Name: 切除灌流マウス心臓における内因性心臓自律神経ニューロンの光遺伝学的活性化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T12:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学ぶ光遺伝学的活性化法で、切除灌流マウス心臓の内因性心臓自律神経ニューロンを標的に刺激し、コリン作動性とカテコールアミン作動性活動の相互作用を解析する。心拍動態の制御メカニズム解明に有用です。

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すべての動物プロトコルは、ジョージワシントン大学の動物管理および使用委員会によって承認され、国立衛生研究所の実験動物の世話と使用に関するガイドに従っています。
1. マイクロLED光源の構造
<ol>
	<li>換気の良い場所で、2本の絶縁銅線(長さ20cm以上)の剥がれた端を465nmのマイクロLEDの接点にはんだ付けします(図1)。LEDを電源に接続してオンにして、はんだ付けをテストします。</li>
	<li>200 μLフィルター付きピペットチップの底を1 cmカットします。小径ロッドでフィルターを押し出します。ワイヤー付きのマイクロLEDをピペットチップに挿入して、LEDがチップの端と同じ高さになるようにします。ピペットチップの上部にあるフィルターを元に戻してLEDとワイヤーを所定の位置に保持し、LEDの端をピペットチップに瞬間接着します。瞬間接着剤を乾かします。</li>
	<li>ベースと硬化剤を10:1の割合で組み合わせてシリコーンエラストマーを調製し、よく混ぜます。真空チャンバーを使用するか、遠心分離機を使用して、混合物から気泡を取り除きます。</li>
	<li>0.5 mLの遠心分離チューブを取り、LEDの取り外しを容易にするために側面にスコアを付けます(必要に応じて、ここでチューブの内側に潤滑剤を追加することもできます)。漏れないようにチューブの外側をテープで留めます。シリコンエラストマー混合物を約0.2mLチューブに注ぎ、次にマイクロLEDピペットチップをチューブに入れ、LEDとチューブの底部との間に少なくとも1mmのスペースを残します。気泡が発生した場合は、遠心分離管を硬い面で軽くたたいて気泡を取り除きます。 注:ピペットチップは、LEDを配置する際の気泡形成を減らすために、シリコンエラストマーで事前にコーティングできます。</li>
	<li>遠心分離管のマイクロLEDを50°Cのラボオーブンまたはインキュベーターに直立させて置き、少なくとも8時間または一晩放置します。オーブンを操作するときは、耐熱手袋を着用してください。エラストマーが硬化したら、LEDを遠心分離管から取り外します。エラストマーがまだ粘着性がある場合は、オーブンに戻します。</li>
	<li>完全に硬化したら、LEDの先端から余分なエラストマーを精密な万能ナイフで取り除き、1mm以下にします。LEDを適切にカプセル化することで、光刺激中の組織の加熱を最小限に抑えることができます。</li>
	<li>光パワーメーターを使用して、LED の光パワーを決定します。パワーメーターの電源を入れ、波長設定を465nmに調整します。LEDをフォトダイオードパワーセンサーと一列に並べて配置し、ファンクションジェネレーターでLEDを点灯させます。光パワーメーターはワット単位の読み取り値を生成します。電力の読み取り値を照らされた表面の面積(0.88 mm2)で割って放射照度を計算します。 注:ChR211の適切な活性化のためには、理想的な放射照度は約2.4 mW / mm2である必要があります。</li>
</ol>
2. 実験の準備
<ol>
	<li>以前の発表に従ってマウスを繁殖させ、コリン作動性ニューロン(ChAT-ChR2)またはカテコールアミン作動性ニューロン(TH-ChR2)12 (図2)のいずれかでChR2を発現させます。実験に用いたマウスにおけるTH-CreまたはChAT-Creの発現を、前述のジェノタイピングアプローチを用いて確認する12。</li>
	<li>少なくとも225 mLのKrebs-Henseleit(KH)溶液(mM:118 NaCl、4.7 KCl、1.25 CaCl2、0.57 MgSO4、25 NaHCO3、1.17 KH2PO4、6グルコース)を調製し、0.2 μmの硝酸セルロースメンブレンフィルターを使用してろ過します。95%O2 および5%CO2を使用して酸素化する場合は、pHを7.4に調整します。</li>
	<li>実験前にランゲンドルフ灌流システムを精製水ですすぎ、実験を開始する前に余分な水分を取り除いてください。</li>
	<li>KHを循環させる前に、10 μmのメンブレンフィルターをシステムに追加します。2〜5mL / minの流量で灌流液の温度を37°Cに維持するように設定されたウォーターバスをオンにします。</li>
	<li>175 mLのKHを灌流システムに追加し、循環を開始します。.溶液を95%O2 / 5%CO2 で泡立てて、適切な酸素化を提供します。 注:KH循環量は、チューブとリザーバーのサイズに応じてシステムごとに異なります。</li>
	<li>ストップコックで灌流システムの流れを停止し、流量計の ゼロボタンを押して 、流量計を校正します。</li>
	<li>LabChartなどの生理学的データ収集ソフトウェアを準備して、12チャンネル(心臓浴温度、大動脈灌流温度、ECGリードI-IIIに加えて4つの計算リード、心拍数計算、流量、LEDパルスを追跡するための関数発生器出力)を用意します。</li>
	<li>心拍数用に予約されたチャネルを使用して、LabChartで心拍数を計算し、リードI.LabChartの心臓軸拡張は、リードIとリードIIを使用してリードIII、aVR、aVL、およびaVFを計算します。</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig1.jpg"> 
図1:マイクロLEDの構造。 マイクロLED光源の構築手順を簡略化しました。2本のワイヤーをマイクロLEDにはんだ付けし、200μLのピペットチップに挿入してから、瞬間接着剤で接着します(ステップ1)。シリコーンエラストマーを10:1の比率で混合し、真空チャンバーに入れて気泡を除去します(ステップ2)。シリコーンエラストマーを微量遠心チューブに注ぎ、マイクロLEDピペットチップを挿入して一晩硬化させます(ステップ3)。次に、絶縁されたマイクロLEDをチューブから取り外し、余分なシリコンをトリミングする必要があります(ステップ4)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig2.jpg"> 
図2:トランスジェニックマウス育種スキーム。 lox依存性 ChR2 遺伝子を持つ親マウスを、Creプロモーターを持つ別のマウスと交配させます。チロシンヒドロキシラーゼ(TH)Creプロモーターを持つ親マウスは、カテコールアミン作動性細胞でChR2を50%発現するヘテロ接合性の子孫を産生します。コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)Creプロモーターを持つ親マウスは、コリン作動性細胞でChR2を100%発現するホモ接合性の子孫を産生します。発現はジェノタイピングによって確認されます。この図は12の許可を得て修正しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
3.心臓の切除と灌流
<ol>
	<li>切除前に、1 mLシリンジを使用した腹腔内注射により、250ユニットのヘパリン(約8 U / g)を投与します。.手術前に少なくとも10分待ちます。</li>
	<li>成体マウスを麻酔誘導チャンバーに入れます。~4%のイソフルランを投与し、呼吸数が遅くなり深くなるまで待ちます。.マウスをチャンバーから取り出し、頚椎脱臼を行う前につま先をつまむことで疼痛反射の停止を確認します。</li>
	<li>一対の鉗子で剣状突起を保持し、外科用ハサミを使用して腹腔内に切り込みます。横隔膜を慎重に切り開いて胸腔を開きます。肋骨を切って心臓と肺を露出させます。肺をそっとつかみ、心臓と肺を切除します。</li>
	<li>ヘパリン化KHの皿に心臓を置きます。肺と大きな脂肪片を取り除きます。洗浄した心臓をヘパリン処理されたKHの2番目の 皿に、2倍の倍率に設定された解剖顕微鏡下に置きます。大動脈の位置を特定し、細い鉗子を使用してカニューレの上をスライドさせます。4-0シルク縫合糸を使用して心臓をカニューレに固定します。 注:カニューレ挿入は、心臓の代謝活動を減らすために氷上で行うことができます。</li>
	<li>ヘパリン化KHのボーラス注射をカニューレを通して洗い流し、灌流システムに配置する前に冠状動脈から血液を取り除きます。</li>
	<li>カニューレを装着した心臓を灌流システムに接続し、灌流液を充填したPDMSディッシュに入れます。ECG針電極をアイントホーフェンの三角形13に従ってPDMSディッシュに配置します。少なくとも5分間心臓を順応させます。</li>
	<li>左心房にアクセスできるように心臓を回転させ、マイクロ自己開放ハサミで左心房に~1mmの穴を開けます。このスライスから直径1mmのチューブを左心室に挿入し、そこに閉じ込められた灌流液を放出します。 注:心臓を見るために解剖顕微鏡を用意すると、このステップの容易さが向上する可能性があります。</li>
	<li>RAが上を向くように心臓を回転させ、洞房(SA)ノードに照明がアクセスできるようにします(図3)。</li>
	<li>必要に応じて、電極を心臓に近づけるか、灌流液に浸してECG電極を調整し、適切な信号対雑音比で信号を受信します。設定は、使用しているECG取得ハードウェアとソフトウェアによって異なる場合があります。この方法では、ゲイン2000と500Hzのカットオフフィルターを備えたアイントホーフェン・ゴールドバーガーモジュールを使用し、ソフトウェア設定にはメインフィルターと1000Hzのサンプリング周波数が含まれていました。</li>
</ol>
4. オプトジェネティックな活性化
<ol>
	<li>マイクロLEDデバイスをファンクションジェネレータセットに接続して、10 Hz周波数、30 msパルス幅、10Vp 振幅のパラメータでパルス波を生成します。</li>
	<li>マイクロLEDをSAノードにそっと置きます。マイクロLEDを強く押しすぎると、心拍数や機能が低下する可能性があるため、避けてください。</li>
	<li>ファンクションジェネレーターをオンにして、光刺激による心拍数の変化を測定します。心拍数の即時の変化は、効果的な活性化を示します。カテコールアミン作動性の活性化は心拍数の指数関数的な上昇を引き起こします10、一方、コリン作動性の活性化は即時の低下8を引き起こします。</li>
	<li>関数ジェネレータをオフにします。心拍数がアクティベーション前のレベルに戻るのを待ちます。</li>
	<li>光遺伝学的活性化の結果、心拍数の変化が100 bpm未満の場合は、マイクロLEDの位置を変更して、RAのニューロンをよりよく照らします。必要に応じて繰り返します。</li>
</ol>
5. 実験手順とデータ解析
<ol>
	<li>内因性光遺伝学的コリン作動性刺激がノルエピネフリン(NE)による外因性β-アドレナリン作動性活性化を抑制できるという仮説を検証するには、ヒュームフードにNEの10μMおよび100μMのストック溶液を準備します。</li>
	<li>注入ポートによってNEのボーラス用量を灌流システムに追加します。.心拍数がプラトーに増加したら、マイクロLEDを~10秒間オンにします。ライトをオフにして、心拍数の変化を監視します。</li>
	<li>心拍数が洞調律に戻ったら、NEの用量を増やし、光遺伝学的刺激を繰り返します。.NEの各用量について続行します。.</li>
	<li>研究の最後に、ガス供給をオフにし、システムから心臓を取り外し、必要に応じて固定剤で保存します。</li>
	<li>必要に応じて、灌流システムのリザーバーとチューブをDI水または洗剤ですすいでください。カビを防ぐために、システムを完全に乾かします。</li>
	<li>LabChart ファイルを保存します。心拍信号とECGチャンネルをエクスポートして、オフライン分析とグラフィカル表示を行います。</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig3.jpg"> 
図3:マウスの心臓浴の構成。 LEDデバイスとECG電極の配置を示すマウスの心臓にカニューレを当てたもの。シャーシのグランドは、周囲の電子機器からのノイズを低減するために存在します。ECG針電極は、アイントホーフェンの三角形に基づいて配置されます。略語:LA =左腕;RA =右腕;LL =左脚;G = アース。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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</ol>

<table><tbody><tr><td>#3c 鉗子 (x2)</td><td>デュモン</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu;mの硝酸セルロースの膜</td><td>フィルターWhatman</td><td>7182-004</td><td>KH</td></tr><tr><td>0.5 ml、マイクロ遠心分離機の管</td><td>のUltra Cruz</td><td>sc-200269</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu;m 核細孔メンブレンフィルター</td><td>Whatman</td><td>111115</td><td>システムフィルター</td></tr><tr><td>用 アナログインキュベーター&nbsp;</td><td>Qunicy Labs</td><td>12-140</td><td></td></tr><tr>ハーバード大学大<td>動脈カニューレ</td><td>&nbsp;</td><td>73-2798</td><td></td></tr><tr><td>任意機能発生器</td><td>Tektronix</td><td>AFG3021B</td><td></td></tr><tr><td>編組シルク縫合 4-0</td><td>外科専門 Look</td><td>SP116</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>湾曲止血</td><td>Ted Pella</td><td>53065</td><td></td></tr><tr><td>Einthoven Goldberger Module</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>73-1778</td><td></td></tr><tr><td>フレキシブルシリコンワイヤー30AWG</td><td>BNTECHGO</td><td>619317716902</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>ヘビーカーブアイリス鉗子&nbsp;</td><td>Aesculap</td><td>OC022R</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム注入</td><td>剤</td><td>400-30</td><td></td></tr><tr><td>アイリスはさみ</td><td>Ted Pella</td><td>13215</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン溶液</td><td>Covetrus</td><td>029405</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 8&nbsp;</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>データ・アクイジション・ソフトウェア</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖ハサミ</td><td>WPI</td><td>504520</td><td></td></tr><tr><td>マイクロLED</td><td>Dialight</td><td>598-8091-107F</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>光パワー・メータ</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/35</td><td>ADInstruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>セルフオープン&nbsp;精密はさみ</td><td>Excelta</td><td>366</td><td></td></tr><tr><td>単一動物麻酔器</td><td>E-Z システム</td><td>EZ-108SA</td><td></td></tr><tr><td>はんだ付けステーション</td><td>ウェラー</td><td>WES51</td><td></td></tr><tr><td>SureOne フィルター ピペットチップ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>02-707-478</td><td></td></tr><tr><td>シルガード 184 シリコーンエラストマーキット</td><td>DOW</td><td>04019862</td><td></td></tr><tr><td>組織鉗子</td><td>テッドペラ</td><td>13220</td><td></td></tr><tr><td>チューブフローシステム</td><td>遷音速</td><td>TS410</td><td></td></tr></tbody></table>

切除灌流マウス心臓における内因性心臓自律神経ニューロンの光遺伝学的活性化

Optogenetic Activation of Intrinsic Cardiac Autonomic Neurons in Excised Perfused Mouse Hearts

ランゲンドルフ定圧灌流システム (図4) は、適切な酸素化、温度、および冠状動脈の流れが維持されれば、マウスの心拍数を少なくとも300 bpm以上1時間以上維持できるはずです。この設定では、大動脈灌流の温度は冠状動脈の流れに依存するため、大動脈温度を37°Cに維持するためには、流量が変化するとウォーターバスの温度を調整する必要がある場合があります。 マウス心臓の冠状動脈の流量は、心臓のサイズにもよりますが、通常1.5〜4.5mL/minの範囲です。流量変動時に灌流液の温度を37°Cに維持することは、一貫した心機能に必要であり、一定の圧力灌流には特に重要です。記載されている灌流システムは、灌流液カラムの高さを通じて70 mmHgの静水圧を維持するように設計されています。これは、上部リザーバーから一貫したオーバーフローを提供するポンプ速度で達成されます。灌流液には、20μMの血管拡張薬クロマカリンを補充して、正常なまたは正常な冠状動脈の流れを改善および維持し、完全な心筋酸素化を確保することができます14。
ChAT-ChR2マウス心臓のコリン作動性ニューロンを10Hzおよび30msのパルス幅で光刺激すると、心拍数がほぼ瞬時に低下するはずです。適切に灌流された心臓のコリン作動性ニューロンの効率的な光刺激は、心拍数の少なくとも100bpmの減少につながるはずです。. 図5 は、マイクロLEDがオンになるとすぐに75bpm低下し、最大135bpmの減少に達するまで低下し続けることを示しています。マイクロLEDをオフにしてから30秒以内に、心拍数は175 bpmに増加し、徐々に刺激前のレベルに戻ります。刺激前、刺激中、および刺激後のRR間隔の違いを示すために、6誘導心電図が示されています(図5B)。リードaVR、aVL、およびaVFは、LabChartソフトウェアでリードIおよびIIを使用して計算されます。
TH-ChR2マウス心臓のカテコールアミン作動性ニューロンの光刺激は、コリン作動性ニューロンの光刺激と比較して、心拍数のより緩やかな(指数関数的な)変化を引き起こします。これは、β1-アドレナリン作動性の活性化が、標的タンパク質をリン酸化するのに対し、ムスカリンの活性化はそうではないが、PKAを活性化するcAMPのセカンドメッセンジャーシステムを必要とすることが原因である可能性が高い。 図6 は、10秒間で135bpmの心拍数の増加を示している。ライトを消した後、正常な洞調律に戻るにはさらに10秒が必要です。マイクロLEDが適切に絶縁されていないと、心臓が加熱され、心拍数が増加する可能性があります。この加熱応答は、TH-ChR2刺激よりも強度が低くなります。したがって、心拍数の変化はそれほど顕著ではありません。
このプロトコルの1つの応用は、光遺伝学的刺激を使用してニューロンを脱分極させ、内因性神経伝達物質の放出をもたらすと同時に、外因性神経伝達物質を灌流液に加えることである。図7Aは、灌流液にNEのボーラス用量を添加したChAT-ChR2マウス心臓からの内因性アセチルコリン放出を示しています。NEが存在しない場合、光刺激により心拍数が100bpm以上低下し、刺激期間中はこの低下が維持されました。一方、NEを大量に投与した場合(2000 nM)、光刺激中の最大心拍数低下は40 bpmでした。心拍数はすぐに上昇し始め、ライトが消灯する前にほぼ刺激前のレベルに達しました。この結果は、ChATニューロン光刺激による心拍数の光遺伝学的抑制が、高用量のNEによる心拍数の増加を完全に抑制することができず、心拍数抑制の時間が短くなり、心拍数の低下が減少することを示しています(図7B)。これらの結果は、迷走神経と星状神経節の同時刺激中に進行性のAVリンパ節ブロックを示した大動物での以前の研究と一致しています12,13。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig4.jpg"> 
図4:実験のセットアップ。灌流システムの図。 矢印は灌流液の方向を示しています。スーパーフュージョン灌流液は破線で示され、成分は赤で囲まれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig5.jpg"> 
図5: 代表的なコリン作動性光刺激反応。(A) ChAT-ChR2光遺伝学的活性化中の6誘導心電図。青色の実線は、マイクロLEDがオン/オフされていることを示します。赤い破線のボックスは、(B) スニペットの時間を示します。 (b) 光刺激前(a)、(b)、および光刺激(c)後のECG信号の半秒の断片。RR 間隔はセクションごとに表示されます。 (C) 心拍数(上)と関数発生器からのパルス波(下)が表示されます。心拍数は450 bpmから始まり、光刺激の8秒後に315 bpmに低下し、光刺激の7秒後に410 bpmに戻ります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig6.jpg"> 
図6:代表的なカテコールアミン作動性光刺激応答。(A) TH-ChR2光遺伝学的活性化中の6誘導心電図。青色の実線は、マイクロLEDがオン/オフされていることを示します。赤い破線のボックスは、(B) スニペットの時間を示します。(b) 光刺激前(a)、(b)、および光刺激(c)後のECG信号の半秒の断片。RR 間隔はセクションごとに表示されます。 (C) 心拍数(上)と関数発生器からのパルス波(下)が表示されます。心拍数は390 bpmから始まり、光刺激の10秒後に525 bpmにピークに達し、光刺激の終了後に390 bpm 8秒に戻ります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig7.jpg"> 
図7:外因性NEによるコリン作動性光刺激 (A) 灌流液にNEを添加した用量の増加によるChAT-ChR2光刺激中の心拍数反応。NEにより心拍数が最大増加に達すると、マイクロLEDを約10秒間点灯させました。高用量のNEでも心拍数の抑制は可能でしたが、用量が増加するにつれて刺激の持続時間は短くなりました。. (B) 心拍数が抑制されたままの時間。10秒に近い時間は、通常、刺激の全期間にわたって抑制されたままでした。 (C) 光刺激中の心拍数の低下は、低用量よりも高用量のNEでそれほど深刻ではありませんでした。.低用量では平均40%の心拍数低下が見られましたが、高用量では25%の減少にとどまりました。統計的有意性を評価するために、対応のないt検定を実行しました。平均 * p &lt; 0.05 の標準誤差として表されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

A balance of cholinergic and catecholaminergic activation is necessary to maintain heart health. Interrogating the interaction between these pathways can ...

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