Name: 非ウイルス性眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いた真菌感染症を標的とするキメラ抗原受容体ナチュラルキラー細胞のエンジニアリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学ぶ、非ウイルス性Sleeping Beautyトランスポゾンシステムを用いてAspergillus fumigatusを標的とするCAR-NK細胞を作製する方法。侵襲性真菌感染症に対するオフザシェルフ細胞治療の開発に向けた革新的アプローチを解説する。

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<meta charset="utf8"></head><body>真菌病原体を標的とするためのCAR-NK細胞を取得するための眠れる森の美女のアプローチ

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</ol>

<table><tbody><tr><td>15 MLコニカルボトムチューブ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STERILE</td></tr><tr><td>50 MLコニカルボトムチューブ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227270</td><td>PP, 30/115 MM, CELLSTAR, STERILE</td></tr><tr><td>6-and 96-Well- Cell Culture Plate</td><td>Corning Inc. LifeSciences</td><td>83-3736/ 83-3474</td><td>TC処理マルチウェルプレート、フラットボトム、最適な細胞接着処理、ガンマ線照射による滅菌、非発熱性</td></tr><tr><td>7-AAD (7-アミノアクチノマイシン D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td>フローサイトメトリーアッセイで非生存細胞を除外するための使いやすい核酸色素</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 抗ヒト EGFR 抗体</td><td>Biolegend</td><td>352918</td><td>クローン AY13</td></tr><tr><td>抗ビオチン MicroBeads UltraPure</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-637</td><td>モノクローナルマウス抗ビオチンに結合した UltraPure MicroBeads抗体</td></tr><tr><td>Aspergillus fumigatus</td><td>ATCC</td><td>46645</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tips (20 and 100 &mu;L)&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>70.3030.365 / 70.3030.275</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ&prime;リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>&nbsp;修飾、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし、液体、滅菌ろ過、細胞培養、エンドトキシン、テスト済み</td></tr><tr><td>ELISA MAXデラックスセットヒトIFN-&γ;</td><td>Biolegend</td><td>430104</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩溶液 (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td>分子生物学用, 0.5&nbsp;H2O、DNase、RNase、NICKaseおよびプロテアーゼ中のM、検出なし、0.2 &μ;mがフィルタリングされました。</td></tr><tr><td>FACSクリーン</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>FACSフローシース液</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACSリンス液</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>340346</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F7524</td><td>滅菌ろ過済み、細胞培養に適した、使用前に不活性化</td></tr><tr><td>ギブコ、MEM&α;、ヌクレオシド</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>22571020</td><td>フェノールレッド、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、重炭酸ナトリウム</td></tr>馬<tr><td>血清</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>16050122</td><td>滅菌ろ過、使用前に熱不活性化</td></tr><tr><td>ヒトIL-2 IS、研究グレード</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-742</td><td>研究グレード。ED50は&le;0.3 ng/mL、&geの活性に対応。3 &times;106IU/mg。</td></tr><tr>Streptomyces conglobatus由来の<td>イオノマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634-1MG</td><td>、サイトカイン分泌のポジティブコントロールとして使用&nbsp;</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W368401</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>MACS LS カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>&nbsp;コラムおよびプランジャー、滅菌パック</td></tr><tr><td>NK-92</td><td>DSMZ</td><td>ACC 488</td><td></td></tr><tr><td>ネオンTransfektionssystem 100&nbsp;&mu;L-Kit</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>MPK10096</td><td>再懸濁バッファー R、電解バッファー E2、100 &mu;L ネオンチップ、ネオンエレクトロポレーションチューブ</td></tr><tr><td>Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>サイトカイン分泌のポジティブコントロールとして使用&nbsp;</td></tr><tr><td>ポリスチレン丸底チューブ、</td><td>フローサイトメトリーに使用される</td>5 mL <td>BD Bioscience</td><td>S-452400</td></tr> 反応<tr><td>チューブ、1.5 ML</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7,26,90,001</td><td>PP、透明、キャップ付き、目盛り注入付き。使用前に滅菌してください。&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 ミディアム、GlutaMAX</td> サー<td>モフィッシャー サイエンティフィ</td>ック サイエンティフィック <td>72400021</td><td>GlutaMAX I、&nbsp;フェノールレッド、HEPES、滅菌ろ過</td></tr>された<tr><td>TipOne 1000 &mu;L XL 目盛り付きフィルターチップ</td><td>StarLab</td><td>S1122-1730</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター C60&nbsp;</td><td>Labotect</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HydroFLEX マイクロプレートウォッシャー&nbsp;</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoQuant Infinite M200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quadro MACSセパレーター&nbsp;</td><td>ミルテニーバイオテック</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

非ウイルス性眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いた真菌感染症を標的とするキメラ抗原受容体ナチュラルキラー細胞のエンジニアリング

Engineering Chimeric Antigen Receptor-Natural Killer Cells Targeting Fungal Infections Using the Non-viral Sleeping Beauty Transposon System

Af-CAR NK-92細胞の作製には、トランスフェクション、回収、濃縮、増殖など、約14日かかります。トランスフェクション後、細胞は2日おきに培養され、分裂します。トランスフェクション後2日で最初の分裂中に細胞生存率が低下する可能性があります。通常、細胞はトランスフェクションの4日後に回復し、48時間の倍増時間で増殖を開始します。
回復後、トランスフェクション効率を測定し、10〜20%に達すると予想しています( 代表的な結果を図3に示します)。MACSを介してEGFR陽性細胞を濃縮すると、Af-CAR NK-92細胞の割合が95%以上に増加します( 代表的な結果を図4に示す)。
95%を超えるAf-CAR細胞を含む培養物を機能アッセイに使用しました。ここでは、 A. fumigatus 生殖管と細胞を6時間共培養し、活性化マーカーとしてIFN-ɣ分泌を測定しました。 図5に示すように、Af-CAR細胞は、Mock NK-92細胞(平均=75.6±±19.5 pg/mL)と比較して有意なサイトカイン分泌(平均=340.6 86.5 pg/mL)を示し、Af-CAR細胞の活性化が有意に高い(p値=0.03)ことを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig01.jpg"> 
図1:Aspergillus fumigatusの生殖管。16時間のインキュベーション後のA.fumigatusの顕微鏡画像。生殖管/小さな菌糸が観察され、井戸の周りに均一に分布しています。スケールバー = 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig02.jpg"> 
図2: Aspergillus fumigatus 生殖管とNK-92細胞の共培養。 共培養の顕微鏡画像。NK-92細胞はクラスターを形成し、 A.fumigatus 生殖管と接触しています。スケールバー = 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig03.jpg"> 
図3:トランスフェクションマーカーEGFRの染色によるトランスフェクション効率の評価。 5日目、エレクトロポレーション後、NK-92細胞を7-AADおよび抗EGFRで染色しました。その結果は、(A)Mock細胞と(B)Af-CAR NK-92細胞の代表的な実験の一例を示しています。左の列は、セルサイズとセルの粒度のドットプロットを示しています。ゲートはNK-92セルに設定されています。死細胞は、7-AAD標識(2列目)を使用してアウトゲートされます。生きているEGFR+ 細胞の割合は、3列目に示されています。略語:EGFR =上皮成長因子受容体;7-AAD = 7-アミノアクチノマイシンD;CAR=キメラ抗原受容体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig04.jpg"> 
図4:導入遺伝子を発現するNK-92細胞の濃縮後の細胞表面染色結果。 左側に、モックセルが表示されます。右側には、Af-CAR-NKセルが示されています。赤色のヒストグラムは、未染色の細胞を表しています。青色のヒストグラムは、対応する染色細胞を表します。ゲートはEGFR+ セルに設定されています。数字は陽性セルの割合を示しています。略語:EGFR =上皮成長因子受容体;CAR=キメラ抗原受容体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig05.jpg"> 
図5:Aspergillus fumigatusの生殖管によって活性化されたNK細胞のサイトカイン分泌。 この図は、共培養の6時間後にELISAによって測定された真菌との共培養におけるAf-CARおよびMock細胞のIFN-ɣ分泌の結果を示しています。示されているデータは、独立して実施された3つの実験の平均±SDです(n = 3)。GraphPad Prism 10 を使用した Welch の t 検定によって計算された p 値、* p &lt; 0.05。略語:NK =ナチュラルキラー;IFN-ɣ = インターフェロンガンマ;CAR = キメラ抗原受容体;ELISA = 酵素結合免疫吸着アッセイ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>名前</td>
			<td>会社</td>
			<td>ストック濃度</td>
			<td>参考</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>トランスポゼース</td>
			<td>SB100X ミニサークル</td>
			<td>プラスミドファクトリー</td>
			<td>1 μg/μL</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>トランスポゾン</td>
			<td>AF-CARプラスミド</td>
			<td>自社生産</td>
			<td>1 μg/μL</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:このプロトコルで使用されるDNA。
補足図S1:Af-CARトランスポゾンのプラスミドマップ: プラスミドベクターの概略図とCARトランスポゾンの設計。略語:EF1 =伸び係数-1アルファプロモーター;ORI = 細菌の複製起源;LIR = 左反転リピート;RIR:右反転リピート。Cyto = 細胞質;Tm = 膜貫通型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/figure%20S1.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Chimeric antigen receptor (CAR)-based cell therapies have shown impressive efficacy in the treatment of hematological malignancies. Recently, these ...

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CRISPR Cas9を用いたナチュラルキラー細胞の遺伝子編集技術

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の臨床応用<em&gt;眠れる森の美女</em遺伝的に末梢及び臍帯血由来のT細胞を変更する&gt;と人工抗原提示細胞

本研究の目的は、自然なキラー (NK) 細胞の正常な遺伝子伝達を可能にする技術を策定することでした。人間のデキストランを介したレンチ ウイルス伝達や遺伝子発現効率の向上でマウスの主な NK 細胞実験結果。遺伝子伝達のこのメソッドは、NK...

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上します。

このプロトコルでは、転写調節の眠れる森の美女システムによって人間のゲノムへの興味の遺伝子の安定した統合を実現する方法について説明します。統合導入された細胞の分子アッセイ、ひと細胞の体外伝達不良レンチウイルスベクターの作製が報告されます。...

統合欠陥レンチウイルスベクターにパッケージ化された転写調節睡眠美容システムによって効率的な体外転位法

ここでは、 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/結合) を使用してプライマリまたは拡張された人間の自然なキラー (NK) 細胞を遺伝的に変更するためのプロトコルを提案する.このプロトコルを使用して、我々 はヒト NK 細胞 (TGFBR2) -b の成長因子受容体 2 の変換のし、ヒポキサンチン phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)...

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

ここでは、末梢血ナチュラルキラー(PBNK)、肝臓組織からのNK細胞、末梢血単核球(PBMC)または臍帯血(CB)に由来するキメラ抗原受容体(CAR)-NK細胞を拡大する方法を紹介します。このプロトコルは、増殖したNK細胞の最適化された純度に加えて、221-mIL-21フィーダー細胞を使用したNKおよびCAR-NK細胞の増殖を実証します。...

膜結合型IL-21修飾B細胞株を用いたナチュラルキラー(NK)およびCAR-NK細胞増殖法

ここでは、ヒトiPS細胞由来のキメラ抗原受容体(CAR)を発現するナチュラルキラー細胞を分化・増殖させ、様々な悪性腫瘍に対する死傷性を向上させる方法を紹介します。このプロトコールは、ナチュラルキラー(NK)に最適化されたiPS細胞由来CAR-NK細胞の分化と増殖、およびさまざまな腫瘍細胞株に対する抗腫瘍活性の測定を示しています。...

ヒト人工多能性幹細胞由来キメラ抗原受容体発現ナチュラルキラー細胞の進歩

このプロトコルは、がん免疫療法のために非統合mRNAを使用して一過性キメラ抗原受容体(CAR)T細胞を生成するための詳細な手順を概説し、CAR-T細胞とその細胞毒性機能を評価するための信頼性の高い方法を提供します。...

がん免疫療法のためのmRNAを用いた一過性キメラ抗原受容体T細胞を作製するための非ウイルス性アプローチ

CRISPR/Cas9技術を使用して、相同性終末結合(HMEJ)DNA修復経路 を介して...

大規模DNAテンプレートの相同性を介した末端結合標的統合 による 初代ヒトT細胞の非ウイルス工学

このプロトコルは、一次T細胞の培養に必要な手順、すなわち単離、活性化、増殖、そしてmRNA電気穿孔による一時的なトランスフェクションを説明しています。さらに、表現型、活性化マーカー、生存可能性、キメラ抗原受容体(CAR)発現のフローサイトメトリー解析のためのワークフローおよび抗体パネルも提案されています。...

一次ヒトT細胞の分離、培養、そして一時的なトランスフェクションによるキメラ抗原受容体(CAR)T細胞の生成

このプロトコルは、生細胞イメージングとフローサイトメトリーを用いて、ヒトの自然なキメラ抗原受容体介在および抗体依存性細胞毒性を一貫して測定するための標準化された in vitro.

キメラ抗原受容体および治療用抗体によって増強されるNK細胞毒性の定量化:生細胞イメージングおよびフローサイトメトリー

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