最適な遺伝子編集を決定するための効率的で偏りのないアプローチを提供します。

ゲノムワイドな遺伝子摂動が効果を発揮するには、大規模で適切な選択条件が必要です。CAR T細胞枯渇の発生を研究するために、最適な遺伝子編集を選択するには、8,000万以上のCAR T細胞を2週間刺激する必要があることを学びました。

私たちのプロトコルは疲労の発症を評価するように設計されていますが、このプロトコルは、他の耐性メカニズムの発症を評価するために調整できます。さまざまな設定でゲノムワイドスクリーニングを完了することで、最終的にはCAR T細胞療法に対する全体的な反応を改善するための最良の編集を決定する可能性があります。

[ナレーター]CAR T細胞にCRISPRライブラリーを形質導入した後、サンプルを摂氏4度で5分間300gで遠心分離して洗浄します。上清を吸引し、サンプルを20ミリリットルのT細胞培地に再懸濁します。次世代シーケンシングのためにサンプルを保存するには、ガイドRNAあたり500細胞のガイドRNA表現を維持するために、十分な量のCAR T細胞を50ミリリットルの円錐形チューブに分注します。サンプルを300gで摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、細胞ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁し、2ミリリットルの微量遠心チューブに移します。50ミリリットルのコニカルチューブを1ミリリットルのPBSで洗浄し、洗浄液を同じ微量遠心チューブに移します。次に、サンプルを摂氏4度で5分間500gで遠心分離します。上清を取り除き、細胞ペレットを摂氏-20度で保存します。共培養を開始するには、CAR T細胞をCD19陽性のJeKo-1細胞に1対1の比率で添加します。T細胞培地で共培養の総量を160ミリリットルにし、サンプルを5%の二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターに保存します。CAR T細胞を再刺激するには、共培養物を50ミリリットルの円錐形チューブに集め、サンプルを摂氏4度で5分間300gで遠心分離します。各サンプルを80ミリリットルのT細胞培地に再懸濁し、80ミリリットルのT細胞培地に6つのJeKo-1細胞の累乗に80×10を加えます。サンプルを摂氏37度のインキュベーターに5%の二酸化炭素で保存します。15日目に、共培養からCAR T細胞を単離するために、最初に細胞をカウントします。CD4陽性T細胞用のポジティブセレクションキットとCD8陽性T細胞用のポジティブセレクションキットを組み合わせて、CAR T JeKo-1共培養物からT細胞を単離します。次に、単離されたT細胞を数えます。次世代シーケンシングのためにサンプルを保存するには、6つのCAR T細胞の33×10の累乗を50ミリリットルのコニカルチューブに分注し、サンプルを摂氏4度で5分間300gで遠心分離します。細胞ペレットを1ミリリットルのPBSに再浮遊し、2ミリリットルの微量遠心チューブに移します。次に、50ミリリットルのコニカルチューブを1ミリリットルのPBSで洗浄し、洗浄液を同じ微量遠心チューブに移します。サンプルを遠心分離し、上清を除去した後、細胞ペレットを摂氏-20度で保存します。まず、ゲノムDNA単離キットを使用して、凍結CAR T細胞ペレットからゲノムDNAを単離します。最初に100%エタノールを摂氏-20度に予冷することにより、エタノール沈殿によって単離されたゲノムDNAを精製します。溶出したDNAをいくつかの微量遠心チューブに均等に分注し、各アリコートが200〜250マイクロリットルになるようにします。2 容量の予備冷却された 100% エタノール、0.1 容量の 3 モル酢酸ナトリウム、および 1 マイクロリットルの 20 ミリグラムのグリコーゲンを追加します。サンプルを摂氏-20度で一晩インキュベートします。2日目に、サンプルを13,000gで20分間回転させて、沈殿したDNAをペレット化します。上清を取り除き、ペレットを7,500gで10分間回転させて70%エタノール1ミリリットルで洗浄します。ペレットを完全に乾燥させた後、ペレットを50マイクロリットルの滅菌水に再懸濁します。次世代シーケンシング用のゲノムDNAを調製するには、ここに示す指定された反応混合物でPCRを設定します。次に、次のサイクル条件を使用してPCRを実行します。各サンプルのPCR反応を引き出し、メーカーの指示に従ってPCR精製キットを使用してPCR産物を精製します。各サンプルに対して3マイクログラムのPCR産物を2%アガロースゲル上で実行します。メーカーの指示に従って、ゲル抽出キットを使用してDNAを抽出し、ゲルからPCR産物を除去します。抽出したサンプルは摂氏-20度で保管します。