小容量チャンバーでの高分解能呼吸測定

この研究では、0.5 ミリリットルに校正された小容量チャンバーが、Oroboros プラットフォームの 2 ミリリットルの古典的な容量で得られた精度を損なうことなく、呼吸測定アッセイに使用できるかどうかを調査したいと考えています。

小容量チャンバーの開発と、精密なOXPHOS分析を使用した厳格な品質管理を備えた高分解能呼吸測定による評価は、開発、新しいイノベーション、つまり、1番目である12チャンバーO2k呼吸計、2番目、OXPHOS分析に適用される複雑なプロトコルで物質を自動滴定するロボットへの道を切り開きました。これらのアプリケーションは、ミトコンドリア分析、ミトコンドリア疾患の診断、ミトコンドリア機能に対する薬剤の利点と、ミトコンドリア機能を無意識に破壊するオフターゲット効果の両方に焦点を当てた医薬品開発の評価に向けてさらに拡大する上で極めて重要です。私のチームが30年以上前に高解像度呼吸測定法を開発したとき、ミトコンドリア、ミトコンドリア、ミトコンドリアというパラダイムがありました。筋肉と肝臓のミトコンドリアに違いがあったのかもしれませんが、それだけでした。これらのパラダイムの外では、ミトコンドリアに本当に興味を持つ人は誰もいませんでした。高解像度呼吸測定用に開発されたプロトコルにより、ミトコンドリア機能の多様性が示されました。これにより、さまざまな細胞型、組織、種におけるミトコンドリアの呼吸制御を新しい目で評価することができます。30年前、これを高く評価する出版物は10ほどありました。現在、私たちの機器では、これらのプロトコルを使用している 1,500 人以上がいます。

従来の2ミリリットルチャンバーと比較して、小容量チャンバーで必要なサンプルは4倍少なくなります。呼吸数が低いサンプルの場合、同じ量のサンプルを使用して体積比酸素フラックスを増やし、測定の不確かさを減らすことができます。

オロボロス研究開発研究所での私たちの仕事の焦点は、機器開発と学術研究を組み合わせることです。ミトコンドリアの呼吸機能と生物遺伝学のプロファイリングをマルチセンサー分析で評価します。つまり、呼吸、酸化還元電位、膜電位、カルシウム取り込み、過酸化水素生成、およびその他のさまざまなパラメーターを測定することで、生物遺伝学的プロファイルとミトコンドリアの機能と機能不全についてより深い洞察を得ることができます。

[ナレーター]まず、スモール ボリューム (SV チャンバー) を Oroboros に取り付けます。次に、Oroborosの電源を入れ、[接続]をクリックしてOroborosをDatLabソフトウェアに接続します。チャンバーを完全に乾燥させた後、ピペットを使用して 0.54 ミリリットルの水を SV チャンバーに加えます。次に、スターラーのスイッチを入れます。チャンバーを閉じる前に、ストッパーのOリングを湿らせ、毛細管を乾いた状態に保ちます。容量校正リングを緩め、液体がストッパーキャピラリーを満たし、上部キャピラリー端のレセプタクルにメニスカスが形成されるまで、ストッパーを下に挿入します。容量校正リングを締めてその位置を固定し、連続挿入の校正された容量の一貫性を確保します。まず、チャンバーに呼吸媒体MiR05を充填します。DatLabソフトウェアを起動します。機器バックグラウンドテストに適切なプロトコルを選択します。撹拌回転速度を 550 RPM に設定し、チャンバー容量を 0.5 ミリリットルに設定し、データ記録間隔を 2 秒に設定し、実験温度を摂氏 37 度に設定します。スターラーテストと空気校正を実行します。キーを押しながらカーソルを動かして、酸素濃度プロットにR1マークを設定します シフト。時折、ゼロ酸素校正を実施します。空気校正中に、O2-Zero Powderを50ミリモルのリン酸緩衝液にSVの2.5ミリモルの濃度に溶解して、新鮮なジチオナイトナトリウムストック溶液を調製します。空気校正が完了したら、チャンバーを閉じます。酸素信号を約60〜120分間監視し、酸素濃度を空気飽和から約150マイクロモルまで低下させます。酸素勾配の負のプロットに J01 から J04 とラベル付けされた 4 つのマークを設定します。オプションで、ハミルトンシリンジを使用して、ジチオナイトナトリウム溶液を滴定して酸素濃度を100マイクロモルに調整し、マークJ05を設定します。DatLabで機器の酸素バックグラウンド勾配を計算するには、[Flux Slope]を選択します。次に、酸素バックグラウンド補正ウィンドウを開き、酸素バックグラウンドデータのソースとしてアクティブファイルを選択します。すべての J0 マークが線形回帰の計算に使用されていることを確認します。次に、酸素バックグラウンド補正の適用をクリックします。まず、オロボロスチャンバーを脱イオン水で洗浄し、新鮮なMiR05培地をチャンバーに加えます。機器によるバックグラウンドテストの後、新しいDatLabタブを開き、ヒト血小板実験用のSUIT-003プロトコルを選択します。プロトコルサイドバーに表示されるDatLabプロトコルの概要を使用して、化学ストック溶液を選択します。次に、化学物質に応じてハミルトンシリンジを選択します。SUITプロトコルに従って、ラベルを貼ったシリンジラックにシリンジを置きます。部分的な容量置換の場合は、毛細管デッドボリュームを考慮して、オープンチャンバー内の実際の容量から除去されたボリュームVに相当するボリュームVを計算します。次に、完全に挿入されたストッパーを取り外し、ラックに置きます。ストックセル懸濁液の細胞タイプと濃度に基づいて、MiR05から計算された体積Vをチャンバーから取り除きます。次に、既知の細胞濃度のストック細胞懸濁液を同量の液体でチャンバーにピペットで入れます。対照的に、完全な容量交換を行うには、チャンバーから培地全体を吸い上げます。0.54ミリリットルの単離された心臓ミトコンドリアのストックをSVチャンバーに加えます。チャンバーを閉じ、ストッパーレセプタクルから余分なサンプル溶液を吸い取ります。基質アンカプラー阻害剤滴定(SUIT)プロトコルを開始するには、DatLabのイベントウィンドウを開いて滴定量を視覚化します。ハミルトンマイクロシリンジを使用して、化学原液をチャンバー内に滴定します。次に、DatLabでイベントを設定します。滴定後にフラックスを安定化させます。データ分析の場合は、プロットの代表的で安定した部分にマークを設定します。 空気飽和時のバックグラウンド酸素フラックスは、2.0ミリリットルチャンバーと比較して0.5ミリリットルチャンバーで3.9倍高く、理論的に予想される体積比バックグラウンド酸素フラックスの4倍の差と一致していました。機器のバックグラウンドフラックスの変動性は、2つのチャンバーボリュームでほぼ同じでした。生血小板、透過性線維芽細胞、および単離されたミトコンドリアの呼吸数は、適切なバックグラウンド補正が適用された場合、両方のチャンバータイプで密接に相関していました。酸素フラックスは、再酸素化後の0.5ミリリットルチャンバーよりも2ミリリットルチャンバーの方が速く安定しました。複合体III阻害後の残留酸素消費量は、2つのチャンバー間で一貫しており、機器の検出限界と一致していました。