Name: 蛍光および放射性トレーサーによるマイクロバブルの作製と標識 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学ぶリポソームマイクロバブルの作製とワンポット放射性標識法。95%以上の標識効率を達成し、精製不要で物理化学的性質を保持。がんイメージングと治療の多モーダル追跡に応用可能。

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マイクロバブルは、タンパク質、ポリマー、またはほとんどの場合脂質シェルによって安定化されたガスコアを持つミクロンサイズの超分子セラノスティクス剤です(図1A)。血流に注入されると、マイクロバブルは、それらのガスコア1,2が溶解する前の数分間の時間枠で超音波によって検出可能なガス/液体界面を維持する。その結果、マイクロバブルの最初の臨床使用は、リアルタイム超音波画像造影剤3としてであった。治療用焦点付き超音波(FUS)の発明により、マイクロバブルの臨床ユーティリティが拡大しました。低周波FUSによって刺激されると、マイクロバブルは振動し、一過性の血管透過化から局所組織アブレーションまで、標的を絞った調整可能な機械的力を生成します4,5。その結果、過去20年間で、マイクロバブルFUSは、血液脳関門(BBB)の開門、腫瘍(膵臓がん、脳がん、肝臓転移がんなど)の薬物およびイメージングプローブの送達、神経変性疾患治療、およびがんアブレーションについて研究されてきました6,7,8,9,10,11。
マイクロバブルのセラノスティックな武器庫は、新しくエキサイティングな方向に進歩し続けています。従来のマイクロバブル-FUS送達アプリケーションは、市販のマイクロバブルと並行して治療用またはイメージングカーゴを同時投与することに依存していました。マイクロバブルシェル/生物学的相互作用を理解し、カスタムメイドの非商用マイクロバブル製剤を探索し、マイクロバブルシェル12,13,14に直接貨物をロードしたオールインワンセラノスティックマイクロバブルを生成することにより、マイクロバブルFUS送達能力を強化することへの関心が高まっている。実際、脂質マイクロバブル薬物送達研究の約40%は、このようなシェルロードマイクロバブルを利用しています15。イメージングと薬物送達を超えて、マイクロバブルFUSは、がん放射線療法16を強化し、ソノダイナミックセラピー17,18を通じて、他の点では良性のシェルロード剤の抗腫瘍効果を活性化することにも有望であることが示されています。
マイクロバブルがんアプリケーションにおけるこれらの従来型および拡張された方向性は、放射性トレーサーでマイクロバブルシェルを標識することにより、より戦略的に進めることができます。オールインワンのカーゴロードマイクロバブルの領域では、このような放射性標識は、1)これらのロードされたマイクロバブルシェルのオンターゲットおよびオフターゲットの生体分布のゴールドスタンダードの定量的評価を促進し、2)オンターゲット送達を最大化するためのマイクロバブル組成物の最適な選択を通知する薬物動態学的構造活性相関を導き出し、3)戦略的かつ適切な画像誘導アプリケーションおよび治療計画(例:組織ターゲットの種類、 線量測定、オフターゲットの安全性懸念を軽減するための薬剤選択、従来の協調治療パラダイムと比較した有用性)オールインワンカーゴロードシステム15,19。前臨床段階では、マイクロバブルシェルの運命をこのように理解することで、より広範なマイクロバブルFUSの作用機序を明らかにすることもできます。例えば、マイクロバブルシェルから標的細胞への脂質移動は、FUS対応ソノポレーションに影響を与えることが示されている12,20。したがって、このような移植を理解し最適化することで、ソノポレーションが関与する前臨床および臨床のマイクロバブルFUS療法(in vitroトランスフェクション、薬物送達、腫瘍アブレーション、放射線感作、およびソノダイナミックセラピー20,21,22,23,24,25).二重の超音波および放射線画像施設はまた、従来の二重の薬剤設計ではなく、単一の薬剤からのFUS血管開口および治療モニタリング(例えば、BBB開口速度論)を可能にするであろう26。同様に、脂質マイクロバブル放射性標識は、マイクロバブル-FUS +放射性医薬品の同時送達プラットフォーム27に代わるオールインワンの単一薬剤マイクロバブル-FUS/放射線療法として役立つ可能性がある。
マイクロバブルの脆弱性は、このようなラベリングにとって大きな課題です。既存のすべての放射性標識戦略は、マイクロバブルの安定性とサイズを乱すことが知られている精製方法によって制限されていますが、一部のものは効果がなく不安定な放射性標識28,29,30,31,32も備えています。精製要件は、より長いプロトコルにもつながります。短寿命放射性同位元素(例えば、18F t1/2 1.8 h,28,29 99mTct 1/2 6 h,3268Ga t1/2 1 h31)の使用と組み合わせると、放射性同位元素の崩壊に関連する非効率性が生じ、放射線画像と治療計画の時間枠が狭くなります。全体として、これらの制限は、短くて代表性の低い放射線画像の取得、不正確な薬物動態データ、および非効率的な腫瘍放射性同位元素送達のリスクがあります。  
本稿では、ポルフィリンの強力で安定した金属キレート化能力を活用することで、これらの制限を克服しています。ポルフィリンは、高度に共役した平面環と、さまざまな金属を収容できる中央配位部位を持つ有機複素環式高分子です。これには、銅-64(t1/2 12.7時間)、陽電子放出断層撮影法(PET)を備えた放射性医薬品、およびγ計数の実現可能性33などの長寿命放射性同位元素が含まれる。脂質骨格に結合すると、ポルフィリンは、親の非標識粒子33,34の特性を維持しながら、速度、高いキレート化効率、および血清安定性で銅-64で容易に取り込むことができる。さらに、ポルフィリンは蛍光活性があり、ナノ粒子および微粒子のモジュール式自己消光により、粒子の破壊時に回復します。PETおよびγカウントを補完する読み出しにより、バルクおよび顕微鏡の両方のシェルフェイト分析が容易になります(図1A)15。
ポルフィリン脂質をキレート剤として使用することにより、これらの特性を利用して、既存のマイクロバブル放射性標識法に関連する制限を克服する、新しいワンポットの精製不要のマイクロバブル放射性標識法(図1B、C)を生成しました。このプロトコルは、&gt;95%の銅-64キレート化効率を達成し、標識後の精製を必要とせず、マイクロバブルの物理化学的特性を維持します。これは、活性化する前に脂質マイクロバブルの「ゼロアップ」製造に容易に統合できます(図1B)。汎用性が高く、アシル脂質鎖の長さ(C16〜C22)、電荷(中性および陰イオン性)、およびポルフィリン-脂質組成物(1 mol%、10 mol%、30 mol%)が異なるカスタムおよび市販のマイクロバブル製剤にうまく適用でき、ラジオ活性と蛍光活性の両方を持つマイクロバブルを生成します。その適応性は、ポルフィリンを超えて拡張することもできます。ワンポットプロトコールは、市販の代替キレート剤(ジエチレントリアミンペンタアセテート(DTPA)-脂質など)および蛍光色素(DiIなど)を使用するように変更することができます。また、「スパイキング」アプローチにより、既製のマイクロバブル製剤を標識するように変更することもできます。したがって、この方法により、機構、イメージング、および治療用マイクロバブルFUSアプリケーションの進歩に役立つ、カスタマイズされたトレーサブル(ラジオ、蛍光、またはデュアルラジオ/蛍光アクティブ)マイクロバブルの製造が可能になります。以下のプロトコルでは、脂質マイクロバブルの作製、ワンポット放射性標識プロトコルの適用、必要な放射性標識と物理化学的特性の特性評価、および潜在的な修飾について概説しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67431/67431fig01v4.jpg"> 
図1:マイクロバブル製造および放射性標識プロトコル (A)ポルフィリン脂質は、ピロフェオフォルビド-a-脂質の形で、このプロトコル内でマルチモーダルキレート剤として機能します。銅-64(i)にキレート化されたモノマーとして、PETおよびイメージング機能を備えています。その蛍光は粒子の形で消光され(マイクロバブル(ii)および溶解後のナノ子孫(iii))、粒子破壊(iv)で消光されません。(B)このレポートに記載されている脂質膜の水和/活性化プロトコルにより、脂質マイクロバブルをゼロから生成し、(C)脂質懸濁液形成とマイクロバブル活性化との間のワンポット放射性標識の統合。この図は、Rajora et al.15の許可を得て改作されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67431/67431fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>64CuCl2</td><td>ワシントン大学医学部、マリンクロット放射線研究所</td><td>N/A</td><td>少量の注文 (<10 & マイクロ;L)0.1 N HCl</td></tr><tr><td>酢酸&nbsp</td>に溶解;<td>どの会社</td><td></td><td>>95%純度</td></tr><tr><td>アルミホイル</td> どの<td>会社</td><td></td><td></td></tr>でも<tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>どの会社</td><td></td><td>でも 純度:&ge; 98%</td></tr><tr><td>バランス - 分析</td> どの<td>会社</td><td></td>でも <td>0.1 mgまで測定可能</td></tr><tr><td>バスソニケーター</td><td>どの会社</td><td></td>でも<td>69 oCまで加熱可能</td></tr><tr><td>CC開口部 - 30ミクロン</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A36391</td><td>粒径範囲:0.6-18 um</td></tr><tr><td>CC電解質</td><td>ベックマン・コールター</td><td>8546719</td><td>アイソトンII希釈剤</td></tr><tr><td>CCソフトウェア</td><td>ベックマン・コールター</td><td>・マルチサイザー 4e</td><td></td></tr> 遠<tr><td>心分離機フィルターユニット(0.5 mL 30,000 MWCO)、互換性のあるマイクロ遠心チューブ付き</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC503096</td><td>Amicon Ultra - 0.5 mL</td></tr> 遠<tr><td>心分離管 - 15 mLキャップ付き</td><td></td> クロロホルム 任意の会社 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 純<td>度: &ge99.8%&nbsp;</td></tr><tr><td>コールターカウンター</td><td>ベックマン コールター</td><td>B43905</td><td>マルチサイザー 4e コールターカウンター</td></tr><tr><td>カバー スリップ</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td>VWR マイクロカバーガラス</td></tr><tr><td>CuCl2</td><td>どの会社</td><td></td>でも <td>酸化していないことを確認する</td></tr><tr><td>CuCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>キュベット - クォート、1 cm 経路長</td><td>どの会社</td><td></td><td></td>でも</tr> キュ<tr><td>ベット - CC 測定用 10 mL プラスチック</td><td>ベックマン コールター</td><td>A35471</td><td>コールター カウンター アキュベット ST</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>どの会社</td><td></td>でも<td>超純水浄化システム</td></tr><tr><td>DiI (1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルリンドカルボシアニン過塩素酸塩)</td> <td>任意の会社</td><td></td><td>粉末フォーム</td></tr><tr><td>線量校正器</td><td>任意の会社</td><td></td><td>銅-64</td></tr> <tr><td>を読み取ることができますDPPA (1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-リン酸 (ナトリウム塩))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>830855P</td><td>粉末形態</td></tr><tr><td>DPPC (1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850355P</td><td>粉末形態</td></tr><tr><td>DPPE-MPEG (1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-5000] (アンモニウム塩))Avanti</td> <td>Polar Lipids</td><td>880200P</td><td>粉末形態</td></tr><tr><td>DTPA-脂質(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-ジエチレントリアミンペンタ酢酸(アンモニウム塩))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790106P</td><td>粉末状</td></tr><tr><td>EDTA(エチレンジアミン四酢酸)</td><td>任意の会社</td><td></td><td></td></tr>ガン<tr><td>マカウンター</td>任意の<td>会社</td><td></td><td>銅-64</td></tr>ガン<tr><td>マカウンティングチューブプッシュキャップ</td>を読み取ることができます<td>Globe Scientific</td><td>22-171-665</td>フ<td>ランジ付き12mmチューブ用プラグキャップ</td></tr><tr><td>ガンマカウンティングチューブ</td><td>Sarstedt</td><td>55.1579</td><td>5 mL, 75 x 12 mm, PS</td></tr><tr><td>ガラスビーカー - 250 mL</td><td>あらゆる企業</td><td></td><td>100 oCまでの温度に耐えることができます</td></tr><tr><td>ガラス乾燥オーブン</td><td>あらゆる企業</td><td></td><td>80 oCまで加熱可能</td></tr><tr><td>ガラスマイクロリットルシリンジ - 25、50、100、 1000 & マイクロ;L</td><td>任意の企業</td><td></td><td>有機溶剤と互換性あり</td></tr><tr><td>ガラスシンチレーションバイアル - 20 mL</td><td>VWR</td><td>66022-081</td><td>VWR&reg;シンチレーションバイアル、ホウケイ酸ガラス、スクリューキャップ付き、パルプホイルライナー付き</td></tr><tr><td>ガラスバイアル - 0.5ドラム</td><td>VWR</td><td>66011-020</td><td>VWR バイアル 1/2ドラム、黒色フェノールスクリューキャップとポリビニール表面パルプライナー付き</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>G7757-1L</td> 純<td>度:&nbsp; &ge; 99.0%&nbsp;</td></tr><tr><td>目盛り付きピペット/ガン</td><td>あらゆる企業</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホット/スタープレート</td><td></td><td></td><td>自動温度制御用温度プロブを装備</td></tr><tr><td>塩酸 - 0.1 N</td> あらゆる<td>企業</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTLC プレート</td><td>アジレント</td><td>A120B12</td><td>&nbsp;iTLC-SA クロマトグラフィー紙</td></tr><tr><td>実験用組織</td><td>あらゆる企業</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メディア真空ろ過ユニット</td><td>あらゆる企業</td><td></td><td>0.22ミクロン細孔径、PESメンブレン、500mL漏斗容量</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>あらゆる企業</td><td></td><td>純度:&nbsp; &ge; 99.8%、HPLCグレード、ACS仕様に適合</td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離管 非滅菌 - 1.5mL</td><td>あらゆる企業</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ滅菌 - 1.5 mL</td><td>マイクロ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット - p1000、p200、p20、p10</td><td>どの企業</td><td></td>でも校正<td>済み</td></tr>の<tr><td>顕微鏡スライド</td>であることを確認する フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>12-550-15</td><td>スーパーフロストプラス顕微鏡スライド プレクリーニング針</td></tr><tr><td>- 18 G</td><td></td><td></td><td>滅菌パラ</td></tr><tr><td>フィルム</td><td>あらゆる企業</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>D8537-500ML</td><td>DPBS、改質、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし、液体、滅菌ろ過、細胞培養に最適</td></tr><tr><td>PFP</td><td>FluoroMed</td><td>APF-N40HP</td><td>純度:&nbsp; &ge; 99.8%</td></tr><tr><td>PFP ライン</td><td></td><td></td> 長さ<td>約 50 cm の直径 1/4 インチ プラスチック ホース</td></tr><tr><td>PFP レギュレーター</td><td>スウェージロック</td><td>SS-1RF4 および SS-4HC-1-4</td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td> 任意の<td>会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH規格 4および7</td> 任意の<td>会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p1000、p200、p10用ピペットチップ - 非滅菌</td> 任意の<td>会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p1000、p200、p10用ピペットチップ - 滅菌 任意の</td><td>会社</td><td></td><td></td></tr> プラスチック<tr><td>シリンジ - 1 mL</td><td>任意の会社</td><td></td> 滅<td>菌プロ</td></tr><tr><td>ピレングリコール</td><td>BioShop</td><td>PRO888.500</td><td>純度:&nbsp; &ge; 99.5%</td></tr><tr><td>パイロ脂質</td><td>N/A</td><td></td><td>社製</td></tr><tr><td>ゴムチップ鉗子</td><td>どの会社</td><td></td>でも <td>先端の細いエッジと平らな/四角いエッジの組み合わせをお勧めします</td></tr> は<tr><td>さみ</td> どの<td>会社でも</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム - 1 N</td><td>どの会社</td><td></td><td></td></tr>でも <tr><td>水酸化ナトリウム - 10 N</td><td>どの会社でも</td><td></td><td></td></tr>分<tr><td>光蛍光光度計</td> 任意の<td>会社</td><td></td><td>410 nmの励起と600-850 nmの発光が可能</td></tr> 分<tr><td>光蛍光測定ソフトウェア</td><td>Horiba</td><td>FluorEssence</td><td></td></tr><tr><td>分光計</td><td>任意の会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジ - 1 mL</td><td>任意の会社</td><td></td><td>使い捨て、プラスチック、滅菌</td></tr><tr><td>シリンジフィルター - 0.2ミクロン孔径</td><td>任意会社</td><td></td><td>膜材質:PESまたは酢酸アンモニウム/酢酸およびPBS試験管と互換性のあるその他の試験</td></tr><tr><td>管 - 10 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>任意の会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空デシケーター/真空</td><td>任意の会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vialmix</td><td>Lantheus Medical Imaging</td><td>515030-0508</td><td>プロトコルでは機械式バイアルシェーカーと呼ばれ</td></tr>ます 計<tr><td>量紙</td>どの<td>会社</td><td></td><td>でも、製品の損失を避けるために、計量紙を3x3cmの正方形にカットすることをお勧めします</td></tr></tbody></table>

蛍光および放射性トレーサーによるマイクロバブルの作製と標識

Fabricating and Labeling Microbubbles with Fluorescent and Radioactive Tracers

放射性標識マイクロバブルを製造する際の定量化可能な主な結果は、放射性化学的純度と放射性標識効率です。このプロトコルでは、iTLCと検証済みの遠心法をそれぞれ使用して、それぞれを特徴付けます。 図2A は、全脂質の1 mol%、10 mol%、または30 mol%の組成で、宿主脂質をパイロ脂質に置換した市販のマイクロバブル模倣製剤全体で、平均≥95%の放射化学的純度と効率が達成されたことを示しています。1 mol% および 10 mol% の発熱脂質製剤では、これらの値を達成するために、より濃縮された脂質懸濁液(0.15 mL 対 1 mL)が必要でした。現在のプロトコルで達成された高い放射性化学的純度とキレート化効率により、標識後の精製の必要性はなくなりました。
これは、C16、C18、および C22 鎖長脂質で構成され、全体的に中性または陰イオン性の表面電荷を持つ代替製剤にも当てはまりました(図 2B)。これらの変異体は、平均マイクロバブルサイズ、許容可能なマイ...

Microbubbles are lipid-shelled, gas-filled particles that have evolved from vascular ultrasound contrast agents into revolutionary cancer therapy ...

fabricating-labeling-microbubbles-with-fluorescent-radioactive

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

マイクロ流体チップを作製し、タンデムバブル生成用の金ドットと、その近くのシングルセルパターニング用のフィブロネクチン被覆島を生成しました。得られた流れ場は、粒子画像速度測定によって特徴付けられ、細胞膜ポレーション、膜変形、細胞内カルシウム応答など、さまざまな生体効果の研究に使用されました。...

単一細胞レベルでのキャビテーション気泡（複数可） - 細胞相互作用し、得られた生体効果を調査するための表面パターニングとマイクロ流体システム

提示されたプロトコルは、超音波誘発薬物送達用途のために設計された蛍光標識マイクロバブルの応答を特徴付けるために使用することができ、その活性化メカニズムとその生物効果を含む。本論文では、関連する長さとタイムスケールを捉えるために実施されるイン ビトロ および インビボ...

超音波誘発薬物放出のための蛍光標識マイクロバブルの特性評価のためのマルチタイムスケール顕微鏡法

ここでは、緑色蛍光タンパク質発現膵臓がん細胞（PANC-1 GFP)をBalb-c Ola Hsd-Fox1nuマウスの膵臓に同所的に移植し、腫瘍の進行と転移を評価する手順を紹介します。...

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腫瘍の増殖と転移研究のためのトレーサブル記者との乳癌患者由来の異種移植片の標識

腹腔鏡下 pancreatoduodenctomy (LPD) 提供するオープン膵頭十二指腸切除術後離床、以下を含む利点遅延胃と入院期間が短いかもしれない。しかし、LPD は特に膵の吻合に関する技術的に挑戦的で、よく標準化されていないです。LPD の中に膵の吻合のための標準化された手法について述べる: Blumgart...

変更された Blumgart 膵炎と腹腔鏡下膵頭十二指腸切除

異数性は、ゲノムの不安定性、複雑な染色体を持つ細胞を細胞周期逮捕を最終的に生成に...

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アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の生物発光と蛍光の同所性同種同系マウスモデル

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単一細胞解析、バイオ マーカー探索をシグナル蛍光セル バーコードとリン フローサイトメトリー

ここでは、代わりにネイティブ蛋白質分解性基質として蛍光ペプチドを使用する変更におけるザイモグラムの技術のための詳しいプロトコルを提案する.蛍光ペプチド手技で生体試料の電気泳動におけるザイモグラムの前の技術よりも幅広いプロテアーゼの検出が有効にします。...

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手動多重蛍光免疫組織化学における最適化、設計、および落とし穴の回避

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