Name: 単一分子FRET-TIRF顕微鏡法のための長鎖RNAの蛍光末端標識とカプセル化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学ぶ単一分子FRET-TIRF顕微鏡法による長鎖RNAの蛍光末端標識とカプセル化技術。リン脂質ベシクル封入によりRNA動態をリアルタイムで可視化し、構造機能相関を解明する。

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<meta charset="utf8"></head><body>smFRET-TIRF研究のためのRNAのデュアルカラー末端標識と小胞カプセル化

<ol><li>Eitan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+dynamic+structural+biology%3A+Challenges%2C+perspectives+and+an+appeal+for+open-science+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices.</a> Elife. 10, e60416(2021).</li>
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<li>Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+studies+reveal+that+single+molecule+ribozyme+heterogeneities+are+intrinsic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic.</a> Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>RNA ラベリング</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp;mL DNA LoBindチューブ&nbsp;</td><td>エッペンドルフ&nbsp;</td><td></td><td></td>30108035</tr><tr><td>1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC-HClまたはEDC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11844071</td><td>Pierce EDC、ノンウェイトフォーマット。で&nbsp;-20 °C;C</td></tr><tr><td>3-モルホリノプロパン-1-スルホン酸(MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra、分子生物学用、&ge;99.5% (滴定)</td></tr><tr><td>酢酸 (氷河)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00063</td><td>100%, 分析用無水 EMSURE ACS,ISO,Reag.Ph Eur</td></tr><tr><td>遠心ろ過ユニット&nbsp;</td><td>ザルトリウス</td><td>VS0132</td>ビ<td>バスピン500、MWCO 50.000、PES、500&ミュー;L</td></tr><tr><td>シアニン5ヒドラジド(Cy5-ヒドラジド)</td><td>Lumiprobe</td><td>23070</td><td>5 mg、CAS番号1427705-31-4&nbsp;</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>12611P</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWRケミカルズ</td><td>20821.296P</td><td>絶対&ge;99,8%</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>分子生物学用、&ge;99.0%</td></tr><tr><td>塩酸(HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00317</td>発<td>煙37%、分析用EMSURE ACS、ISO、Reag。Ph Eur</td></tr><tr><td>N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>98%</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム(NaOAc)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>無水、ReagentPlus、&ge;99.0%</td></tr><tr><td>メタ過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Life Technologies</td><td>20504</td><td>Pierce製品ライン</td></tr><tr><td>Sulfo-Cyanine3 amine (sCy3-amine)</td><td>Lumiprobe</td><td>213C0</td><td>5 mg, CAS number 2183440-43-7</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td><td>Biosolve</td><td>200923</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td><ストロング>チャンバー調製</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>99%</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00014</td><td>分析用 EMSURE ACS、ISO、Reag.Ph Eur</td></tr><tr><td>ビオチン-ポリエチレングリコール-吉草酸エスクリンシンイミジル(ビオチン-PEG-SVA、bPEG)およびメトキシポリエチレングリコール-吉草酸エスクリンシンイミジル(mPEG-SVA)</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td></td><td>BIO-PEG-SVA、MW 5,000およびMPEG-SVA、MW 5,000 - コンボキット</td></tr><tr><td>カバースリップカール</td><td>ロス</td><td>H876.2</td><td>24 x 24 mm、0.13-0.16&nbsp;mmの厚さ</td></tr><tr><td>Deconex 11の普遍的な</td><td>穴あけ機Chemie AG</td><td>17416492</td><td>実験室のガラス器具のクリーニングの解決</td></tr><tr><td>ダイヤモンドの上塗を施してある穿孔機</td><td>のCrystalite株式会社</td><td></td><td>1つのmmの厚さ</td></tr><tr><td>のダイヤモンドのdriller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWRの化学薬品</td><td>20821.296P</td><td>絶対 &ge;カバー付き99,8%</td></tr><tr><td>ガラスCoplin染色瓶</td>イメージングスペーサーGrace Bio-Labs 654008 SecureSeal、8ウェル、&nbsp; 9&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>mm &times;0.12;mm</td></tr><tr><td>の酸素血しょう洗剤</td><td>Zepto One</td><td></td><td>Diener</td></tr>の<tr><td>水酸化カリウム(KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>の分子生物学のための、&ge;99.0%</td></tr><tr><td>クォーツスライド</td><td>G.フィンケンバイナー社</td><td></td><td>7.5;>x&nbsp;2.5;>cm、厚さ1mm</td></tr><tr><td>の重曹ナトリウム(NaHCO3)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>BioXtra、99.5-100.5%</td></tr><tr><td>Lipid Cake Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16:0 ビオチニルキャップ PE、bPE (1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチニル) (ナトリウム塩)、C53H98N4O11PNaS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870277P</td><td>-20 で 1 年間安定&deg;C</td></tr><tr><td>14:0 PC、DMPC (1,2-ジテトラデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンまたは1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、C36H72NO8P)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345P</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL微量遠心チューブ、Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>Autoclave to sterilize</td></tr><tr><td>500&nbsp;mL Schlenk フラスコ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>メルク</td><td>1.02445</td><td>分析用 EMSURE ACS、ISO、Reag.Ph Eur</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カプセル化による表面固定化</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)-6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸 (Trolox&reg;)</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー53188-07-1</td><td>97%</td></tr><tr><td>3-モルフォリノプロパン-1-スルホン酸(MOPS)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>69947</td><td>BioUltra、分子生物学用、&ge;99.5%(滴定)。+4 &deg;暗闇の中でC。</td></tr><tr><td>粘着シールタブ</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>629200</td><td></td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-05-2、</td><td>ウシ肝臓由来のC30、水性懸濁液、10,000-40,000ユニット/ mgタンパク質</td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>&ge;99.5%(GC)、BioXtra</td></tr>押出<tr><td>機ポリカーボネート(PC)膜</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005-1EA</td><td>0.1 &mu;メートル、19 mm</td></tr><tr><td>押出機、加熱ブロック付き</td>セット<td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr>グル<tr><td>コースオキシダーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-37-0</td>、<td>Aspergillus niger、タイプVII、&nbsp;凍結乾燥粉末、&ge;100,000単位/ g固体(酸素添加なし)</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム(MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3、分子生物学用M1028</td><td>、1.00 M &plusmn; 0.01 M溶液</td></tr><tr><td>ポリエステル(PE)ドレインディスク、膜</td><td>Whatman、Cytiva</td><td>230300</td><td>10 mm</td></tr><tr><td>塩化カリウム(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60128</td><td>BioUltra、分子生物学用、&ge;分子生物学のための99.5%(AT)</td></tr><tr><td>水酸化カリウム(KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>、&ge;99.0%</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>434301</td><td></td></tr></tbody></table>

単一分子fret-tirf顕微鏡法のための長鎖rnaの蛍光末端標識とカプセル化

Fluorescent End-Labeling and Encapsulation of Long RNAs for Single-Molecule FRET-TIRF Microscopy

私たちは、エキソン配列に隣接する酵母ミトコンドリアSc.ai5γグループIIイントロンである915-nt RNAの部位特異的な単一蛍光および二重蛍光標識を示します。FRETフルオロフォアペアは、EDC/NHSによる5'-リン酸の活性化と3'-リボースの過ヨウ素酸酸化、続いてそれぞれの色素付着を介してRNA末端に位置します。次に、図4Aに示すように、蛍光ゲル電気泳動によりRNA色素コンジュゲートを検証しました。アガロースゲル上のRNAと蛍光色素の共遊走は、標識の成功を裏付けています。次に、図4Bに示すように、アンサンブル蛍光分光法を使用して、二重標識グループIIイントロンの特性評価を行いました。エネルギー移動、すなわちFRETは、ドナー色素の励起時に観察され、RNAの二重標識が証明されました。特に、FRETの距離依存性と一致するように、金属イオンの存在下でのグループIIイントロンRNAのフォールディングは、ドナー放出の減少(緑の矢印)とそれに対応するアクセプター放出の増加(赤矢印)によって証明されるように、FRETの効率の増加をもたらしました。これは、このFRETラベリングがリボザイムのコンフォメーション変化を追跡していることを示しています。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig04.jpg"> 
図4:RNA色素コンジュゲートの特性評価 (A)蛍光標識された単一および二重蛍光標識RNAの分析ゲルベースの分析では、2%アガロースゲル上のRNAと色素の共遊走が示されています。二重標識サンプル中の蛍光色素の共局在は、Cy3(上、緑)およびCy5(中央、赤)チャネルのマージ画像(下)の黄色の帯で示され、それぞれ532 nmおよび635 nmの照明下で視覚化されています。レーン1:5'-sCy3のみ標識RNA、レーン2:3'-Cy5のみ標識RNA、レーン3:デュアルエンド(5'-sCy3および3'-Cy5)標識RNA。(B)アンサンブル蛍光分光法により、二重標識が確認されます。ドナー励起時のエネルギー移動(λex = 515 nm、λem = 670 nm)により、両方の色素がRNAに正常に結合していることが確認されます。灰色の曲線は前触媒RNAの発光プロファイルを表し、黒色の曲線はフォールディングされたグループIIイントロンRNA(500 mM KClと70°Cで3分間インキュベートし、42°Cで5分間冷却した後、100 mM MgCl2を添加)のFRET効率の増加を示しています。この図は、Ahunbay et al.3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
蛍光二重標識野生型グループIIイントロンを手にしたことで、私たちは現在、そのダイナミクスを単一分子レベルで探索する立場にあります。リン脂質小胞に封入された標識RNAは、非常に低い表面密度で顕微鏡表面に固定化され、smFRET-TIRFの単一分子分解能を達成します。 図5Aに見られるように、いくつかの個々の分子を同時に追跡できます。TIRF顕微鏡は、FRETの効率とその経時変化をリアルタイムでモニタリングすることができます。 図5B は、標識およびカプセル化されたRNAの静的および動的な単一分子FRETトレースを例示しています。一般的なダイナミックトレースは、FRET効率を変動させるドナー信号とアクセプター信号の間に反相関を示します。ドナー励起時のアクセプター放出が増加すると、それに応じてドナー放出も減少し、色素間距離のダイナミックな変化を示します。この反相関は、RNA分子の立体配座変化を示唆しています。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig05.jpg"> 
図5:smFRETによって明らかにされたグループIIイントロンRNAの高度に動的な挙動。 二重末端標識グループIIイントロンRNAは、リン脂質小胞にカプセル化され、目的ベースのTIRF顕微鏡でイメージングするために表面に固定化されます。(A)532 nmの励起時にドナー発光(sCy3、緑)とアクセプター発光(Cy5、赤)を示す個々の標識RNA分子の結合画像。(B)典型的なsmFRETの軌跡は、(左)ドナーとアクセプターの強度が経時的に変動しない静的RNA分子、(右)動的RNA分子で、ドナーとアクセプターの強度が逆相関し、FRETの効率は黄色です。単一分子を局在化させ、MASH-FRET17を用いて分析します。直接励起、ブリードスルー、およびγファクター補正が適用されます。略語:smFRET=単一分子フェルスター共鳴エネルギー移動。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

単一分子FRET-TIRF顕微鏡法のための長鎖RNAの蛍光末端標識とカプセル化

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

この記事では、我々は、自動走査型共焦点顕微鏡を用いて表面に固定化された個々のDNA分子からのトレースをFRETの取得方法について説明します。...

表面固定化生体分子の単一分子蛍光測定のための自動化システム

この研究は、単一分子蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて二本鎖DNAのループダイナミクスを測定するための詳細な実験手順を提示する。プロトコルは、Jファクターと呼ばれるループする確率密度を抽出する方法を説明します。...

1分子FRETによるDNAループを研究

生体内の生体分子の研究は、生物学的な文脈における分子機能を理解するために非常に重要です。ここでは、DNAやタンパク質などの蛍光生体分子を生きた微生物に取り込むことができる新しい方法について説明します。蛍光顕微鏡で記録されたin...

エレクトロポ生きた微生物で内在化および蛍光生体分子の観測

本稿では、蛍光標識 DNA プローブ、エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光用と個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書を表示する方法について説明します。smFISH は、同時検出、ローカリゼーション、および固定の個々 の細胞における mRNA...

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

生きた細胞の細胞内小器官のマルチカラー単一膜蛋白質のローカリゼーションのためのプロトコルを紹介します。蛍光物質を添付、自己ラベリング タンパク質を使用します。~ 18 の精度と同じ細胞小器官の異なる膜コンパートメントに位置するタンパク質をローカライズできる...

単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラー ローカリゼーション顕微鏡

従来のエピ蛍光イメージング、分子検出に基づく超解像イメージング、およびマルチカラー単一分子検出を結合、統合された顕微鏡システムの構築の実践的なガイドの紹介など単一分子蛍光共鳴エネルギー移動イメージング、コスト効率の高い方法の 1...

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

単一分子蛍光エネルギー移動は、リボソームタンパク質合成中のtRNAダイナミクスを追跡する方法である。個々のリボソームを追跡することにより、不均一な集団が同定され、メカニズムに光が当たります。この方法は、生物学的立体構造の変化を一般的に追跡し、他の多くの複雑なバイオシステムにおける動的機能関係を明らかにするために使用することができる。単一分子法は、平均効果のために従来のアンサンブル法ではアクセスできない非レート制限ステップおよび低人口のキー中間体を観察することができる。...

リボソームタンパク質合成の単一分子蛍光エネルギー転移研究

この研究では、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)の単一分子蛍光共鳴エネルギー移動(smFRET)実験を実行するための詳細な手順を示します 非天然アミノ酸(UAA)の取り込み による...

1分子FRETを用いた膜受容体の立体構造ダイナミクスの可視化

ダイナミンスーパーファミリータンパク質の機能は、GTP加水分解と組み合わせたコンフォメーション変化に依存します。1分子FRET(smFRET)技術を用いて、異なるヌクレオチド負荷状態におけるダイナミン様GTPaseアトラスチンのコンフォメーションダイナミクスをモニターするシステムについて記述します。...

Dynamin様GTPaseアトラスチンのコンフォメーションダイナミクスを観察するための1分子FRETイメージング

このプロトコルの目的は、リボグロウプローブの定量的な蛍光寿命測定を、vitro、生体哺乳類細胞、三次元細胞モデルでの再現可能なRNAイメージングワークフローを可能にすることです。サンプル準備、プローブ投与、データ取得、定量解析のワークフローを概説し、バイアスなし蛍光寿命測定を抽出します。...

生体哺乳類細胞および三次元細胞モデルにおける蛍光寿命イメージングの基礎としてのリボグロウプローブのin vitro 特性解析

学ぶ単一分子FRET-TIRF顕微鏡法による長鎖RNAの蛍光末端標識とカプセル化技術。リン脂質ベシクル封入によりRNA動態をリアルタイムで可視化し、構造機能相関を解明する。

単一分子FRET-TIRF顕微鏡法のための長鎖RNAの蛍光末端標識とカプセル化

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