Name: 小容量チャンバーでの高分解能呼吸測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 学ぶ 0.5mL小容量チャンバーによる高分解能呼吸測定法。従来の2.0mLチャンバーと比較して、4分の1のサンプル量で正確なミトコンドリア機能解析を実現し、限られた検体を用いた研究に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ヒト血小板に関する研究では、8 人のボランティアが研究に参加するための書面によるインフォームド コンセントを提供し、スウェーデン倫理審査局によって承認されました (Nr. 2013/181)。男性新生児からの2つのヒト皮膚線維芽細胞株がATCCから購入され、チェコ共和国保健省の倫理的承認に従って使用されました(プロジェクト:AZV MZ CR NU22-07-00474)。マウスを含む手順は、オーストリア動物実験法に従って、実験目的およびその他の科学目的で使用される脊椎動物の保護に関する欧州条約に準拠して実施されました(Tierversuchsgesetz 2012;指令2010/63 / EU;BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016)。実験動物の数を最小限に抑えるために3Rの原則を適用しました。
1. 体積校正
<ol>
	<li>小容量チャンバー(s V)またはクラシック容量チャンバー(cV)をオロボロスに取り付けます(図1A、B;表1)。</li>
	<li>Oroborosの電源を入れ、 DatLabに接続します。</li>
	<li>チャンバーを乾燥させます。</li>
	<li>0.54 mLのH2OをsV(0.50 mLの有効実験量と0.04 mLの毛細管死体積)または2.07 mLのH2OをcV(2.00 mLの有効容量と0.07 mLの毛細管死体積)にピペットで移動します。 注意: ガラスシリンダーの上部とポリオキシメチレン(POM)チャンバーホルダーの間の液体の損失を避けるために、ピペットチップをガラスチャンバーの壁に触れるほど深く挿入します。</li>
	<li>スターラーのスイッチを入れます。</li>
	<li>チャンバーを閉じる前に、毛細管管を乾いた状態に保ちながら、ストッパーのOリングを湿らせます。容量校正リングを緩め、液体がストッパーキャピラリーを満たし、キャピラリーの上端にあるレセプタクルに小さな液滴が現れるまで、ストッパーを下向きに挿入します(表1)。</li>
	<li>容量校正リングを締めて位置を固定し、ストッパーを連続して挿入すると校正された容量が得られるようにします。</li>
</ol>
2. オロボロス一般設定
<ol>
	<li>DatLabソフトウェアを起動します。</li>
	<li>実験温度(37°C)と撹拌回転速度を、チャンバーsVで550 rpm(9.2 Hzまたは回転数/秒)またはチャンバーcVで750 rpm(12.5 Hz)に設定します。データサンプリング間隔を2秒に設定し、機器O2バックグラウンドテストでは80秒(40データポイント)以上、呼吸測定では40秒(20データポイント)で平滑化します。 注:マグネチックスターラーバー(ポリ二フッ化ビニリデン[PVDF]でコーティングされたAlNiCo; 表1)チャンバー内のスターラーのレベルで3.5mTの電界強度を持つパルス回転磁場によって撹拌されます。</li>
	<li>MiR05または後続の実験で使用したのと同じインキュベーション培地で空気校正28 を実行します。</li>
	<li>ゼロ酸素校正は時々実行しますが、実験を開始する直前には実行しないでください。<ol>
		<li>O2-ゼロ粉末を 50 mM リン酸緩衝液 (pH 8.0) に溶解して、sV または cV チャンバーでそれぞれ 2.5 mM または 10 mM の濃度に溶解することにより、新鮮な Na-ジチオナイト原液を調製します。</li>
		<li>Na-ジチオナイトを過剰に滴定して、O2濃度0μM14,28で生の信号R0またはゼロ電流[μA]を取得します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 機器によるO2 バックグラウンドテスト
<ol>
	<li>チャンバーs V
	<ol>
		<li>空気校正後、チャンバーを閉じます。O2濃度が空気飽和から約150 μMに低下するまで、酸素信号を約60分間監視します。プロット「O2 スロープ負」に J°1 から J°4 までの 4 つのマークを設定します。 注:実験を開始する前に、この機器によるO2バックグラウンドテストを毎日実行してください。</li>
		<li>オプション:ハミルトンシリンジを使用して、ステップ2.4.1に従って調製したNa-ジチオナイトを滴定して、100μMのO2濃度に達します(図1C)。 注:別のプロトコルでは、Na-ジチオナイトを滴定注入マイクロポンプ(TIP2k; 補足図1 および 補足図2)を測定するための標準的な方法との比較のために、機器のバックグラウンドO2フラックス28。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>チャンバー cV
	<ol>
		<li>空気校正後、チャンバーを閉じ、O2勾配が安定するのを待って、プロット「O2勾配負」28にJ°1マークを設定します。ハミルトンシリンジを使用して、ステップ2.4.1に従って調製したNa-ジチオナイトを滴定します。チャンバーの酸素レジームに一致させるために0.7 μLのステップで、O2濃度を150 μMに下げます。</li>
		<li>別のNa-ジチオナイト滴定ステップ(約7 μL)を追加して、O2濃度を100 μMに下げます(図1D)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>機器によるO2バックグラウンドデータ解析<ol>
		<li>DatLab28 で機器の O2 背景勾配を計算します。トップメニューから[流束/勾配]を選択します。</li>
		<li>O2 背景補正ウィンドウを開きます。O2 背景のソースとして [アクティブ ファイル] を選択し、線形回帰の計算に使用する J° マークを選択します。O2 背景補正を適用します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67442/67442fig1v2.jpg"> 
図1:小容量(sV)および古典容量(cV)チャンバーと機器によるO2バックグラウンドテスト。 (A) Chamber sV.(B) チャンバー cV.(C)スロープネガティブおよびJ°1マークの代表的な痕跡、sV(0.5 mL、緑)およびc、V(2.0 mL、青)。(D)対応する酸素濃度とR1マーク。3回の手動Na-ジチオナイト滴定(約0.7 μL、10 mMストック、cV)およびsVチャンバーでの2.5 mMおよび10 mMストックの最終7.0 μL滴定。滴定によるスパイクが解消されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67442/67442fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
4. オロボロスチャンバーへのサンプルの追加
注:サンプルは、部分的な体積置換(本研究では血小板および線維芽細胞)または完全な体積置換(本研究では単離されたミトコンドリア)の2つの方法でチャンバーに追加できます。
<ol>
	<li>部分的なボリュームの置換<ol>
		<li>完全に挿入されたストッパーを取り外します。MiR05からボリュームVをピペットで取り除きます。Voutは、血小板の場合は60〜70 μL、線維芽細胞の場合は80〜150 μLで、ストック細胞懸濁液中の細胞濃度に従って計算されます。</li>
		<li>Voutと同等で、同じ容量のVJ.iのストック細胞懸濁液(既知の細胞濃度)をチャンバーにピペットで入れます(図2)。</li>
		<li>実用体積 V( 0.54 mLおよび2.07 mL)で実験細胞濃度を、実効実験体積 V (0.5 mLおよび2.0 mL)よりも大きく計算します。 注:ストック細胞懸濁液の濃度と実験細胞濃度は、小さな滴定誤差と互換性のあるVJ.i = Voutの容量を得るように計画する必要があります。血小板を用いた実験では、キャピラリーデッドボリュームが0.05 mLのチャンバーsVにプロトタイプのストッパーが使用されました。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ボリュームの完全な交換<ol>
		<li>チャンバーから培地全体を吸い上げ、sV またはcVチャンバー内の実験サンプル濃度でそれぞれ少なくとも0.54 mLまたは2.07 mLの単離ミトコンドリアストック溶液と交換します。</li>
		<li>チャンバーを閉じ、ストッパーレセプタクルから余分なミトコンドリア原液を吸い取ります。 注:完全な容量置換では、ハミルトンシリンジでストッパーキャピラリーを介して密閉チャンバーに滴定することによって発生する可能性のあるミトコンドリア濃度の変動が排除されます。後者の方法は、濃縮ストック懸濁液で調製された小径のサンプル(例えば、単離されたミトコンドリア)に適用できます。ただし、ハミルトンシリンジの長さ51 mmの針(内径0.41 mm)に加えられるせん断力によって、壊れやすい細胞を原形質膜の潜在的な損傷にさらします。これは、ストッパーを取り外し、部分的または完全な容量交換によってサンプルをチャンバーにピペッティングすることで回避できます。3種類のミトコンドリア製剤が研究されました。サンプル調製は、 補足ファイル11、26、29、30に記載されています。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生細胞:ヒト血小板<ol>
		<li>血小板を含むクライオバイアルを37°Cのウォーターバスに挿入し、氷がほとんど残らないまで内容物を解凍します。</li>
		<li>クライオバイアルを開き、1 mLの予熱培地(DPBS + 10 mM EGTA、37°C)を滴下してゆっくりと加えます。</li>
		<li>血小板を穏やかに混合し、総量10 mLの予熱培地(DPBS + 10 mM EGTA、37°C)の50 mL遠心分離管に移します。スイングアウトローター(加速度6、ブレーキ2)を使用して、室温(RT)で1000 g で10分間遠心分離します。</li>
		<li>血小板を0.25 mLのDPBS + 10 mM EGTA(RT)に再懸濁し、157・106 から 210 ·106 x・mL-1を0.5mLチャンバーで、164・106 から 220 ·106 x・mL-1を2.0mLチャンバーに入れます(基本ユニットxの詳細については31を参照)。 注:1台のオロボロスは、それぞれ位置AとBにsV とcV チャンバーを装備し、それぞれ位置BとAにsV とcVチャン バーを装備した別のオロボロと並行して使用されました。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透過処理細胞:ヒト線維芽細胞<ol>
		<li>公称細胞濃度0.75・106 x・mL-1を両方のチャンバータイプで計算し、実際の濃度を計算します(ステップ4.1.3)。 注:異なるオロボロス機器を並行して使用し、それぞれにsV またはcV チャンバーのいずれかが装備されていました。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>単離ミトコンドリア:マウス心臓<ol>
		<li>15 μLのミトコンドリア懸濁液を5985 μLのミトコンドリア呼吸培地(MiR05)に加えると、0.013〜0.026 mg∙mL-1の範囲のストックミトコンドリアタンパク質濃度が得られます。</li>
		<li>ミトコンドリア懸濁液を完全な容量交換によってオロボロスチャンバーに追加します。 注:1台のオロボロは、それぞれ位置AとBにsV およびcV チャンバーを装備し、それぞれ位置BとAにsV およびcV チャンバーを装備した別のオロボロと並行して使用されました。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67442/67442fig02.jpg"> 
図2:部分的な体積置換による細胞懸濁液の添加。 (a)0.5 mLチャンバーsvおよび(b)2.0 mLチャンバーcvへの添加。(1) 機器のバックグラウンド O2 フラックス JO2° を測定するための、呼吸媒体 V と充填されたストッパー キャピラリー Vstc の体積を備えた密閉チャンバー。(2) ストッパーを取り外し、Vstc をチャンバーに排出し、総体積 V'= V+Vstc になります。(3) 媒体の部分除去 Vout = -V J.i.ボリューム V''= V'+V出力がチャンバー内に残ります。(4)呼吸器ストックセル懸濁液の体積V J.iを含むサブサンプルをチャンバーにピペッティングし、希釈細胞懸濁液の総体積V# = V + V stcをもたらします。(5) 実験体積 V 中の体積比 O2 磁束 JV、O2 を測定するための、充填されたストッパー キャピラリー (デッド ボリューム Vstc) を備えた密閉チャンバー。この図は、HRR41のセル数と正規化の図2Aから変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67442/67442fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
5. SUITプロトコル
<ol>
	<li>補足表1にリストされている化学物質のストック溶液をハミルトンマイクロシリンジでチャンバーに滴定し、滴定量を調整して、sVチャンバーとcVチャンバーで同じ実験濃度を得る(図6、8、10の図の凡例を参照)。</li>
	<li>プロトコル SUIT-003_D018 32,33 を選択します (本研究の血小板の場合)。</li>
	<li>プロトコル SUIT-001_D004 4,15,34,35 および SUIT-002_D007 4,15,35,36 を選択します (本研究の線維芽細胞の場合)。</li>
	<li>プロトコル SUIT-002_D005 4,15,35,37 を選択します (本研究の単離ミトコンドリア用)。</li>
</ol>
6. SUITデータ分析
<ol>
	<li>DatLabで、選択したプロットのセクションを定義するための マーク を設定します。</li>
	<li>トップメニューの[ 流束/勾配 ]を選択します。 [流束/勾配 ]ウィンドウを開きます。SUITプロトコルの各滴定による懸濁サンプルの希釈のための 滴定量補正 を適用します。</li>
	<li>トップメニューから [マーク] を選択します。マーク 統計を 開いて、残酸素消費量(rox)を差し引いてベースラインで補正されたマークされたデータポイントの中央値を表示します。</li>
	<li>スプレッドシートを使用して、逆回帰分析25,28により、sVチャンバーとcVチャンバーで得られたペアの結果間の切片と傾きを計算します。</li>
	<li>ソフトウェア jamovi 2.3.1338 を使用して、s、V および cV チャンバー内の rox 状態 (最小 O2 フラックス) の呼吸数を、対応のあるスチューデントの t 検定によって比較します。 注:Oroboros装置の2つのチャンバーは機能的に独立しているため(温度とDatLabの記録間隔を除く)、異なる装置を使用するのと同様に、各チャンバーでの測定を個別に検討できます。最終結果は、変動性に関する情報とともに、複数のチャンバーの中央値または平均値として報告される場合があります。</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>ミトコンドリア高分解能呼吸測定のためのチャンバー容積の探索

<ol><li>Zdrazilova, L., Hansikova, H., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparable+respiratory+activity+in+attached+and+suspended+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparable respiratory activity in attached and suspended human fibroblasts.</a> PLoS ONE. 17 (3), e0264496(2022).</li>
<li>Schöpf, B., et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32198407/">OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation.</a> Nat Commun. 11 (1), 1487(2020).</li>
<li>Meszaros, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+predictive+value+of+graft+viability+and+bioenergetics+testing+towards+the+outcome+in+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">The predictive value of graft viability and bioenergetics testing towards the outcome in liver transplantation.</a> Transplant International. 37, 12380(2024).</li>
<li>Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+fluorespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells%2C+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle%2C+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 1782, 31-70 (2018).</li>
<li>Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8746845/">Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen.</a> J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).</li>
<li>Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (20), 11080-11085 (2000).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14713113/">Oxygen Conformance of Cellular Respiration.</a> Hypoxia. Advances in Experimental Medicine and Biology. Roach, R. C., Wagner, P. D., Hackett, P. H. , Springer. Springer, Boston, MA. (2003).</li>
<li>Harrison, D. K., Fasching, M., Fontana-Ayoub, M., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+redox+states+and+respiratory+control+in+mouse+and+beef+heart+mitochondria+at+steady-state+levels+of+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome redox states and respiratory control in mouse and beef heart mitochondria at steady-state levels of hypoxia.</a> J Appl Physiol. 119 (10), 1210-1218 (2015).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Komlódi, T., Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Moore, A. L., Rich, P. R., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://www.bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/komlodi_2021_q">Coupling and pathway control of coenzyme Q redox state and respiration in isolated mitochondria.</a> Bioenerg Commun. 2021.3, (2021).</li>
<li>Suomalainen, A., Nunnari, J. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38788685/">Mitochondria at the crossroads of health and disease.</a> Cell. 187 (11), 2601-2627 (2024).</li>
<li>Cardoso, L. H. D., et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39424161/">Fatty acid β-oxidation in brain mitochondria: Insights from high-resolution respirometry in mouse, rat and Drosophila brain, ischemia and aging models.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871, 167544(2025).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11718759/">Bioenergetics at low oxygen: dependence of respiration and phosphorylation on oxygen and adenosine diphosphate supply.</a> Respir Physiol. 128 (3), 277-297 (2001).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://books.google.at/books?id=JMlo1CuofE4C&dq=Gnaiger+E+(2008)+Polarographic+oxygen+sensors,+the+oxygraph+and+high-resolution+respirometry+to+assess+mitochondrial+function.+In:+Mitochondrial+dysfunction+in+drug-induced+toxicity+(Dykens+JA,+Will+Y,+eds)+John+Wiley+%26+Sons,+Inc,+Hoboken,+NJ:327-52.&lr=&source=gbs_navlinks_s">Polarographic Oxygen Sensors, the Oxygraph and High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function.</a> Mitochondrial dysfunction in drug-induced toxicity. Dykens, J. A., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 327-352 (2008).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/gnaiger_2020_mitopathways">Mitochondrial pathways and respiratory control. An Introduction to OXPHOS analysis.</a> Bioenerg Commun. 2020.2, (2020).</li>
<li>Diaz, E. C., Adams, S. H., Weber, J. L., Cotter, M., Børsheim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+LDL-C%2C+high+blood+pressure%2C+and+low+peak+VO%E2%82%82+associate+with+platelet+mitochondria+function+in+children-The+Arkansas+Active+Kids+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Elevated LDL-C, high blood pressure, and low peak VO₂ associate with platelet mitochondria function in children-The Arkansas Active Kids Study.</a> Front Mol Biosci. 10, 1136975(2023).</li>
<li>Ehinger, J. K., Morota, S., Hansson, M. J., Paul, G., Elmér, E. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25893255/">Mitochondrial dysfunction in blood cells from amyotrophic lateral sclerosis patients.</a> J Neurol. 262 (6), 1493-1503 (2015).</li>
<li>Heimler, S., et al. <a target="_blank" href="http://bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/heimler_2022">Platelet bioenergetics are associated with resting metabolic rate and exercise capacity in older adult women.</a> Bioenerg Commun. 2022.2, (2022).</li>
<li>Palacka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+mitochondrial+bioenergetics+reprogramming+in+patients+with+urothelial+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Platelet mitochondrial bioenergetics reprogramming in patients with urothelial carcinoma.</a> Int J Mol Sci. 23 (1), 388(2021).</li>
<li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiration+in+response+to+iron+deficiency+anemia%3A+Comparison+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiration in response to iron deficiency anemia: Comparison of peripheral blood mononuclear cells and liver.</a> Metabolites. 12 (3), 270(2022).</li>
<li>JedIicka, J., et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36647911/">Impact of aging on mitochondrial respiration in various organs.</a> Physiol Res. 71 (Suppl. 2), S227-S236 (2022).</li>
<li>Westerlund, E., et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38439844/">Correlation of mitochondrial respiration in platelets, peripheral blood mononuclear cells and muscle fibers.</a> Heliyon. 10 (5), e26745(2024).</li>
<li>Hütter, E., Renner, K., Pfister, G., Stöckl, P., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+changes+in+respiration+and+oxidative+phosphorylation+in+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated changes in respiration and oxidative phosphorylation in primary human fibroblasts.</a> Biochem J. 380 (3), 919-928 (2004).</li>
<li>Yépez, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OCR-Stats%3A+Robust+estimation+and+statistical+testing+of+mitochondrial+respiration+activities+using+Seahorse+XF+Analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer.</a> PLoS One. 13 (7), e0199938(2018).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/Gnaiger_2021_MitoFit_BCA">Bioenergetic cluster analysis - mitochondrial respiratory control in human fibroblasts.</a> MitoFit Preprints. 2021.8, (2021).</li>
<li>Palmer, J., Tandler, B., Hoppel, C. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/925018/">Biochemical properties of subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria isolated from rat cardiac muscle.</a> J Biol Chem. 252, 8731-8739 (1977).</li>
<li>Lai, N. M., Kummitha, C., Rosca, M. G., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol. 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Baglivo, E., Cardoso, L. H., Cecatto, C., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://www.bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/baglivo_2024">Statistical analysis of instrumental reproducibility as internal quality control in high-resolution respirometry.</a> Bioenerg Commun. 2022.8, (2022).</li>
<li>Mela, L., Seitz, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/007668797955006X?via%3Dihub">Isolation of mitochondria with emphasis on heart mitochondria from small amounts of tissue.</a> Methods Enzymol. 55, 39-46 (1979).</li>
<li>Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/cardoso_2021_mgg">Magnesium Green for fluorometric measurement of ATP production does not interfere with mitochondrial respiration.</a> Bioenerg Commun. 2021.1, (2021).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26124/becprep.2025-0004">The elementary unit — count and numbers in the International System of Units.</a> BEC preprints. , (2025).</li>
<li>Vernerova, A., et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34944675/">Mitochondrial respiration of platelets: Comparison of isolation methods.</a> Biomedicines. 9 (12), 1859(2021).</li>
<li>Oroboros Instruments SUIT-003 O2 ce-pce D018. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-003_O2_ce-pce_D018">https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-003_O2_ce-pce_D018</a> (2024).</li>
<li>Oroboros Instruments SUIT-001 O2 ce-pce D004. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-001_O2_ce-pce_D004">https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-001_O2_ce-pce_D004</a> (2024).</li>
<li>Timón-Gómez, A., et al. <a target="_blank" href="https://doi.org/10.1113/EP092792">Bioenergetic profiles and respiratory control in mitochondrial physiology: Precision analysis of oxidative phosphorylation.</a> Exp Physiol. , 1-33 (2025).</li>
<li>Oroboros Instruments SUIT-002 O2 ce-pce D007. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_ce-pce_D007">https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_ce-pce_D007</a> (2024).</li>
<li>Oroboros Instruments SUIT-002 O2 mt D005. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_mt_D005">https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_mt_D005</a> (2024).</li>
<li>The Jamovi Project jamovi (Version 2.3.13). , 
 <a target="_blank" href="https://www.jamovi.org/">https://www.jamovi.org/</a> (2024).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/images/3/3f/Gnaiger_1983_POS_preface.pdf">Preface: A biologist´s view.</a> Polarographic Oxygen Sensors. Aquatic and Physiological Applications. Gnaiger, E., Forstner, H. , Berlin, Heidelberg, New York. Springer. V-VII (1983).</li>
<li>Hütter, E., Renner, K., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+oxygen+kinetics+of+cellular+respiration+and+linear+oxygen+dependence+of+antimycin+A+inhibited+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption.</a> Mol Biol Rep. 29 (1/2), 83-87 (2002).</li>
<li>Oroboros Instruments Cell count and normalization in HRR. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/Cell_count_and_normalization_in_HRR">https://wiki.oroboros.at/index.php/Cell_count_and_normalization_in_HRR</a> (2020).</li>
<li>Williams, O., Sergent, S. R. <a target="_blank" href="https://europepmc.org/article/nbk/nbk557800">Histology Platelets</a>. , StatPearls Pubs. Treasure Island, FL. (2022).</li>
<li>Donnelly, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/donnelly_2022">The ABC of hypoxia - what is the norm.</a> Bioenerg Commun. 2022.12.V2, (2022).</li>
<li>Aguirre, E., Rodríguez-Juárez, F., Bellelli, A., Gnaiger, E., Cadenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+model+of+the+inhibition+of+respiration+by+endogenous+nitric+oxide+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Kinetic model of the inhibition of respiration by endogenous nitric oxide in intact cells.</a> Biochim Biophys Acta. 1797 (5), 557-565 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Anaconda3</td><td>Anaconda Software Distribution</td><td>https://www.anaconda.com/</td> <td>software</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Merck, Germany</td><td>117105</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics-antimycotics 100x</td><td>Biosera, France</td><td>XC-A4110</td><td>CAUTION H317 アレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性がある</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A8674</td><td>注意 H300&nbsp;飲み込むと致命的、H400 短期 (急性) 水生ハザード&nbsp;</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマアルドリッチ、米国</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>シグマアルドリッチ、米国</td><td>&nbsp;A 2383</td><td></td></tr><tr><td>BSA 脂肪酸フリー</td><td>シグマ・アルドリッチ、米国</td><td>A 6003</td><td>ウシ血清アルブミン</td></tr><tr><td>CaCO3</td>シ<td>グマ・アルドリッチ、米国</td><td>C 4830</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>シグマ・アルドリッチ、米国</td><td>C2759</td><td>シアン化カルボニル m-クロロフェニル ヒドラゾン 注意 H301 + H311 + H331 飲み込んだり、皮膚に接触したり、</td></tr>吸入したりすると有毒です <tr><td>Countess 自動セルカウンター&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国</td><td>AMQAX100</td><td></td></tr><tr><td>シトクロム c</td><td>シグマアルドリッチ、米国</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>DatLab&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments、オーストリア</td><td>バージョン 7.4</td><td>データ収集および分析用ソフトウェア</td></tr><tr><td>DatLab&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments、オーストリア</td><td>バージョン 8.1</td><td>データ収集および分析用ソフトウェア</td></tr><tr><td>DC タンパク質アッセイ</td><td>Bio-Rad、米国</td><td>5000112</td><td>タンパク質アッセイキット。注意 H314 重度の皮膚火傷や目の損傷を引き起こす</td></tr> デ<tr><td>ジトニン</td><td>シグマ アルドリッチ、米国</td><td>D5628</td><td>注意 H301 飲み込むと有毒</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>シグマ アルドリッチ、米国</td><td>D 0632</td><td>注意 H318 重度の眼の損傷を引き起こす</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Pan Biotech、ドイツ</td><td>P04-05551</td><td>ダルベッコ'の改造されたイーグル」s medium</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich、米国</td><td>D2650</td><td>ジメチルスルホキシド</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza Bioscience、スイス</td><td>LONBE17-512F</td><td>カルシウムフリー ダルベッコ's リン酸緩衝生理食塩水</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>シグマ・アルドリッチ、米国</td><td>E 4378</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国</td><td>A5256701</td><td>ウシ胎児血清</td></tr>グル<tr><td>コース</td><td>シグマ・アルドリッチ、米国</td><td>&nbsp;G7528</td><td></td></tr>グル<tr><td>タミン酸&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich、米国</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>グリセロリン酸</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-215789</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3s Large</td><td>Thermo Fisher Scientific、米国</td><td>HM3S</td><td>遠心分離機</td></tr><tr><td>Hettich Rotina 380R&nbsp;</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co. KG、ドイツ</td><td>1701</td><td>遠心分離機</td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>ハネウェル フルーカ、オーストリア</td><td>56750</td><td>注意 H302 飲み込むと有害、H314 重度の皮膚火傷や目の損傷を引き起こします、H360D 胎児に損傷を与える可能性があります</td></tr><tr><td>。</td><td>jamovi プロジェクト</td><td>バージョン 2.3.13</td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>K+-MES</td><td>Sigma-Aldrich、米国</td><td>M 8250</td><td></td></tr><tr><td>Leucosep tube&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One GmbH、オーストリア</td><td>Z642843-300EA</td><td>ポリエチレンバリア付き遠心分離管</td></tr>リン<tr><td>ゴ酸&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich、米国</td><td>M1000</td><td>CAUTION H319 重度の眼刺激を引き起こします。</td></tr><tr><td>マンニトール</td><td>シグマ アルドリッチ、米国</td><td>M 4125</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Scharlau、スペイン</td><td>MA 0036</td><td></td></tr><tr><td>MiR05-Kit</td><td>Oroboros Instruments、オーストリア</td><td>60101-01</td><td>ミトコンドリア呼吸培地</td></tr>ミ<tr><td>キサー&nbsp;</td><td>Swelab Instruments、スウェーデン</td><td>440S</td><td>ロッキングテーブル</td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冷凍容器</td><td>Thermo Fisher Scientific、米国</td><td>5100-0001</td><td>冷凍容器</td></tr><tr><td>Oroboros</td><td>Oroboros Instruments、オーストリア</td><td></td><td>NextGen-O2k と O2k は、オロボロス</td></tr><tr><td>オロボロスチャンバー cV</td><td>Oroboros Instruments、オーストリア</td><td>23100-01</td><td>クラシック容量チャンバー</td></tr><tr><td>Oroboros Chamber sV</td><td>Oroboros Instruments、オーストリア</td><td>33100-01</td><td>小容量チャンバー</td></tr><tr><td>Oroboros TIP2k-Module</td><td>Oroboros Instruments、オーストリア</td><td>11100-03</td><td>滴定注入マイクロポンプ</td></tr><tr><td>O2-Zero 粉末</td><td>Oroboros Instruments、オーストリア</td><td>26600-02&</td><td>nbsp;Na-ジチオナイト注意 H251 自己発熱: 発火する可能性がある、H302 飲み込むと有害、H319 深刻な眼の炎症を引き起こす</td></tr><tr><td>オクタノイルカルニチン</td><td>バイオトレンド - APExBIO テクノロジー、ドイツ</td><td>B6371</td><td></td></tr><tr><td>オリゴマイシン</td><td>シグマ アルドリッチ、米国</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>ホスホクレアチン</td><td>シグマ アルドリッチ、米国</td><td>P 7936</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸</td><td>シグマ アルドリッチ、米国</td><td>P2256</td><td>注意 H317 アレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性がある</td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>シグマ・アルドリッチ、米国</td><td>R8875</td><td>注意 H300 飲み込むと致命的</td></tr><tr><td>皮膚線維芽細胞株&nbsp;</td><td>&nbsp;ATCC、米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich、米国</td><td>S2002</td><td>注意 H300 + H310 + H330 飲み込んだり、皮膚に接触したり、吸入したりすると致命的です</td></tr> ス<tr><td>ブチリシン A</td><td>Sigma-Aldrich、米国</td><td>P 5380</td> 注意 <td>H318 - 重篤な眼の損傷を引き起こす、H334 - 吸入するとアレルギーや喘息の症状、または呼吸困難を引き起こす可能性があります</td></tr> コ<tr><td>ハク酸塩</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマ - アルドリッチ、米国</td><td>S 7903</td><td></td></tr><tr><td>Swelab アルファ血球カウンター &nbsp;</td><td>Boule Diagnostics AB、スウェーデン 1420041</td><td></td><td></td></tr><tr><td>タウリン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ、米国</td><td>T 0625</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite TM F200</td><td>テカン、スイス分</td><td></td><td>光光度計</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>シグマ・アルドリッチ、米国</td><td>T3134</td><td>N、N、N'、N'-テトラメチル-p-フェニレンジアミン二塩酸塩 注意 H315 皮膚刺激を引き起こし、H319 深刻な眼刺激を引き起こす</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>シグマ・アルドリッチ、米国</td><td>T4799</td><td>注意 H334 吸入するとアレルギーや喘息の症状、または呼吸困難を引き起こす可能性があります</td></tr><tr><td>Vacuette</td><td>Greiner Bio-One GmbH、オーストリア</td><td>15452520</td><td></td></tr></tbody></table>

小容量チャンバーでの高分解能呼吸測定

High-Resolution Respirometry in a Small-Volume Chamber

Investigating respiratory fluxes is decisive for understanding the complex interplay between metabolic processes. Studies of cells and tissues with ...

high-resolution-respirometry-in-a-small-volume-chamber

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

高解像度の呼吸計測は、ミトコンドリアの酸素消費量を決定するために使用されます。これは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体」（I-IV）呼吸数、最大のミトコンドリアの電子伝達系の能力、およびミトコンドリア外膜の完全性を決定するための簡単な技術です。...

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

ここでは、麻酔をかけたブタから大腿四頭筋の標本を採取し、ミトコンドリアを分画遠心分離によって分離します。次に、ミトコンドリア呼吸鎖複合体I、II、およびIVの呼吸数を高解像度呼吸測定を使用して決定します。...

高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離

このプロトコルの目的は、高解像度の呼吸を使用してそのまま 832/13...

天然化合物の存在下でそのまま β 細胞のミトコンドリア機能を測定するための高解像度の呼吸

このプロトコルでは、calorespirometry、放熱の呼吸、エネルギー代謝を評価するために非侵襲的アプローチを提供する直接・同時測定をについて説明します。この手法は、総細胞エネルギーの流れを監視することによって好気性と嫌気性経路エネルギー利用への貢献を評価するために使用されます。...

Calorespirometry: 細胞のエネルギー代謝を調査する強力な非侵襲的アプローチ

このプロトコルは、細菌性呼吸器疾患の進行を非侵襲的に監視するための簡略化された全身プレチスモグラフィ装置の構築と使用を示しています。...

呼吸性類鼻疽症中の肺機能を特徴付けるための簡略化された全身プレチスモグラフィ

高分解能呼吸計を用いた酸化的リン酸化の評価は、ミトコンドリアおよび細胞エネルギー代謝の機能解析の不可欠な部分となっている。ここでは、チャンバーおよびマイクロプレートベースの高分解能呼吸計を使用して細胞エネルギー代謝を分析するためのプロトコルを提示し、各デバイスの主な利点について説明します。...

チャンバーおよびプレートベースの呼吸計を使用して細胞および組織の生体エネルギーを評価するための高解像度呼吸法

このプロトコルでは、サンゴのホロビオントの生理学的特徴を調査するために使用できるマイクロスピロメトリーシステムのセットアップと実行について説明します。...

新しいマイクロスピロメトリーツールを用いたサンゴホロビオントの生理学的特性評価

精子のミトコンドリア機能を高分解能肺活法で解析することで、密閉室系で自由に動く精子の酸素消費量を測定することができます。この技術は、精子のミトコンドリアの特徴と完全性に関する情報を提供するヒト精子の呼吸の測定に適用できます。...

ヒト精子のミトコンドリア機能を評価するための高分解能肺活法

ここでは、ヒトまたはマウスの筋肉から採取した新鮮な透過性骨格筋線維におけるミトコンドリアの酸化的リン酸化を測定するための包括的な方法について説明します。この方法により、ミトコンドリア呼吸のリアルタイム定量化と、既存のミトコンドリアネットワークと膜の完全性を維持しながら、燃料の好みと代謝の柔軟性の評価が可能になります。...

高解像度呼吸測定法によるヒトおよびマウス骨格筋線維のミトコンドリア呼吸の測定

このビデオの記事では、安定かつ制御可能なジオメトリを持つ匂い勾配の構築を可能にする新しい方法を説明します。我々は、簡単にこれらの勾配が嗅覚の欠陥のために画面に使用することができます（フルおよび部分的な臭覚障害）と走化性行動のより微妙な特徴を研究する方法を示しています。...

ショウジョウバエの幼虫の匂い駆動型の動作の高分解能測定

学ぶ 0.5mL小容量チャンバーによる高分解能呼吸測定法。従来の2.0mLチャンバーと比較して、4分の1のサンプル量で正確なミトコンドリア機能解析を実現し、限られた検体を用いた研究に貢献します。

小容量チャンバーでの高分解能呼吸測定

さらに動画を探す