脳腫瘍に対する同所性患者由来異種移植モデルの確立

私の研究では、びまん性正中神経膠腫、高悪性度神経膠腫、上衣腫、エナメル芽腫などの進行性の小児脳腫瘍の新しい治療法の開発に焦点を当てています。私たちの目的は、新しい薬物標的を見つけ、患者に変化をもたらす治療法を開発すると同時に、これらの腫瘍が周囲の脳環境にどのような影響を与えるかを研究することです。小児脳腫瘍研究では、頭蓋内注射、高度なイメージング、ハイスループット薬物スクリーニングを用いた患者由来の異種移植モデルを開発しました。

単一細胞や特殊トランスクリプトミクスなどの技術は、腫瘍が脳環境や治療効果にどのような影響を与えるかを理解するのに役立ち、新しい治療法を探求することができます。小児がん研究所の脳腫瘍グループは、小児がん個別化医療ゼロプログラムを通じて、多くの小児脳腫瘍小児モデルを開発してきました。びまん性正中神経膠腫は、血液脳関門が無傷であるため、薬物治療に耐性があることがわかりました。

エピジェネティックおよび発癌性経路を標的とする有望な治療法は、小児の生存率を改善し、現在臨床開発中です。同所性脳腫瘍モデルを用いて、腫瘍が脳血管系にどのような影響を与えるかを理解したいと考えています。特殊なトランスクリプトミクスなどの技術を応用することで、脳腫瘍の影響を受ける経路を特定したいと考えています。

この知識は、バリアを緩め、薬物治療をより効果的に浸透させる血液脳関門調節因子を特定するのに役立ちます。まず、培養した神経球形成脳腫瘍細胞を解凍します。バイオセーフティキャビネットで、培養細胞と培地を組織培養フラスコから血清学的ピペットで50ミリリットルの円錐形チューブに慎重にピペットで取り出します。

コニカルチューブを室温で最大5分間300 Gで遠心分離します。25ミリリットルのピペットで、ペレットの上に培地を吸引し、チューブ内に約0.5ミリリットルを残します。1ミリリットルのピペットで細胞を上下に10回静かにピペットで移動させ、細胞ペレットを解離させます。

トリパンブルーを細胞懸濁液に加え、血球計算盤でカウントします。200万細胞を含む細胞懸濁液を新鮮なチューブにアリコートします。0.5ミリリットルのPBSを細胞懸濁液に加えます。

次に、摂氏4度で300Gで5分間遠心分離します。上清を捨て、再度洗浄します。最終洗浄後、できるだけ多くのPBSを吸引します。

次に、細胞ペレットと50マイクロリットルの細胞外マトリックスヒドロゲルを氷上に置きます。細胞ペレットを細胞外マトリックスヒドロゲルと速やかに混合して、頭蓋内注射の準備をします。まず、麻酔をかけたマウスを定位固定装置に取り付けます。

前歯が切歯バーに固定され、ノーズコーンが動物を所定の位置に固定していることを確認します。ヨウ素を染み込ませた綿の先端でマウスの頭を消毒し、続いてイソプロパノールワイプで消毒します。次に、乾燥を防ぐために角膜眼軟膏を両目に塗ります。

小脳の基部を切開し、頭蓋骨を横切って中点まで伸ばして、頭蓋骨の上部に沿って長さ1センチメートルの切り込みを作成します。耳の間の皮膚を締めて頭蓋骨を露出させた後、耳の吟遊詩人を締めて頭を固定する。頭蓋骨の表面をきれいにし、綿棒で完全に乾かします。

ドリルを定位固定フレームに固定し、ドリルを使用してブレグマまたはラムドイド構造を見つけます。座標が決まったら、指定された場所の骨に小さなバリ穴を慎重に開けます。調製した脳腫瘍注射細胞懸濁液をピペットを使用して複数回再懸濁し、気泡が確実に回避されるようにします。

2マイクロリットルの細胞混合物を事前に洗浄した冷たいガラスマイクロシリンジに引き込み、シリンジを定位固定装置フレームに取り付けます。針を頭蓋骨の先端に調整して、注射の準備をします。30秒以内に、ドリル領域に細胞を注入します。

注射中は、逆流した細胞懸濁液をイソプロパノールワイプで拭き取ります。逆流を防ぎ、細胞外マトリックスヒドロゲルが沈降するまで、シリンジを1分間所定の位置に置いておきます。次に、注射器を取り外し、イソプロパノールワイプで傷をきれいにします。

必要に応じて、皮膚接着剤または創傷クリップで切開部を密閉します。暖かさを保つために、ヒートランプまたは加熱パッドを備えた清潔な回復ケージにマウスを横たわらせます。動物が独立して正常に動き始めるまで、動物を継続的に監視します。

頭蓋内注射後、マウスを週に5日監視して、一般的な健康状態を評価します。体重減少、活動レベル、姿勢、脱水症状の兆候、毛皮の状態などのパラメータを指定されたモニタリングシートに記録します。動物は、脳幹腫瘍の頭の傾きや皮質神経膠腫や上衣腫の前脳肥大など、腫瘍の種類と注射部位に基づいて明確な症状を示しました。

異なる密度の髄芽腫D425細胞の頭蓋内注射により、細胞密度と腫瘍生着速度との間に直接的な相関関係があることが明らかになり、100, 000細胞が最短の生存期間中央値15日になりました。皮質に注入された高悪性度神経膠腫細胞は、生存期間の中央値が約 25.5 日であり、免疫組織化学的分析により、大きな高核腫瘍塊と血管新生の増加、および豊富な Ki-67 陽性増殖細胞が明らかになりました。高悪性度神経膠腫細胞の脳幹注射により、免疫組織化学的分析により、上部橋の腫瘍塊と軟髄膜浸潤、浸潤領域の増殖性 Ki-67 陽性細胞が示され、生存期間の中央値は約 26 日でした。