Name: ヒト人工多能性幹細胞由来キメラ抗原受容体発現ナチュラルキラー細胞の進歩 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 学ぶ、ヒトiPSC由来CAR-NK細胞の分化・拡張プロトコル。非ウイルス遺伝子導入とCRISPR-Cas9技術により、固形腫瘍に対する抗腫瘍活性とin vivo持続性を向上させる方法です。

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<table><tbody><tr><td>aAPC&nbsp;</td><td>ディーン・A・リー研究室&nbsp;</td><td></td><td>該当なし</td></tr>の<tr><td>a-MEM培地&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>Cat#12634</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-DYKDDDDK (FLAG Tag)</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>Cat#637308</td><td></td></tr><tr><td>APC-anti-human TRA-1-81&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17-8883-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD16</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td>カタログ番号#302015</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD43&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>カタログ# 560198&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD45&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>カタログ# 555485&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-GPC3</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td>カタログ番号#DB100B</td><td></td></tr><tr><td>APC-NKG2D&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td>カテゴリ# 558071&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspase-3/7 緑色検出試薬&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>Cat#C10423</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace バイオレット細胞増殖キット&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>Cat#C34571</td><td>細胞追跡蛍光色素&nbsp;</td></tr><tr><td>CryoStorソリューション&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>https://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.html</td><td>凍結保存培地</td></tr><tr><td>CTS NK Xpander</td><td>Gibco</td><td>A5019001</td><td></td></tr><tr><td>CTS NK-Xpander Medium</td><td>Life Technologies</td><td>Cat#A5019001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DMEM Gibco</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、GlutaMAX Supplement、ピルビン酸</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>EasySep ヒト NK 細胞濃縮キット&nbsp;</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>Cat#19055</td><td></td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td>Σ Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>カタログ# 10437010</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CD94&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td>Cat#555888</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>GolgiPlug&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td>Cat#555029</td><td></td></tr><tr><td>ゴルジストップ&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td>Cat#554724</td><td></td></tr><tr><td>ハムのF-12ニュートリエントミックス、GlutaMAXサプリメント</td><td>Gibco</td><td>31765035</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>ネコ#16050130</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清&nbsp;</td><td>AB Sigma-Aldrich</td><td>Cat#BP2525100</td><td></td></tr><tr><td>Human Stem Cell NucleofectorTMキット&nbsp;</td><td>ロンザ&nbsp;</td><td>Cat# VPH-5012</td><td></td></tr><tr><td>ヒト:HePG2細胞&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>Cat#HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>ヒト:HePG2-td-tomato-luc細胞&nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman lab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ヒト:iPS細胞&nbsp;</td><td>ダン・S・カウフマン研究室&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ヒト:SNU-449細胞&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>Cat#CRL-2234</td><td></td></tr><tr><td>ヒト:SNU-449-td-tomato-luc細胞&nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman lab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte Caspase-3/7 Green Apoptosis Assay&nbsp;</td><td>エッセンバイオサイエンス&nbsp;</td><td>Cat#4440</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>MP Biomedicals&nbsp;ヒト血清、AB型</td><td>MPバイオメディカルICN2938249</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mTeSRと</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>NovoExpressソフトウェア&nbsp;</td><td>ACEAバイオサイエンス&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805</tr><tr><td>PE/Cy7 抗ヒト SSEA-4 抗体&nbsp;</td><td>バイオレジェンド</td><td>330420</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD16&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td>猫#560995&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD226</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td>カタログ番号#559789</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD34&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>Cat# 555822&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD45&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td>カテゴリ# 555483&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD94&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td>ネコ#555888&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-cy7-CD56&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 318318&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-FAS配位子&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td>ネコ#564261&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp30</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 558407</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp44&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td>猫#558563&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp46</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td>カタログ番号#331908</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp46&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td>ネコ#557991&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>末梢血バフィーコート&nbsp;</td><td>サンディエゴ血液銀行(https://www sandiegobloodbank.org/)&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PE-TRAIL&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td>ネコ#565499&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO&nbsp;</td><td>ブランデン・モリアリティ研究室&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pMAX-GFP プラスミド</td><td>ロンザ</td><td>N/A</td><td>GFP ポジティブコントロール&nbsp;</td></tr><tr><td>プリズム9</td>グラフ<td>パッド&nbsp;</td><td>バージョン9</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9&nbsp;</td><td>GenScript</td><td>PX165</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10x)</td><td>Biolegend</td><td>Cat#420301</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human bFGF basic&nbsp;</td><td>R&Dシステムズ&nbsp;</td><td>Cat#4114-TC</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト BMP-4&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat#120-05</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトFLT-3リガンド&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-19</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL-15&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-15</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL-2&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-02</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL-3&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat#200-03</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL-7&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-07</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト節タンパク質</td><td>R&Dシステムズ&nbsp;</td><td>Cat#3218-ND-025</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトSCF&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat#300-07</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトTGF-&ベータ;1</td><td>PeproTech</td><td>Cat#100-21</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトVEGF&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 100-20</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214485</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 Medium</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>5270</td><td>EBフォーメーションミディアム</td></tr><tr><td>STEMdiff APEL2 ミディアム&nbsp;</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>Cat#05270</td><td></td></tr><tr><td>Super piggyBac トランスポザース発現ベクター</td><td>SBI</td><td>Cat#PB210PA-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX AADvanced Dead Cell Stain Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S10274, S10349</td><td>Dead cell staining solution kit</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト人工多能性幹細胞由来キメラ抗原受容体発現ナチュラルキラー細胞の進歩

Advances in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Chimeric Antigen Receptor-Expressing Natural Killer Cells

抗GPC3-CAR iPS細胞由来NK細胞の分化と増殖の模式図 概略図は、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する抗GPC3-CAR改変NK細胞の in vitro 分化と、GPC3 CARコンストラクトを保有するpiggyBacベクターの概略図を示しています。まず、非改変iPS細胞にGPC3 CAR(キメラ抗原受容体)をコードするpiggyBacベクターをトランスフェクションします。トランスフェクション後、これらのGPC3 CAR発現iPS細胞はクローン増殖し、機能的なCAR-iPS細胞由来NK細胞に分化します。これらの改変されたNK細胞は、その後、 in vitro および in vivo の機能アッセイにかけられ、さまざまな腫瘍細胞株に対する抗腫瘍活性が評価されます(図1)。
WTと抗GPC3-CAR改変iPS細胞のNK分化過程の様々な段階における顕微鏡的解析 GPC3 CAR改変i...

Natural killer (NK) cells are innate immune cells that play a crucial role in the body's defense against tumors and viral infections. The generation of ...

advances-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-chimeric-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ここでは、人工抗原提示細胞（AAPC）を使用してバルクT細胞集団から、ヒトNKT細胞を活性化し、拡大するための方法を説明します。...

ナチュラルキラーT細胞の細胞（AAPC）媒介活性化と増殖を提示する人工抗原

このビデオは、腫瘍抗原特異的キメラ抗原受容体(CAR)T細胞のex...

腫瘍特異的キメラ抗原受容体T細胞を作製するためのex vivo技術

簡単かつ信頼性のある方法は、異なるNK細胞サブセット内の脱顆粒、サイトカインおよびケモカインの産生などNK細胞機能のセットを分析するために、ここで説明されています。...

NK細胞の機能を監視するためのサイトメトリーに基づくアッセイを流します

液体および固形腫瘍細胞を標的とするキメラ抗原受容体T細胞の効力を評価する定量的なインビトロ細胞質アッセイシステムを説明する。このプロトコルは、他の免疫エフェクター細胞、ならびに組み合わせ治療を評価するために拡張することができる。...

固体および造形癌細胞を標的とするキメラ抗原受容体T細胞のリアルタイム効力アッセイ

ここでは、抗腫瘍 T 細胞の活動の表現型および機能解析を可能にする T...

キメラ抗原受容体の T 細胞の抗腫瘍機能の予測評価のため培養腫瘍細胞の再投与に

ヒトCRISPR設計CAR-T細胞の製造

ここでは、末梢血ナチュラルキラー(PBNK)、肝臓組織からのNK細胞、末梢血単核球(PBMC)または臍帯血(CB)に由来するキメラ抗原受容体(CAR)-NK細胞を拡大する方法を紹介します。このプロトコルは、増殖したNK細胞の最適化された純度に加えて、221-mIL-21フィーダー細胞を使用したNKおよびCAR-NK細胞の増殖を実証します。...

膜結合型IL-21修飾B細胞株を用いたナチュラルキラー(NK)およびCAR-NK細胞増殖法

本プロトコルは、3Dおよび2D培養条件の両方で、軽度の細胞毒性を有するCD3−/CD45+CD56+細胞をヒト拡大電位幹細胞(hEPSC)から分化させる方法を示しています。これにより、複雑な微小環境を破壊することなく、日常的な表現型検証が可能になります。...

ヒト増殖電位幹細胞からのナチュラルキラー細胞の作製

このプロトコールは、ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞(CAR制御性T細胞)を生成および試験するための合理化されたワークフローを提供します。...

ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞の作製

非ウイルス性のSleeping Beautyトランスポゾンシステムを使用して、真菌病原体を標的とするキメラ抗原受容体ナチュラルキラー(CAR-NK)細胞を産生するためのトランスフェクションプロトコルの概要を説明します。抗原特異的な活性化を評価するために、改変された細胞を Aspergillus fumigatus...

非ウイルス性眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いた真菌感染症を標的とするキメラ抗原受容体ナチュラルキラー細胞のエンジニアリング

このプロトコルは、生細胞イメージングとフローサイトメトリーを用いて、ヒトの自然なキメラ抗原受容体介在および抗体依存性細胞毒性を一貫して測定するための標準化された in vitro.

キメラ抗原受容体および治療用抗体によって増強されるNK細胞毒性の定量化:生細胞イメージングおよびフローサイトメトリー

学ぶ、ヒトiPSC由来CAR-NK細胞の分化・拡張プロトコル。非ウイルス遺伝子導入とCRISPR-Cas9技術により、固形腫瘍に対する抗腫瘍活性とin vivo持続性を向上させる方法です。

ヒト人工多能性幹細胞由来キメラ抗原受容体発現ナチュラルキラー細胞の進歩

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