Name: 脳腫瘍に対する同所性患者由来異種移植モデルの確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学ぶ 脳腫瘍の同所性患者由来異種移植モデル構築法。ステレオタキシック装置を用いた脳内移植と術後モニタリングにより、小児高悪性度神経膠腫やびまん性中線神経膠腫の治療開発に貢献します。

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</ol>

<table><tbody><tr><td>麻酔薬(例: イソフルラン)</td><td>メルク</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>100%エタノール</td><td>メルク</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td>NA</td><td>NA</td><td>100%エタノールから70%エタノールを作り、滅菌水で希釈します</td></tr><tr><td>80%エタノール</td><td>NA</td><td>NA</td><td>100%エタノールから80%エタノールを作り、滅菌水で希釈します</td></tr><tr><td>粘着顕微鏡スライド</td><td>メルク</td><td>Z681156</td><td></td></tr><tr><td>鎮痛剤(ブプレノルフィン 0.3mg/mL)</td><td>ジュロックス</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>カーボンフィルターキャニスター</td><td>獣医装備</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ 15 mL (ファルコン)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ 50 mL (ファルコン)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>DMSOの</td><td>メルク</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>イヤーバー</td><td>コプフ</td><td>1921</td><td></td></tr><tr><td>ECMハイドロゲル(マトリゲル、コーニング)</td><td>メルク</td><td>E1270</td><td></td></tr><tr><td>眼軟膏(Poly Visc)</td><td>化学者ダイレクト&nbsp;</td><td>719986</td><td></td></tr><tr><td>胎児用子牛血清</td><td>メルク</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>ガラス製マイクロシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノールワイプ</td><td>メディサ</td><td>SUL_LWMS-1</td><td></td></tr><tr><td>KI67抗体</td><td>アブカム</td><td>ab209897</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>211-2130</td><td></td></tr><tr><td>マイクロドリルビット&nbsp;0.028インチ</td><td>コプフ</td><td>8170</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクションユニット</td><td>コプフ</td><td>5004</td><td></td></tr><tr><td>PBSの</td><td>メルク</td><td>P4474</td><td></td></tr><tr><td>ピペット 10mL</td><td>コーニング</td><td>CLS4488</td><td></td></tr><tr><td>ピペット 1mL&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>ピペット 200uL</td><td>エッペンドルフ</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>ピペット 20uL</td><td>エッペンドルフ</td><td>3123000098</td><td></td></tr><tr><td>ピペット 25mL</td><td>コーニング</td><td>CLS4489</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ 1mL</td><td>コーニング</td><td>CLS4868</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ 200uL</td><td>コーニング</td><td>CLS4860</td><td></td></tr><tr><td>ポリソルベート20洗剤(F10SC)</td><td>健康と衛生</td><td>G3070型</td><td></td></tr><tr><td>パルスオキシメータ(MouseSTAT)</td><td>ケント・サイエンティフィック</td><td>SPO2-MSE</td><td></td></tr><tr><td>リオジン(ポビドンヨウ素)</td><td>メルク</td><td>Y0000466</td><td></td></tr><tr><td>メス(使い捨て)</td><td>メディサ</td><td>SUL_SCALPEL</td><td></td></tr><tr><td>スキングルー ベトボンド</td><td>メディサ</td><td>3M_1469SB</td><td></td></tr><tr><td>デジタルディスプレイコンソール付き小動物定位装置&nbsp;</td><td>コプフ</td><td>940</td><td></td></tr><tr><td>定位ドリル&nbsp;</td><td>コプフ</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>温度監視システム&nbsp;</td><td>ハーバード大学装置</td><td>55-7020</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>メルク</td><td>93595</td><td></td></tr></tbody></table>

脳腫瘍に対する同所性患者由来異種移植モデルの確立

Establishment of Orthotopic Patient-derived Xenograft Models for Brain Tumors using a Stereotaxic Device

脳腫瘍モデルの開発には、脳定位固定装置を用いた同所性注射が不可欠となっています。この技術により、腫瘍細胞の正確で再現性のある配置が可能になり、神経腫瘍学の研究で一貫性のある信頼性の高いデータを生成するために重要です。同所性注射の成功は、定位固定装置フレーム、正確な動きのためのデジタルマイクロマニピュレーター、注射器、動物を固定するための麻酔システムなど、定位固定装置の正確なセットアップに大きく依存しています(図1A、B)。ガラス製マイクロシリンジを使用すると、通常2〜5μLの少量の頭蓋内注射が可能になります。適切なメンテナンスと頻繁な洗浄は、注射をブロックする可能性のある生物学的材料の蓄積を防ぐために不可欠です(図1C)。
マウスの定位固定装置を使用した脳腫瘍細胞の頭蓋内注射の手順には、いくつかの重要なステップが含まれます。まず、マウスは、手順全体を通して静止して快適に保つために麻酔をかけられます。動物が麻酔をかけられていることを示す典型的な手がかりには、つま先をつまむときの動きや反射の欠如、および規則的な呼吸パターンの存在が含まれます。次に、マウスを脳定位固定装置フレームに配置し、頭を固定位置に固定します(図2A)。ブレグマやラムダなどの頭蓋骨のランドマークを使用して、注射の正確な座標が決定されます。頭皮に小さな切開を行い、選択した座標で頭蓋骨にバリ穴を開けます(図2B)。定位固定装置アームに取り付けられたマイクロインジェクション針をバリ穴に挿入して、腫瘍細胞を目的の脳領域(皮質、小脳、または脳幹; 図2C)。針の位置を注意深く監視および調整することで、正確なターゲティングが保証されます。注射後、針をゆっくりと引き抜き、切開部を閉じます(図2D)。密封された創傷は、頭蓋内注射後2週間以内に治癒する見込みです。
頭蓋内注射後、動物は全体的な健康状態と神経学的症状の発症を注意深く監視する必要があり、これはしばしば腫瘍の進行を示します(補足表1)。通常、動物は注射後1週間目にわずかな体重減少(最大体重の最大10%)を経験することがあり、通常、注射部位が2週 目の終わりまでに完全に密閉されると安定します。一般に、動物は着実に体重が増加し、腫瘍の進行が起こるまで全身の健康状態を良好に保ちます。神経症状の発現は、脳腫瘍の種類、注射部位、動物系統などの要因によって異なります。例えば、皮質神経膠腫や上衣腫は進行性の体重減少や前脳肥大の可能性を呈することがありますが、脳幹神経膠腫や髄芽腫は、特に免疫不全の動物では運動失調や頭の傾きなどの症状を示すことがあります(図3A)。さらに、脳幹腫瘍を有する動物、特にNSGまたはNOD/SCID株において、旋回行動が観察されることがある。神経学的症状の進行は、多くの場合、段階的な体重減少と一致します。長いノズル付きのウォーターボトルを提供したり、柔らかい食べ物(どろどろした食品ペレット)や種子を提供したりするなど、適切なケア後の対策は、動物の健康をサポートするために不可欠です。実験エンドポイントに到達し、その後の動物の人道的な安楽死に到達すると、注射部位の肥大や出血領域の存在など、脳の潜在的な変化が明らかになる可能性があります(図3B)。
Kaplan-Meierグラフは、脳腫瘍動物モデルの生存結果を表現するために一般的に使用されます。これらは、頭蓋内注射または抗がん治療後の経時的な生存確率を視覚的に描写しています。これらのグラフは、前臨床研究の現場で生存データを分析および提示するための重要なツールとして機能します15,27。髄芽腫細胞培養D425の頭蓋内注射を小脳のさまざまな細胞密度で行いました。頭蓋内注射されたすべての動物は腫瘍を発症しました。その結果、細胞密度が高いほど、特にマウスあたり50,000個および100,000個の細胞が、マウスあたり10,000個の細胞よりも急速に生着することが示されました(図4)。さらに、患者由来の高悪性度神経膠腫(HGG)細胞を皮質と脳幹に頭蓋内注射し、これらの異なる部位での全生存期間と腫瘍増殖パターン、免疫組織化学的特徴を比較しました。場所に関係なく、すべての動物に頭蓋内に発生した腫瘍を注射しました。HGG細胞の培養は、ステップ1.1〜1.10で詳述したプロトコルに従って行った。頭蓋内注射のための細胞の調製は、ステップ2.1〜2.6に記載したように行ったが、頭蓋内注射手順は、ステップ4.1〜4.16で概説した方法に固執した27。皮質に注射すると、HGG細胞は頭蓋内注射後約25日間の生存期間の中央値を示しました(図5A)。動物は、ステップ5.1から5.4で概説されているようにモニターした。これらの動物は神経学的症状を示さなかったが、進行性の体重減少を示した。動物は、ステップ5.5で概説した人道的なエンドポイントに到達したときに人道的に安楽死させられました。脳は、ステップ6.1から6.5で詳述されたプロトコルに従って採取され、さらなる分析27のために送られた。免疫組織化学的分析により、血管新生の増加(図5B)および多数の増殖性Ki67細胞(図5C)の証拠を伴う、大きくて高度に核化された腫瘍塊が明らかになりました。脳幹に注射すると、HGG細胞は頭蓋内注射後約26日間の生存期間の中央値を示しました(図5D)。免疫組織化学的分析では、第4脳室/上部橋領域に大きな腫瘍塊があり、側脳室への軟髄膜浸潤が示されました(図5E)。さらなる免疫組織化学的分析により、脳幹およびその他の浸潤領域に多くの増殖性細胞が示されました(図5F)。この実験は、同じ腫瘍細胞を異なる解剖学的位置に注入しても腫瘍の増殖速度に影響を与えないことを強調していますが、成長パターンにはいくつかの違いが観察されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig1.jpg"> 
図1:脳腫瘍細胞の頭蓋内注射のための定位固定装置の代表的な画像 (A)麻酔装置は通常、BSCフードの隣に配置されるため、誘導室と定位固定装置の両方に麻酔を二重に投与する必要があります。(B)ガラス製マイクロシリンジ洗浄ステーションと定位固定装置ホルダー。シリンジは、各頭蓋内注射後に生理食塩水、エタノール、続いて水で洗い流す必要があります。.(C)BSCフード内の定位固定装置、麻酔室、ボール盤、定位固定装置、定位固定装置、固定装置、綿チップ、メス、ピンセット、ピペット、チップを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig2.jpg"> 
図2:免疫不全マウスに対して頭蓋内注射を行っている代表的な画像(A)麻酔円錐体に配置された麻酔動物。(B)皮膚を切開した後、耳のバーで両側に皮膚を固定します。(C)注射用のドリル穴の上に配置されたガラスマイクロシリンジ。(D)皮膚は接着するとモヒカンスタイルを形成します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig3.jpg"> 
図3:脳腫瘍細胞の生着後に観察された潜在的な神経学的症状(A)脳幹にDMG細胞を頭蓋内注射した後に頭部が傾いた動物。(B)注射側が腫瘍形成を明らかにする右皮質半球の拡大。動物に上衣腫細胞を注射した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig4.jpg"> 
図4:異なる細胞密度での髄芽腫培養D425の生着。 髄芽腫細胞を、2 μL の ECM ハイドロゲル、50,000 細胞、および 100,000 細胞に 10,000 細胞の密度で定位固定装置を使用して頭蓋内注射しました。動物は漸進的な体重減少について監視され、記録された最高体重を20%下回ると人道的に安楽死させられました。10,000個の細胞を注入した動物の生存期間の中央値は29日でしたが、細胞密度が50,000個と100,000個の細胞を注入した動物の生存期間の中央値は、それぞれ17.5日と15日でした。この研究で注射されたすべての動物は、腫瘍を成功裏に発症しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig5v2.jpg"> 
図5:皮質および脳幹にHGG細胞を頭蓋内注射したNSG動物の代表的な生存曲線および組織学的解析。 約100,000個のHGG細胞(継代3)を2μLのECMハイドロゲルに脳定位固定装置を用いて注入しました。動物は漸進的な体重減少のために監視され、記録された最高体重を20%下回ると人道的に安楽死させられました。この脳腫瘍亜型では神経学的症状は観察されなかった。(A)HGG細胞を皮質に注入した動物の生存期間の中央値は、注射後約25日(N=2)です。(B)皮質のH&amp;E染色は、血管新生の増加を伴う高度に核化された領域を示しており、これは赤血球の存在によって示される。(C)皮質の腫瘍生着領域は、KI67染色で示されるように、高レベルの増殖性細胞を示します。(D)HGG細胞を脳幹に注入した動物の生存期間の中央値は、注射後約26日(N = 2)です。この研究で注射されたすべての動物は、腫瘍を成功裏に発症しました。(E)脳幹のH&amp;E染色は、側脳室の軟髄膜に腫瘍浸潤が観察される高度に核化された領域を示している。(F)脳幹の腫瘍生着領域は、KI67染色で示されるように、高レベルの増殖性細胞を示します。メイン画像の黒いスケールバーは2mmを示し、拡大挿入された画像は20μmを示しています <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig5v2large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1: 動物の頭蓋内注射および抗がん剤による治療の可能性の検査に使用されるモニタリングフォーム。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of ...

establishment-orthotopic-patient-derived-xenograft-models-for-brain

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

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