細胞内LC3陽性小胞の蓄積に対する細胞外小胞を介したLC3-II放出の評価

私たちの研究は、ALSやFTLD-TDPなどの核タンパク質TDP-43が細胞質に蓄積することを特徴とする進行性の神経変性疾患に焦点を当てています。私たちは、TDP-43の病状がプリオンのように脳全体に広がる方法を理解することを目指しています。私たちは以前、細胞外小胞を介したTDP-43の放出がオートファジーの調節不全によって媒介されることを発見しました。

FTLD-TDPのプログラニュリンは、このプロセスを促進します。次の課題は、オートファジーがTDP-43を含む細胞外小胞の産生と放出をどのように制御しているかを明らかにすることであり、これによりALSやFTLD-TDPの治療標的の発見につながる可能性があります。まず、培養したHeLa細胞をセルカウンターでカウントし、培地を入れた6cmのプレートに10の10倍を6細胞の累乗で播種します。

細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素と制御された湿度で24時間インキュベートします。次に、20マイクロモルのsiRNA溶液を調製します。100マイクロリットルの還元血清培地と3マイクロリットルのsiRNAを低保持チューブで混合して溶液Aを調製します次に、100マイクロリットルの還元血清培地と5マイクロリットルのトランスフェクション試薬を低保持チューブで混合して溶液Bを調製します。その後、溶液Aと溶液Bを混合し、室温で5分間インキュベートします。

次に、HeLa細胞の培養に使用した培地に溶液AとBの混合物を加え、24時間インキュベートします。翌日、細胞をPBSで洗浄し、細胞を500マイクロリットルの0.25%トリプシンと1ミリモルのEDTA溶液に摂氏37度で5%二酸化炭素と制御された湿度で5分間さらします。次に、2.5ミリリットルの培地を細胞に加え、20マイクロリットルのピペットチップが取り付けられたパスツールトランスファーピペットを使用して、シングルセル懸濁液を調製します。

細胞を数えた後、10cmのプレートに1×10の6細胞の累乗で播種し、先に示したようにインキュベートします。インキュベーションの最後に、ビヒクルまたは100ナノモルのバフィロマイシンA1を含む培地を調製します。次に、ビヒクルまたは100ナノモルのバフィロマイシンA1を含む培地に細胞をさらし、24時間インキュベートします。翌日、10cmプレートからすべての培地を回収します。

収集した培地を15ミリリットルのチューブに移し、3, 000Gで摂氏4度で10分間遠心分離して細胞の破片を取り除きます。P1細胞外小胞画分を単離するには、3, 000 Gでの遠心分離後に上清を遠心分離チューブに移します。チューブを20, 000Gで摂氏4度で1時間遠心分離します。

P2細胞外小胞画分の単離のために、20, 000Gでの遠心分離後に上清を超遠心チューブに移します。110, 000 Gで摂氏4度で1時間遠心分離します。ラボラトリーワイプでチューブ内の余分な水分を拭き取った後、遠心チューブ内の残りのペレットを50マイクロリットルの2回サンプルバッファーに再懸濁して、P1細胞外小胞画分を調製します。

次に、デカンテーションして上清を取り除きます。ラボ用ワイプでチューブ内の余分な水分を拭き取り、超遠心チューブ内の残りのペレットを50マイクロリットルの2時間サンプルバッファーに再懸濁して、P2細胞外小胞画分を調製します。P1およびP2細胞外小胞画分を100°Cのヒートブロック上で10分間インキュベートします。

10cmプレートから15mmチューブに培地を移した後、10cm皿の細胞をPBSで洗浄します。次に、細胞を2ミリリットルの0.25%トリプシンと1ミリモルのEDTA溶液に摂氏37度で5%二酸化炭素と制御された湿度で5分間さらします。細胞に8ミリリットルの増殖培地を加えます。

200マイクロリットルのピペットチップが取り付けられたパスツールトランスファーピペットを使用して、細胞をピペッティングし、シングルセル懸濁液を調製します。細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度で1, 000Gで10分間遠心分離します。次に、吸引器を使用して上清を取り除きます。

PBSを細胞ペレットに加え、摂氏4度で5分間1, 000Gで遠心分離します。PBSを除去した後、1%サルコシルを含む1ミリリットルのA68緩衝液で細胞ペレットを超音波処理します。300マイクロリットルの細胞溶解物を100マイクロリットルの4時間サンプルバッファーと混合します。

混合物を100°Cでヒートブロック上で10分間インキュベートし、細胞画分を調製します。