蛍光および放射性トレーサーによるマイクロバブルの作製と標識

マイクロバブルは、独自のがん画像処理および治療能力を備えたガスで満たされた超音波感受性粒子です。進化するユーティリティは、アプリケーション主導のトレーサブルなマイクロバブルを構築することで戦略的に進歩させることができます。私たちは、非標識、放射性標識、蛍光、およびマルチモーダルマイクロバブルのカスタマイズ可能な生成を可能にする脂質マイクロバブル製造プロトコルを開発することにより、この目標を促進することを目指しています。

効率的で安定したマイクロバブル放射標識を実現することは、自明な課題ではありません。脂質マイクロバブルは壊れやすいため、製造後の放射性標識アプローチで熱、時間、精製ステップを施すと、その物理化学的特性と安定性が乱される可能性があります。一方、プレハブ無線ラベリングには特殊な機器が必要であり、放射線被ばく量が増加します。

私たちは、マイクロバブル活性化の前、脂質懸濁液形成後に放射性同位元素キレート化が起こる新しいハイブリッドプロトコルを開発することにより、これらの課題を克服します。このワンポットアプローチは、粒子の物理化学的特性を維持する、高効率で精製不要のマイクロバブル放射性標識を初めて容易にします。追加の重要な利点は、プロトコルの汎用性です。これは、カスタムマイクロバブル製造中に組み込むことができ、市販されているような予め成形されたマイクロバブル脂質懸濁液に適合させることができます。これは、さまざまなマイクロバブル脂質およびキレート剤組成物にうまく適用でき、それに応じてカスタマイズされた放射性、蛍光、またはトリモーダルマイクロバブルを生成できます。

これらの特性を組み合わせることで、マイクロバブル脂質シェルのマルチモーダル代表的なトレースが可能になり、メカニズムの洞察を前進させ、マイクロバブル薬物動態研究、マルチモーダルイメージング、治療計画、相乗療法の実現など、多くの領域にわたるマイクロバブル集束超音波治療の進歩をサポートできます。

[ナレーター]マイクロピペットの使用を開始するには、気泡の形成を避けて、バイアル内の選択したマイクロバブル脂質膜の端に沿って1ミリリットルのAA-PGG溶液を追加します。バイアルの開口部をキャップで部分的に覆い、パーフルオロペンタンまたはPFPラインを挿入するのに十分なスペースを残します。PFPをバイアルのヘッドスペースに液体の上で20秒間流し込み、バイアルにキャップをかぶせます。バイアルの下半分を摂氏70〜80度の水浴に1分間浸します。次に、バイアルを摂氏69度の浴槽超音波処理器で30秒間超音波処理します。超音波処理後、バイアルを拭き、室温まで冷まします。バイアルのヘッドスペースにPFPガスを補充します。次に、バイアルに蓋をし、パラフィルムで端を密封します。結晶化皿に摂氏60度のウォーターバスを設置するには、皿に磁気撹拌棒を置き、温度制御されたホット撹拌プレートの上に置きます。サーマルプローブを水に挿入して温度を監視し、撹拌速度を調整して弱いが目に見える漏斗を作成します。鉗子を使用して、0.1通常の塩酸中の塩化銅64の形の銅64を含む密封バイアルを用量校正器に移します。銅64の活動と時刻を記録します。鉗子を使用して、バイアルを用量校正器から取り出し、有鉛入りの容器に入れます。ミリリットルあたりのメガベクレルで値を計算するには、線量校正器に記載されている活性を銅64の体積で割ります。脂質懸濁液のキャップを外し、バイアルホルダーに固定します。次に、銅製64バイアルのキャップを外し、鉗子でバイアルを扱います。マイクロピペットを使用して、40〜250メガベクレルの活性に対応する量の銅64溶液を脂質懸濁液に移します。先端が平らなゴム製鉗子を使用して、放射性脂質懸濁液を少なくとも5回上下に回転させて、銅64を懸濁液に混合します。バイアルを上にした状態で、バイアルを安定させながらキャップをそっとフリックします。バイアルのキャップを部分的に慎重に外し、針付きのPFPラインを挿入します。バイアルヘッドスペースにPFPを20秒間充填します。次に、バイアルに蓋をし、パラフィルムで密封します。用量校正器を使用してバイアル活性を測定し、時間を記録します。次に、バイアルの下半分が熱にさらされるように、バイアルをフォームバイアルホルダーに入れます。ホルダーを摂氏60度の撹拌水浴に沈め、1時間加熱します。一方、iTLCストリップを準備するには、ガラスマイクロファイバークロマトグラフィー紙をストリップにカットします。ストリップを摂氏80度のガラス乾燥オーブンで加熱して活性化させます。1時間後、バイアルをウォーターバスから取り出し、ティッシュペーパーで端を拭きます。先端がゴム製の鉗子を使用してバイアルを上下に回転させます。バイアルを直立させた状態で、バイアルを安定させながらキャップをフリックします。パラフィルムを取り外し、キャップの周りを拭いて、閉じ込められた水を取り除きます。活性化されたiTLCストリップの下部中心から1センチメートルのところに1〜2マイクロリットルの脂質懸濁液を見つけます。スポットを乾かします。マイクロピペットを使用して、200 マイクロリットルの iTLC 溶離液を 10 ミリリットルの試験管の底に加えます。チューブを鉛容器に入れます。斑点のあるiTLCストリップをチューブに加え、溶離液がストリップの上部から約1センチメートルに達するまで現像させます。次に、鉗子を使用して、現像されたストリップを取り出し、垂直に保持します。ガンマカウンター対応の5ミリリットルプラスチックチューブでストリップを3分の1にカットします。プッシュキャップをチューブに挿入します。ガンマカウンターを使用してチューブを含むストリップと空のコントロールチューブを測定し、銅64の活性を検出します。毎分カウントを記録し、他の測定値からコントロールチューブの活動を差し引いてバックグラウンド放射を補正します。次に、補正された毎分カウントに基づいて放射性化学純度を計算します。次に、放射性標識脂質懸濁液バイアルのキャップを外し、8.89マイクロリットルの通常の水酸化ナトリウム1個を懸濁液に加えます。 バイアルをキャッピングして回転させた後、バイアルを軽くたたいてキャップスペースに閉じ込められた懸濁液を取り除き、ヘッドスペースをPFPガスで満たします。バイアルを機械式シェーカーに置き、4,530 RPMで45秒間作動させて、乳白色のマイクロバブル懸濁液を生成します。受動的に室温まで冷却したら、バイアルをそっと反転させてマイクロバブル懸濁液を再懸濁します。バイアルを平らな面に置き、2分間待ちます。その間、1ミリリットルのプラスチックシリンジに18ゲージの針を装備し、空気を吸引して出し入れすることでシリンジを通気します。2分後、バイアルのキャップをすばやく開け、バイアルの底から400〜550マイクロリットルの懸濁液を引き出します。針の端を注意深く拭き、マイクロバブル懸濁液をマイクロ遠心分離管に移します。チューブにキャップを閉めた後、用量校正器で最終的なマイクロバブル生成物の活性を測定し、時間をメモします。活性値をデカントされた量で割って、ミリリットルあたりのメガベクレル単位の活性を求めます。まず、10〜200マイクロリットルのマイクロバブル懸濁液を、互換性のあるマイクロ遠心分離管内の0.5ミリリットル、30,000分子量のカットオフ遠心分離機フィルターユニットに加えます。懸濁液を室温で12,000 Gで10分間遠心分離します。次に、はさみを使ってマイクロ遠心分離管とそのキャップの間の接続を切ります。キャップをCAPSとラベル付けされた20ミリリットルのシンチレーションバイアルに入れます。フィルターユニットをTUBE2とラベル付けされた新しいマイクロ遠心チューブに移します。TUBE 1 とラベル付けされた 20 ミリリットルのシンチレーション バイアルに、注入剤を含む最初のマイクロ遠心分離管を入れます。TUBE 2のフィルターユニットに200マイクロリットルの二重蒸留水を加えます。フィルターユニットを12,000 Gで10分間遠心分離します。最後のフィルターユニットの移送後、200マイクロリットルの蒸留水をTUBE3のフィルターユニットに加え、遠心分離します。遠心分離後、チューブのキャップを切断し、キャップシンチレーションバイアルに加え、フィルターユニットをUNITとラベル付けされた新しい20ミリリットルシンチレーションバイアルに移します。TUBE 3を新しい20ミリリットルガラスシンチレーションバイアルに入れます。5つのシンチレーションバイアルにキャップをし、空のキャップ付きのシンチレーションバイアルをブランクコントロールとして1つ準備します。ガンマカウンターで6つのシンチレーションバイアルを測定して、銅64活性を検出します。他のバイアル測定値からブランクコントロールを差し引きます。ラジオラベリングまたはキレート化効率を計算します。