Name: Nicotiana benthamianaにおけるPlasmodesmataへのタンパク質ソーティングの共焦点顕微鏡分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: 学ぶ Nicotiana benthamianaにおけるプラスモデスマタへのタンパク質ソーティングの共焦点顕微鏡解析法。PDLP5やTVCV MPなどのマーカー局在を可視化し、ウイルス感染時の細胞間輸送メカニズムを解明する。

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<meta charset="utf8"></head><body>Plasmodesmata機能の探索:標的タンパク質の共焦点顕微鏡法

<ol><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-localized+protein+mediates+crosstalk+between+cell-to-cell+communication+and+innate+immunity+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).</li>
<li>Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+gateways+to+local+and+systemic+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).</li>
<li>Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Channels+under+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Channels under pressure.</a> Annu Rev Plant Biol. 75, 21(2024).</li>
<li>Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Structure%2C+function+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis.</a> Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).</li>
<li>Fernandez-Calvino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+plasmodesmal+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis plasmodesmal proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18880(2011).</li>
<li>Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+meta-proteomic+pipeline+for+the+identification+of+plasmodesmata+proteins+and+regulatory+conditions+in+diverse+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species.</a> BMC Biol. 20, 128(2022).</li>
<li>Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-associated+%CE%B2-1%2C3-glucanase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis.</a> The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).</li>
<li>Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+rice+membrane+dynamics+and+plasmodesmata+during+biotrophic+invasion+by+the+blast+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus.</a> The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).</li>
<li>Aung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+target+plant+plasmodesmata+to+colonize+and+invade+surrounding+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues.</a> The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).</li>
<li>Cui, W., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+callose+synthases+CalS1%2F8+regulate+plasmodesmal+permeability+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Plants%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress.</a> Nat Plants. 2 (5), 160(2016).</li>
<li>Liu, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytosphinganine+affects+plasmodesmata+permeability+via+facilitating+PDLP5-stimulated+callose+accumulation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis.</a> Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).</li>
<li>Caillaud, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+protein+PDLP1+localizes+to+haustoria-associated+membranes+during+downy+mildew+infection+and+regulates+callose+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition.</a> PLoS Pathog. 10 (11), e1004496(2014).</li>
<li>Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+Z+%22The+Plant+Cell%22">The Plant Cell</a>. , (2024).</li>
<li>Chen, X., et al. Arabidopsis PDLP7 modulated plasmodesmata function is related to BG10-dependent glucosidase activity required for callose degradation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+X+%22Sci+Bull%22">Sci Bull</a>. , (2024).</li>
<li>Simpson, C., Thomas, C., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+GPI-anchor+plasmodesmal+neck+protein+with+callose+binding+activity+and+potential+to+regulate+cell-to-cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking.</a> The Plant Cell. 21 (2), 581-594 (2009).</li>
<li>Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+targeting+of+a+plasmodesmal+protein+affecting+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication.</a> PLoS Biol. 6 (1), e7(2008).</li>
<li>Lim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+localizing+proteins+regulate+transport+and+signaling+during+systemic+acquired+immunity+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).</li>
<li>Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+several+Nicotiana+species+as+hosts+for+high-scale+Agrobacterium-mediated+transient+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression.</a> Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).</li>
<li>Walhout, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATEWAY+recombinational+cloning%3A+Application+to+the+cloning+of+large+numbers+of+open+reading+frames+or+ORFeomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes.</a> Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dsRNA-induced+immunity+targets+plasmodesmata+and+is+suppressed+by+viral+movement+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins.</a> The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).</li>
<li>Roberts, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+frequency+and+architecture+of+plasmodesmata+during+the+sink-source+transition+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves.</a> Protoplasma. 218, 31-44 (2001).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+localization+signal+of+TMV+MP+is+recognized+by+plant+synaptotagmin+SYTA%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA.</a> mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).</li>
<li>Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabidiol+prevents+the+development+of+cold+and+mechanical+allodynia+in+paclitaxel-treated+female+C57Bl6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice.</a> Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).</li>
<li>Erkkilä, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widefield+fluorescence+lifetime+imaging+of+protoporphyrin+IX+for+fluorescence-guided+neurosurgery%3A+An+ex+vivo+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study.</a> J Biophotonics. 12 (6), e201800378(2019).</li>
<li>Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tobamovirus+Turnip+vein+clearing+virus+30-kilodalton+movement+protein+localizes+to+novel+nuclear+filaments+to+enhance+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection.</a> J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+functional+plasmodesmal+localization+signal+in+a+plant+viral+cell-to-cell-movement+protein%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein.</a> mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).</li>
<li>Kumar, G., Dasgupta, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability%2C+functions+and+interactions+of+plant+virus+movement+proteins%3A+what+do+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far.</a> Microorganisms. 9 (4), 695(2021).</li>
<li>Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+nondestructive+cell-to-cell+and+systemic+movement+of+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses.</a> Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ABT AC1相モータ</td><td>BRANDTECH&</td><td>nbsp;ABF63/4C-7RQ</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens EHA105</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンタミネーションコントロール&nbsp;</td><td>CCI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Enzyme mix</td><td>Invitrogen</td><td>#11789020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td><td>Invitrogen</td><td>#11791020</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0.1.</td><td>GraphPad Software株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>画像J</td><td>国立衛生研究所および光学・計算機器</td><td></td><td></td>研究所</tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>LSM 900</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana</td><td>植物種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Invitrogen</td><td>#12213013</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>NEB</td> <td>#M0491S</td><td></td></tr></tbody></table>

nicotiana benthamianaにおけるplasmodesmataへのタンパク質ソーティングの共焦点顕微鏡分析

Confocal Microscopy Analysis of Protein Sorting to Plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

植物生理学におけるPD機能および病原体との相互作用の研究を促進するために、PD局在化のための3つのシンプルで信頼性の高い参照タンパク質が開発されました。2つの細胞PDタンパク質と、植物トバモウイルスTVCVによってコードされる病原体由来のMPタンパク質が選択されました。これらのタンパク質の細胞内局在は、各タンパク質のC末端に融合した自己蛍光レポーターEGFPを使用して視覚化されました。別のアプローチでは、PD関連カロース沈着物のアニリンブルー染色を使用してPDを視覚化しました。実験は、PDLP5とMPの両方が点状PD局在を示し、MPは細胞核にも局在することを示しました(図1A)、前述のように25。対照的に、PDCB1はPDとERの間で分割されているように見えました(図1A)。GFPタグ付きタンパク質の細胞内局在を解釈する経験が浅い研究者のために、 図1A は、植物細胞で発現するEGFPの特徴的な核細胞質パターンも示しています。PDCB1の小胞体信号を確認するために、PDCB1をERマーカーで共発現させたところ、PDCB1の信号が小胞体マーカーの信号と重なっていることがわかりました(図1B)。試験したタンパク質のPD局在の効率を評価するために、蛍光シグナルを発現する細胞のうち、このシグナルのPD局在を示した細胞の割合を計算しました(表1)。
参照タンパク質を用いて細胞内局在を同定するためには、参照タンパク質の発現の時間スケールとその局在化の潜在的な変化を理解することが有用です。 図2 は、PD自体をアニリンブルー染色で可視化した場合のMP、PDLP5、PDCB1の動態を示しています。MPとPDLP5の両方が浸潤後1日(dpi)ですでにPDに蓄積し始め、この蓄積は2 dpiで見かけの最大に達し、さらに5日間安定していましたが、その後、シグナル強度は減少しました。これはおそらくタンパク質の分解によるものです。PDCB1の細胞内ソーティングの時間経過はより複雑で、最初の3 dpiでは、PDCB1は比較的強いERシグナルを示し、PD特異的なシグナル局在をほぼ完全に覆い隠していましたが、5 dpiでは、この後者のシグナルは、細胞数は少ないものの、より顕著になりました(図2)。興味深いことに、5 dpi後にPDCB1の明確なPD局在パターンが出現したのは、EGFPシグナルを示す細胞が大幅に減少したことと一致しました(補足図1)。したがって、PDLP5およびMPは、他のほとんどの細胞コンパートメントでバックグラウンドがほとんどないPD参照タンパク質として機能し、最適な可視化時間枠は2〜5 dpiです。一方、PDCB1はPDマーカーほど適していません。
次に、PDマーカーが他のPDタンパク質の存在下で細胞内局在特異性を保持することが確認されました。この目的のために、MP-EGFPまたはPDLP5-EGFPを、CFPでタグ付けされた別の植物ウイルスであるタバコモザイクウイルス(TMV)のPD局在化26MPと共発現させた。 図3 は、どちらの場合も、共発現したタンパク質が明確なPD局在パターンを示したことを示しています。同様に、MP-EGFPまたはPDLP5-EGFP発現組織のPD特異的組織学的アニリンブルー染色では、EGFPおよびアニリンブルーシグナルのPD局在に干渉は検出されませんでした(図3)。
PD局在研究は、多くの場合、参照タンパク質の全体的な発現とPDシグナルのより定量的な推定から恩恵を受けます。この定量化アプローチを 図4 と 図5に示します。一般発現の定量化のために、PDLP5およびMPの信号強度を測定しました。どちらのタンパク質も、10 dpiの期間中、すべての可視化時点で強いシグナルを示し、PDLP5では3 dpi、MPでは2 dpiで最大のシグナル強度を示しました(図4)。PDLP5とMPの間のシグナル強度には、どの可視化時点においても統計的に有意な差はありませんでした。PDCB1のシグナル強度は、発現細胞が不足しているため、統計的に有意なデータの収集が困難であったものの、PDCB1のシグナル強度は7dpiで観測され、最も強いシグナルが観測されました(図4)。したがって、最初の 3 dpi は、PDCB1 発現を検出する最適なタイミングを表します。予想通り、アニリンブルー染色サンプルは、一過性に発現したタンパク質よりも安定したシグナルを示しました(図4)。
次に、PDLP5とMPによって形成されるPD点を定量化しました。PDLP5は、観察期間を通じて安定した数のPD点を示し、テストした2つの時点間で統計的に有意な差はありませんでした(図5)。MPによって形成されたPD点の数が最も多かったのは2dpiで、観測期間が終了するまで比較的安定していました。PDLP5とMPのPD点数を比較すると、ほとんどのサンプリング時間で統計的に有意な差は見られませんでした(図5)。アニリンブルーで染色されたPD点の数も安定していましたが、10dpiでわずかに減少しました。アニリンブルー、PDLP5、またはMPで装飾されたPD点の数は、統計的有意性(図5)で互いに類似しており、これらのマーカーのPD特異性と一致していました。PDCB1 の PD 点の数は、以前の時点では PD 信号が ER 信号によって不明瞭になり、後の時点では比較的少数の細胞でしか観察されなかったため、解析されませんでした ( 図 2 を参照)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig01.jpg"> 図1: Nicotiana benthamiana で一過性に発現するTVCV MP、PDLP5、およびPDCB1のPlasmodesmata(PD)局在とPDのアニリンブルー染色 (A)MP-EGFP、PDLP5-EGFP、およびPDCB1-EGFPのPD局在とアニリン染色。EGFPシグナルは緑、アニリンブルーシグナルは青、プラスチド自家蛍光は赤です。(B)MP-EGFP、PDLP5-EGFP、およびPDCB1-EGFPとmRFPでタグ付けされた小胞体(ER)マーカーとの共発現。画像は浸潤後2日(dpi)で記録され、2つの独立した実験を代表する単一の共焦点切片です(N = 2つの植物からの20枚の画像)。EGFPシグナルは緑、mRFPシグナルは紫、プラスチド自家蛍光は赤です。黄色の矢印は、PDCB1がERに局在していることを示しています。スケールバー = 5 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig02.jpg"> 図2: Nicotiana benthamiana で一過性に発現するTVCV MP、PDLP5、およびPDCB1のPD局在とPDのアニリンブルー染色の経時変化。 画像は2dpiで記録され、2つの独立した実験を代表する単一の共焦点切片です(N = すべてのシステムについて2つの植物からの20枚の画像、ただし、シグナルを示す細胞が少なかったPDCB1-EGFPの7dpiと10dpiを除く)。EGFP信号は緑色で、アニリン青色の信号は青色です。スケールバー = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig03.jpg"> 図3:TVCV MPおよびPDLP5は、PD局在化TMV MPとの共発現およびアニリンブルーとの共染色後もPD局在を保持します。 画像は2dpiで記録され、4〜6の植物からのN≥10の画像を代表する単一の共焦点セクションです。EGFPシグナルは緑、CFPシグナルとアニリンブルーシグナルは青、プラスチド自家蛍光は赤です。スケールバー = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig04.jpg"> 図4: Nicotiana benthamiana およびアニリンブルーPD染色で一過性に発現するTVCV MP、PDLP5、およびPDCB1の蛍光強度の経時変化。 定量的データは、 図2に示す実験から収集されました。エラーバーは、複数の実験からの平均の標準偏差を表します。個々のデータポイントは、各測定値の平均として示されます。二元配置分散分析とテューキーの多重比較検定によって評価された平均値との差は、P値に対して統計的に有意です。*P &lt; 0.05、**P &lt; 0.01、および ***P &lt; 0.001、****P &lt; 0.0001;ns、統計的に有意ではありません。青いバー、アニリン染色;薄緑色のバー、MP-EGFP、濃い緑色のバー、PDLP5-EGFP;黄色のバー、PDCB1-EGFP。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig05.jpg"> 図5: Nicotiana benthamiana で一過性に発現するTVCV MPおよびPDLP5によるPD点形成とPDのアニリンブルー染色によるPD点形成の経時変化。 定量的データは、 図2に示す実験から収集されました。エラーバーは、複数の実験からの平均の標準偏差を表します。個々のデータポイントは、各測定値の平均として示されます。二元配置分散分析とテューキーの多重比較検定によって評価された平均値との差は、P値に対して統計的に有意です。*P &lt; 0.05、**P &lt; 0.01、***P &lt; 0.001、****P &lt; 0.0001。青いバー、アニリン染色;薄緑色のバー、MP-EGFP、濃い緑色のバー、PDLP5-EGFP。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="4">実験I.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>合計セル数</td>
			<td>PD局在化を有する細胞</td>
			<td>シグナルが混在する細胞</td>
			<td>PD局在化細胞(%)</td>
		</tr><tr><td>アニリンブルー</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>MP-EGFPの</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFPの</td>
			<td>40</td>
			<td>3</td>
			<td>38</td>
			<td>7.5</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFPシリーズ</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="4">実験II.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>合計セル数</td>
			<td>PD局在化を有する細胞</td>
			<td>シグナルが混在する細胞</td>
			<td>PD局在化細胞(%)</td>
		</tr><tr><td>アニリンブルー</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>8</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>MP-EGFPの</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>8</td>
			<td>97.5</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFPの</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>31</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFPシリーズ</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>2</td>
			<td>97.5</td>
		</tr></tbody></table>表1:PDローカリゼーションの効率。
補足図1: Nicotiana benthamianaで一過性に発現するTVCV MP、PDLP5、およびPDCB1のPD局在。 画像は 5 dpi (A)、7 dpi (B)、および 10 dpi (C) で記録されました。EGFPシグナルは緑色で、色素体自家蛍光は赤色です。スケールバー = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/Figure%20S1.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Nicotiana benthamianaにおけるPlasmodesmataへのタンパク質ソーティングの共焦点顕微鏡分析

Plasmodesmata are membranous nanopores that connect the cytoplasm of adjacent plant cells and enable the cell-to-cell trafficking of nutrients, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

植物細胞の間に高分子の人身売買は、一過性の関心の蛍光タグ融合タンパク質を発現し、共焦点顕微鏡によるその内および細胞間の分布を分析することによって評価することができます。...

細胞間の高分子輸送アッセイプランタで微粒子銃砲撃を活用

我々は、植物におけるタンパク質間相互作用をテストする手法を開発した。黄色蛍光タンパク質（YFP）がつの非オーバーラップフラグメントに分割されます。各断片は融合タンパク質の発現を可能にする、ゲートウェイのシステムを経由して目的の遺伝子にインフレームでクローニングされる。検死のタンパク質が相互作用するときにYFPシグナルの再構成にのみ発生します。...

ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出

の細胞特異的な分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;蛍光活性化細胞選別を使用した葉

インビボでのタンパク質複合体の形成は、二分子蛍光相補性によって視覚化することができる。相互作用パートナーは、蛍光タグの相補的部分に融合し、一過性にタバコの葉で表現、2つのタンパク質の接近したとき、再構成可能な蛍光シグナルをもたらしている。...

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

細胞内レベルでは、シグナル伝達イベントは発生的および環境的な手がかりによって動的に調節されます。ここでは、タバコの一過性発現システムを使用して、動的なタンパク質間相互作用を監視し、植物細胞におけるシグナル伝達の空間的構成を明らかにするプロトコルについて説明します。...

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

植物の細胞間の接続、原形質 (Pd)、生理学と植物ウイルスの相互作用工場で中心的な役割を果たしてください。Pd 輸送に重要なは、Pd にタンパク質を直接信号を並べ替えています。しかし、これらのシーケンスに関する知識はまだ始まったばかりで。Pd Pd...

タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーション シーケンスの同定

本稿では、ルシフェラーゼ活性の測定に基づく蛋白質蛋白質の相互作用を決定するための簡単かつ迅速な実験手順について説明します。...

ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

従来の方法の難しさを克服するために植物の複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現手法を開発しました。タンパク質の共発現を達成するためにカセットを表現する複数の機能的に独立して蛋白質を含んでいる単一発現プラスミドを使用する利点がかかります。...

植物の効率的な方法で複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現

別の植物種から茎頂の共焦点のライブ イメージング

ここで説明する近接標識法は、ニコチアナベンタミアナ葉組織におけるNLR免疫受容体のTIRドメインの相互作用パートナーの同定のための方法である。また、ニコティアナおよび他の植物種におけるこの技術を用いて、関心のある他のタンパク質間の相互作用を同定するための詳細なプロトコルも提供される。...

タンパク質相互作用ネットワークのインプランタ同定のためのTurboIDベースの近接標識

トウモロコシの葉の原基は深く覆われて転がされているため、研究が困難です。ここでは、蛍光および共焦点イメージングのために、トウモロコシの葉の原基の横断切片と展開されたマウント全体を準備するための方法を紹介します。...

蛍光および共焦点イメージングのためのトウモロコシ葉原基の横断切片および展開されたマウント全体を調製するための改善された方法

学ぶ Nicotiana benthamianaにおけるプラスモデスマタへのタンパク質ソーティングの共焦点顕微鏡解析法。PDLP5やTVCV MPなどのマーカー局在を可視化し、ウイルス感染時の細胞間輸送メカニズムを解明する。

Nicotiana benthamianaにおけるPlasmodesmataへのタンパク質ソーティングの共焦点顕微鏡分析

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