非ウイルス性眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いた真菌感染症を標的とするキメラ抗原受容体ナチュラルキラー細胞のエンジニアリング

私たちの研究は、侵襲性真菌感染症に対する既製のCAR細胞療法の開発に焦点を当てています。私たちは、最適な治療結果を達成するための最適なターゲット、CARデザイン、免疫細胞の組み合わせを特定することを目指しています。最近の開発は、私たち自身の研究も含めて、Aspergillus fumigatusを標的とするCAR-T細胞療法の開発に焦点を当てています。

これらの改変された細胞は、真菌の負荷を大幅に軽減し、抗真菌免疫を制御し、全生存期間を改善することにより、前臨床モデルで有望な結果を示しています。現在、この分野のほとんどの研究は、ウイルスベクターまたは眠れる森の美女トランスポゾンシステムを使用して、非常に限られた標的セットに特異的なCAR-T細胞を産生することに集中しています。主な課題は、最適な真菌標的を特定し、臨床応用に効果的でスケーラブルなすぐに使用できる細胞製品を製造することです。

このプロトコールにより、非ウイルス性CAR-NK細胞を作製するための費用対効果が高くスケーラブルな方法の必要性に取り組んでいます。これは、新しい抗真菌標的をスクリーニングするためのアクセス可能なアプローチを提供し、真菌感染症に対する既製のCAR-NK細胞療法に向けた基本的な一歩を提供します。まず、顕微鏡下でNK-92細胞のクラスターを鮮明な背景で確認し、各条件ごとにウェルあたり2ミリリットルの細胞培養培地を6ウェルプレートに加え、プレートを摂氏37度の加湿インキュベーターに5%の二酸化炭素で置きます。

10の8倍を6つのNK-92細胞の累乗で15ミリリットルの円錐形の底部チューブに移し、チューブを200Gで5分間遠心分離し、加速と減速を3にします。上清を捨てた後、細胞ペレットを含むチューブに最大15ミリリットルの予熱したPBSを入れ、再度遠心分離します。遠心分離中は、8マイクログラムのAf-CARプラスミドDNAと4マイクログラムのSB100Xミニサークルを1つの反応チューブにピペットで注入し、2番目のチューブDNAをモックコントロールとして空けておきます。

トランスフェクションシステムの場合、3ミリリットルの電解バッファーを最初のチューブに追加し、ピペットステーションに入れます。遠心分離後、上清を穏やかに捨て、細胞ペレットを200マイクロリットルの再懸濁緩衝液に再懸濁します。次に、100マイクロリットルの細胞懸濁液を2つの反応チューブのそれぞれに加え、穏やかに混合します。

トランスフェクションシステムピペットを使用して最初の反応チューブからDNA細胞混合物をピペットでピペットし、トランスフェクションピペットをピペットステーションのチューブに垂直に挿入します。最初のパルスを1,650ボルトに設定し、パルス時間を20ミリ秒に設定してから、スタートを押してパルスを開始します。最初のパルスの後、2 番目のパルスを 500 ボルトに設定し、パルス時間を 100 ミリ秒に設定して、2 番目のパルスを開始します。

2回目のパルスが完了したら、ピペットステーションからピペットをゆっくりと取り外します。直ちに、2ミリリットルの予熱細胞培養培地が入った調製した培養プレートの1ウェルに細胞を移し、プレートを円を描くようにゆっくりと動かして細胞を均一に分配します。プレートを摂氏37度の加湿インキュベーターで5%の二酸化炭素とインキュベートします。

30分間のインキュベーション後、インターロイキン-2を最終濃度150国際単位/ミリリットルでウェルに加えます。まず、NK-92細胞に目的のプラスミドをトランスフェクションします。細胞を15ミリリットルの円錐形の底部チューブに移します。

次に、細胞を遠心分離し、バッファーを使用して100マイクロリットルあたり6細胞の累乗で10の1〜2倍の濃度に希釈します。10分の1に1マイクロリットルの抗EGFR-Tビオチンを6細胞の累乗に加え、溶液が均一に分布するように穏やかに混合します。チューブを摂氏4度で25分間インキュベートします。

インキュベーション後、チューブに最大10ミリリットルの緩衝液を充填します。次に、チューブを200Gで5分間、加速と減速を3で遠心分離し、遠心分離後に上清を捨てます。次に、8マイクロリットルのコールドバッファーを追加し、続いて1×10あたり2マイクロリットルの抗ビオチン磁気ビーズを6細胞の累乗に加えます。

チューブを摂氏4度で15分間インキュベートします。細胞を洗浄するには、チューブに最大10ミリリットルの緩衝液と遠心分離機を入れます。上清を捨てた後、細胞を500マイクロリットルの緩衝液に再懸濁します。

LSカラムを最大マグネットにセットし、3ミリリットルのバッファーで洗浄します。バッファーがカラム内を完全に移動したら、細胞懸濁液を添加します。カラムを洗浄した後、マグネットから取り出し、きれいな15ミリリットルの円錐形の底部チューブに入れます。

カラムに5ミリリットルのバッファーを追加し、プランジャーを使用してEGF-R陽性細胞をできるだけ早く洗い流します。回収後のトランスフェクション効率は10〜20%に達し、最大濃縮によりAf-CAR-NK-92細胞の純度が95%以上に向上しますまず、磁気活性化細胞ソーティング技術を使用して、濃縮されたトランスジーン発現NK-92細胞を取得します。次に、Aspergillus fumigatus conidia懸濁液を、培地中の1ミリリットルあたり5分生子の累乗に10の2.5倍の濃度で調製します。

100マイクロリットルの分生子懸濁液を96ウェル培養プレートの各ウェルに分注し、プレートを摂氏25度で16時間インキュベートします。2日目に、モックおよびプラスミドトランスフェクトしたNK-92細胞を培地で2回洗浄し、真菌を含むプレートのウェルあたり100マイクロリットルの培地に4つのNK-92細胞のパワーに5回10を加えて共培養します。プレートを摂氏37度で加湿二酸化炭素インキュベーターで少なくとも6時間インキュベートします。

プレートを300Gで5分間遠心分離した後、底に触れずに各ウェルから100マイクロリットルの上清を回収します。最後に、上清を反応チューブに移してELISAを実行します。Af-CAR-NK-92細胞は、アスペルギルス・フミガータス胚管との共培養中に、模擬NK-92細胞と比較して有意に高いインターフェロンガンマ分泌を示しました。