Name: 細胞内LC3陽性小胞の蓄積に対する細胞外小胞を介したLC3-II放出の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 学ぶ細胞外小胞を介したLC3-II放出の評価法。HeLa細胞を用いてオートファジーがTDP-43を含む細胞外小胞の産生と放出を調節するメカニズムを解明し、ALSやFTLD-TDPの治療標的発見に貢献する。

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<meta charset="utf8"></head><body>リソソーム融合障害のあるオートファジーにおけるLC3-II陽性EV放出の評価

<ol><li>Tanaka, Y., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+1+mutants+form+aggregates+that+induce+accumulation+of+prion-like+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43.</a> Prion. 10 (4), 283-289 (2016).</li>
<li>Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+era+of+cryptic+exons%3A+Implications+for+als-ftd%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">The era of cryptic exons: Implications for als-ftd.</a> Mol Neurodegener. 18 (1), 16(2023).</li>
<li>Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basis+of+clinicopathological+heterogeneity+in+tdp-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy.</a> Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).</li>
<li>Chatterjee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+extracellular+vesicle+tau+and+tdp-43+as+diagnostic+biomarkers+in+ftd+and+als%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als.</a> Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).</li>
<li>Kasai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+csf+nfl+and+csf+tdp-43+improves+diagnostic+performance+in+als%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Transl+Neurol%22%5BJournal%5D)">Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als.</a> Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).</li>
<li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+secretion+is+a+key+pathway+for+clearance+of+pathological+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43.</a> Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+als-ftd-csf+generates+tdp-43+aggregates+in+glioblastoma+cells+through+exosomes+and+tnts-like+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure.</a> Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human diseases.</a> N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li>
<li>Sasaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+spinal+cord+motor+neurons+in+sporadic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).</li>
<li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converging+mechanisms+in+als+and+ftd%3A+Disrupted+rna+and+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li>
<li>Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+common+pathway+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+involvement+of+lysosomal+dysfunction+in+pathological+changes+of+the+brain+in+aged+progranulin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 78(2014).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+progranulin-driven+autophagy-lysosomal+pathway+mediates+secretion+of+the+nuclear+protein+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43.</a> J Biol Chem. 299 (11), 105272(2023).</li>
<li>Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+secretion+via+extracellular+vesicles+is+regulated+by+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy+Rep%22%5BJournal%5D)">TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy.</a> Autophagy Rep. 3 (1), (2024).</li>
<li>Ratajczak, M., Ratajczak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microvesicles%2Fexosomes%3A+discovery%2C+disbelief%2C+acceptance%2C+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future.</a> Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).</li>
<li>Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abemaciclib+and+vacuolin-1+decrease+aggregate-prone+tdp-43+accumulation+by+accelerating+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux.</a> Biochem Biophys Rep. 38, 101705(2024).</li>
<li>Dingjan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+and+phagosomal+snares%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endosomal and phagosomal snares.</a> Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+regulates+lysosomal+function+and+biogenesis+through+acidification+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes.</a> Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).</li>
<li>Kanda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+freely+available+easy-to-use+software+%27EZR%27+for+medical+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics.</a> Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).</li>
<li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li>
<li>Plate, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+proteostasis+regulators+that+reprogram+the+ER+to+reduce+extracellular+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation.</a> eLife. 5, e15550(2016).</li>
<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mammalian+autophagy+in+protein+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of mammalian autophagy in protein metabolism.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 83 (2), 39-46 (2007).</li>
<li>Nanayakkara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+lysosome+reformation+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagic lysosome reformation in health and disease.</a> Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).</li>
<li>Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STX6-VTI1B-VAMP3+complex+facilitates+xenophagy+by+regulating+the+fusion+between+recycling+endosomes+and+autophagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes.</a> Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.25 % トリプシン EDTA</td><td>富士フイルム 和光</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>10 cm ディッシュ</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>15 mL チューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;L ピペットチップ</td><td>日本ジェネティクス</td><td>FG-301</td><td>ピペッティング</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>ナカライ テスク</td><td>21417-52</td><td>><試料緩衝液</td></tr><tr><td>3,3'-ジアミノベンジジン 四塩酸塩</td><td>ナカライ テスク</td><td>11009-41</td><td>DAB液</td></tr><tr><td>3.5cm皿用材料&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>6 cm ディッシュ&nbsp;</td><td>TrueLine</td><td>TR4001</td><td></td></tr><tr><td>アルミブロックサーモスタットバス(乾式温浴)</td><td>EYELA</td><td>273860</td><td></td></tr><tr><td>吸引器</td><td>SANSYO</td><td>SAP-102</td><td>吸入液</td></tr><tr><td>Avanti JXN-30</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34193</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Adipogen</td><td>BVT-0252</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン標識ヤギ 抗ウサギ IgG 抗体</td><td>ベクター研究室&nbsp;</td><td>BA-1000</td><td>2nd 抗体 イムノブロッティング用</td></tr><tr><td>Biotin-conjugated Horse Antimouse IgG Antibody Vector Laboratories</td><td>&nbsp;</td><td>BA-2000</td><td>2nd antibody for immunoblotting</td></tr><tr><td>Blocking One</td><td>Nacalai Tesque</td><td>03953-95</td><td>a material for immunoblotting</td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Nacalai Tesque</td><td>05808-61</td><td>a material for sample buffer solution</td></tr><tr><td>Calf Serum</td><td>cytiva</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>CanoScan LiDE 220</td><td>Canon</td><td>CSLIDE220</td><td>Scanner</td></tr><tr><td>遠心分離機 5702 R</td><td>エッペンドルフ</td><td>5703000039</td><td></td></tr><tr><td>計数スライド デュアルチャンバー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1450015J</td><td>細胞計数</td></tr><tr><td>デジタル Sonifier 450</td><td>ブランソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジメチル スルホキシド</td><td>nacalai tasque</td><td>09659-14</td><td>車両</td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08458-45</td><td>培養培地</td></tr><tr><td>DMEM フェノールレッドなし</td><td>ナカライテスク</td><td>08489-45</td><td>培地</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>同人堂&nbsp;</td><td>348-01311</td><td>A68ソリューションの材料</td></tr><tr><td>Excel</td><td>マイクロソフト</td><td>バージョン 16.16.27</td><td>風刺的分析</td></tr><tr><td>EZR</td><td>リファレンス No. 24</td><td>バージョン 1.68</td><td>風刺的分析</td></tr><tr><td>FBS</td><td>シグマ</td><td>173012</td><td>培地</td></tr><tr><td>フィジー</td><td>NIH</td><td></td><td>画像分析ツール</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ナカライ テスク</td><td>09886-05</td><td> サンプル緩衝液</td></tr><tr><td>Hoehst33342</td><td>同人堂の材料&nbsp;</td><td>H342</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>富士フイルム 和光</td><td>080-0186</td><td>DAB溶液用材料</td></tr><tr><td>キムワイプ S-200</td><td>日本製紙 クレシア</td><td>62011</td><td>クリーニングワイプ</td></tr><tr><td>ローリテンションチューブ</td><td>日本ジェネティクス</td><td>FG-MCT015CLB</td><td>siRNAおよびDNAトランスフェクション</td></tr><tr><td>LSM780 共焦点レーザー顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>モノクローナルマウス アンチ-LC3抗体</td><td>MBL</td><td>M186-3</td><td>1st immunoblotting</td></tr><tr><td>Nickel(II) Chloride Hexahydrate</td><td>富士フイルム 和光</td><td>149-01041</td><td>DAB溶液材料</td></tr><tr><td>N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩</td><td>Nacalai Tesque</td><td>20117-12</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 超遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Thermo FisherScientific</td><td>31985-070</td><td>siRNAおよびDNAトランスフェクション</td></tr><tr><td>pEGFP-C1-hAtg13</td><td>Addgene</td><td>22875</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td>培地</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kits</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>ポリクローナルウサギ抗PCNA抗体</td><td>BioAcademia</td><td>70-080</td><td>1st 抗体イムノブロッティング</td></tr><tr><td>ポリクローナルウサギ 抗シンタキシン 6 抗体</td><td>プロテインテック</td><td>10841-1-AP</td><td>イムノブロッティング用第1抗体</td></tr><tr><td>ポリクローナルウサギ 抗TSG101抗体</td><td>プロテインテック</td><td>28283-1-AP</td><td>イムノブロッティング用第1抗体</td></tr><tr><td>ポリクローナルウサギ 抗ULK1抗体</td><td>プロテインテック</td><td>20986-1-AP</td><td>イムノブロッティング用第1抗体</td></tr><tr><td>ポリフッ化ビニリデンメンブレン</td><td>ミリオーレ</td><td>IPVH00010</td><td>免疫ブロッティング用材料</td></tr><tr><td>R</td><td>R 開発コアチーム</td><td>バージョン 4.4.1</td><td>サティスティカル解析</td></tr><tr><td>RNAiMAX</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13778</td><td>siRNA トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>siRNA STX6</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>HSS115604</td><td>トランスフェクション用 siRNA</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>ナカライ テスク</td><td>31320-05</td><td>Tris buffer and A68</td></tr> solution <tr><td>Dodecyl Sulfate Nadium</td><td>Fujifilm Wako</td><td>192-13981</td><td>a material for sample buffer solution</td></tr><tr><td>SPARK Microplate Reader</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12935300</td><td>siRNA transfection</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>富士フイルム 和光</td><td>193-00025</td><td>A68溶液</td></tr><tr><td>用材料 TC20 サーマルプリンター付き自動セルカウンター</td><td>Bio-Rad</td><td>1450109J1</td><td>細胞計数</td></tr><tr><td>サーモバス</td><td>東京 リカキカイ</td><td>MG-3100</td><td>インキュベーション</td></tr><tr><td>TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2700</td><td>DNA トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR2300</td><td>DNA トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-75</td><td>トリスバッファー、サンプルバッファー、A68溶液</td></tr><tr><td>トリパンブルー染料 0.40%</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>細胞計数用</td></tr><tr><td>材料 ウルトラクリアオープントップチューブ、16 x 96mm&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>361706</td><td>P1 EVフラクション</td></tr><tr><td>ウルトラクリアチューブの収集、14 x 89mm</td><td>ベックマン・コールター</td><td>344059</td><td>P2 EVフラクション</td></tr>ベ<tr><td>クタステインABCスタンダードキット</td>の収集 <td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>PK-4000</td><td>immunoblotting</td></tr><tr><td>洗浄ボトル</td><td></td><td>1-4640-02</td><td>洗浄膜</td></tr> <tr><td>&mu;-スライド 8 ウェル高</td><td>ibidi</td><td>80806</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞内lc3陽性小胞の蓄積に対する細胞外小胞を介したlc3-ii放出の評価

Evaluation of LC3-II Release via Extracellular Vesicles in Relation to the Accumulation of Intracellular LC3-positive Vesicles

先行研究で示されたように、Baf処理は、EVリッチ画分においてTSG101(P1:P &lt; 0.01、P2:P = 0.012、EZR19の二元配置ANOVAにより決定)およびLC3-II(P1:P &lt; 0.01、P2:P &lt; 0.01、EZR19の二元配置分散分析によって決定)のレベルを増加させました。特に、Baf処理により、EV分画中のSTX6(P1:P &lt; 0.01、P2:P &lt; 0.01、EZR19の二元配置ANOVAで決定)のレベルも上昇し(図1A)、STX6がEVの成分である可能性が示唆されています。増殖性細胞核抗原(PCNA)は、EV画分では観察されませんでした。細胞画分中のSTX6のイムノブロッティングにより、STX6のレベルはsiRNAノックダウンとともに半分に減少することが明らかになりました(図1B)。 STX6 ノックダウンは、ビヒクル処理条件とBaf処理条件の両方で、細胞画分とEV画分のTSG101レベルに影響を与えませんでした(図1C)。しかし、 STX6 ノックダウンは、ビヒクル処理条件下では細胞画分のLC3-IIレベルを増加させましたが、Baf処理条件下では増加しませんでした。 STX6 ノックダウンは、Baf処理条件下でEV画分のLC3-IIレベルも増加させました(図1D)。これらの知見は、イムノブロッティングによりEV中のLC3-IIを検出する方法が、ノックダウン効率がそれほど高くなくても十分に感度が高いことを示唆しています。さらに、これらの結果は、 STX6 ノックダウンがBaf処理下で細胞内オートファゴソーム数を増加させ、オートファゴソーム関連小胞の細胞外放出を増強することを示しています。
STX6のノックダウンが細胞内オートファゴソームとオートリソソーム数に影響を与えるかどうかをさらに調べるために、オートファゴソームマーカーmCherry-LC3とリソソームマーカーLAMP1-GFPを使用してオートファゴソームとリソソームを可視化しました。共焦点生細胞イメージングにより、LAMP1-GFPおよびmCherry-LC3を発現するHeLa細胞にGFP陽性およびmCherry陽性の小胞が明らかになりました(図2A)。オートリソソームはGFP陽性小胞およびmCherry陽性小胞として同定され、オートファゴソームはGFP陰性およびmCherry陽性小胞として同定されました。STX6ノックダウンは、ビヒクル処理条件下でオートファゴソームおよびオートリソソームの数を増加させた(図2B、C)。しかし、STX6のノックダウンは、Baf処理条件下ではオートファゴソームおよびオートリソソーム数に影響を与えませんでした(図2B、C)。
STX6のノックダウンによる細胞内オートファゴソーム数の増加がオートファゴソーム形成の亢進によるものかどうかを判断するために、オートファゴソーム形成に必要なプロセスであるオメガソーム形成を、オメガソームマーカーGFP-ATG13シグナル強度を用いて検討しました。共焦点ライブセルイメージングは、GFP-ATG13のアセンブル画像を提供し、オメガソーム形成を示しました(図3A)。STX6ノックダウンはGFP-ATG13の信号強度を減少させました(P = 0.023、EZR19の二元配置ANOVAで決定)。STX6ノックダウンは、ビヒクル処理条件下ではGFP-ATG13信号強度に有意な影響を与えませんでしたが、Baf処理条件下では信号を大幅に減少させました(図3B)。まとめると、これらの知見は、STX6ノックダウンがオートファゴソーム関連小胞の蓄積に関連するLC3-II陽性小胞の放出を増加させることを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig01.jpg"> 
図1:ビヒクルまたはBaf処理下でコントロールまたはSTX6 siRNAをトランスフェクションしたHeLa細胞の細胞、P1、およびP2フラクションの免疫ブロッティング結果。 HeLa細胞をビヒクル(DMSO)または100 nM Bafで、コントロールまたは STX6 siRNAによるトランスフェクション後24時間処理しました。細胞、P1(20,000 × g ペレット)、およびP2(110,000 × g ペレット)画分を単離しました。(A)STX6、TSG101、LC3、およびPCNAを示す各画分の代表的なイムノブロッティング画像。(B-D)イムノブロット画像から、(B)STX6、(C)TSG101、(D)LC3-IIのデンシトメトリー分析を行いました。シグナル強度は、ビヒクルまたはBafで処理したコントロール細胞または STX6 siRNAトランスフェクション細胞に対して正規化しました。棒グラフは、S.E.M. (N = 3) ±平均値を表します。*は、Excelの両側非対応 t検定によるP&lt;0.05を示します。略語: STX6 = syntaxin 6;Baf =バフィロマイシンA1;DMSO = ジメチルスルホキシド; TSG101 = 腫瘍感受性遺伝子 101;LC3 = 微小管関連タンパク質 1A/1B 軽鎖 3B;PCNA = 増殖性細胞核抗原;S.E.M. = 平均の標準誤差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig02.jpg"> 
図2:コントロールまたは STX6 siRNAをトランスフェクトしたLamp1-GFPおよびmCherry-LC3を共発現するHeLa細胞のビヒクルおよびBaf処理条件下での共焦点画像解析。 (A)LAMP1-GFPとmCherry-LC3を安定的に発現するHeLa細胞の共焦点像をコントロールまたは STX6 siRNAで48時間トランスフェクションした後、DMSOまたは400 nM Bafに4時間曝露しました。スケールバー = 20 μm. (B,C) (B) オートファゴソーム (LAMP1-GFP ネガティブおよび mCherry-LC3 ポジティブドット) および (C) オートリソソーム (LAMP1-GFP および mCherry-LC3 ダブルポジティブドット) の定量化をフィジーのソフトウェアを使用して行いました。棒グラフのデータは、S.E.M. (N = 3) ±平均値として表示されます。* は P &lt; 0.05 を示し、Excel の両側の不対応 t 検定に基づきます。略語:Lamp1 =リソソーム関連膜タンパク質1;LC3 = 微小管関連タンパク質 1A/1B 軽鎖 3B;STX6 = 構文6;Baf =バフィロマイシンA1;GFP = 緑色蛍光タンパク質;S.E.M. = 平均の標準誤差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig03.jpg"> 
図3:GFP-ATG13を発現するHeLa細胞にコントロールまたは STX6 siRNAをトランスフェクションし、ビヒクルまたはBaf処理を施した共焦点イメージング。 (A)HeLa細胞にコントロールまたは STX6 siRNAをトランスフェクションした後、pEGFP-C1-hAtg13トランスフェクションを行い、DMSOまたは400 nM Bafで4時間処理しました。(B)相対的なシグナル強度は、各条件のシグナルをBafで処理したコントロールsiRNAトランスフェクト細胞のシグナルに標準化することによって決定した。棒グラフは、データを平均± S.E.M. (N = 3) として示しています。*は、Excelの両側非対応 t検定によるP&lt;0.05を示します。略語: hAtg13 =ヒトオートファジー関連遺伝子13;STX6 = 構文6;Baf =バフィロマイシンA1;DMSO = ジメチルスルホキシド;S.E.M. = 平均の標準誤差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S1:コントロールsiRNAをトランスフェクトし、Bafで処理したHeLa細胞の細胞、P1、およびP2フラクションのイムノブロット解析。 HeLa細胞にコントロールsiRNAをトランスフェクションし、100 nM Bafに24時間曝露しました。次に、細胞、P1(20,000 × g ペレット)、およびP2(110,000 × g ペレット)の画分を調製しました。ULK1とPCNAの代表的なイムノブロット画像で、比較のために各画分でそれらのレベルを示しています。略語:Baf = bafilomycin A1;ULK1 = unc-51様オートファジー活性化キナーゼ1;PCNA = 増殖細胞核抗原。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385_Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

細胞内LC3陽性小胞の蓄積に対する細胞外小胞を介したLC3-II放出の評価

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf ...

evaluation-lc3-ii-release-via-extracellular-vesicles-relation-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ここでは、LC3スポット計数とともに、3つのオートファジーマーカーの明るい詳細画像を比較し、それらの共局在化を定量化する分析的特徴を有するマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いて、客観的、定量的および統計的に堅牢な方法でオートファジーを測定した。...

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Mitophagy、クリア破損しているミトコンドリアのプロセスはミトコンドリアの恒常性と健康維持のため必要です。この記事は最新の mitophagy...

In VitroとIn Vivo検出、ひと細胞、線虫、マウス Mitophagy の

浸透圧ストレスは、エキソサイトーシスとこの処理中に解放の神経伝達物質の量に影響します。透過型電子顕微鏡と共に電気化学的方法を組み合わせることを使用エキソサイトーシス活動、小胞素量サイズ、および神経伝達物質解放の量に細胞外の浸透圧の影響を検討することができる方法を紹介します。中に分泌します。...

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ここで哺乳類細胞における一括 autophagic 貯留活性を測定する簡単なよく検証されたプロトコルが記述されています。メソッドは、sedimentable セル画総細胞 LDH レベルと比較して乳酸脱水素酵素 (LDH)...

隔離の乳酸脱水素酵素試金-哺乳類細胞における一括 Autophagic 隔離活動を決定するシンプルで信頼性の高い方法

本報告書は、ミクログリアまたは血液マクロファージからの細胞外小胞(EV)単離に関する時系列的要件を強調している。ミクログリア由来EVは神経突起の伸長因子として評価され、血液マクロファージ由来EVはインビトロアッセイにおけるC6グリオーマ細胞浸潤の制御で研究された。目標は、これらのEV機能を特定の微小環境における免疫メディエーターとして理解することです。...

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細胞外小胞(EV)は細胞生物学と細胞間コミュニケーションに貢献します。細胞の取り込みEVを可視化・定量化するための実用的なアッセイが必要です。現在のプロトコルは、ナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイスによるEV単離に続く共焦点顕微鏡 による 3次元蛍光イメージングを利用してEV取り込みアッセイを提案している。...

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細胞内小胞破裂の機能を調べるための光力学的アプローチ

このプロトコルの目的は、LC3免疫蛍光およびLC3ドット定量を通じて、膵臓癌および膵臓腺房細胞のオートファジーレベルを決定することです。...

LC3免疫蛍光を用いた2つの異なる膵臓細胞モデルにおけるオートファジーレベルの評価(英語)

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オンセクション相関光電子顕微鏡による内因性LC3の超微細構造局在

学ぶ細胞外小胞を介したLC3-II放出の評価法。HeLa細胞を用いてオートファジーがTDP-43を含む細胞外小胞の産生と放出を調節するメカニズムを解明し、ALSやFTLD-TDPの治療標的発見に貢献する。

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