HeLa細胞を用いた抗MDA5自己抗体の検出と光学顕微鏡による免疫細胞化学

次の実験の主な目的は、免疫細胞化学を使用して抗 MDA5 抗体をスクリーニングすることです。これは、HeLa細胞を使用して行われ、HeLa細胞にMDA5コンストラクトをトランスフェクトします。そのため、HeLa細胞はMDA5抗体によって結合できるMDA5タンパク質を産生します。

HeLa細胞にMDA5コンストラクトを組み込んだ後、Triton試薬を使用してHeLa細胞の膜を透過し、抗MDA5抗体を通過させます。その後、抗MDA5抗体を含む患者血清を添加します。その後、抗MDA5抗体はHeLa細胞内のMDA5タンパク質に結合します。

その後、西洋わさびペルオキシダーゼが結合した二次抗体が細胞内に展開され、二次抗体が抗MDA5抗体に結合します。最後に、クロモゲンを細胞に添加し、西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次抗体の存在下で酸化し、光学顕微鏡下で可視色を生成します。肯定的な立位結果は、上の写真のようなものを示します。

今日のビデオデモンストレーションでは、医学研究の重要な分野である、抗MDA5抗体とも呼ばれる抗黒色腫分化関連遺伝子5抗体の検出について説明します。これらの自己抗体は、間質性肺疾患患者、特に急速に進行する患者にとって、簡単な診断指標として重要な役割を果たします。この研究の重要性は、患者の転帰への潜在的な影響にあります。MDA5 自己抗体の早期かつ正確な検出は、この重篤な自己免疫疾患を効果的に管理するために不可欠です。

私たちが実証した方法の主な利点は、抗MDA5自己抗体をスクリーニングする黄金法に比べて、従来の放射性標識免疫訪問アッセイと比較して、より迅速に実行でき、時間と労力を節約できることです。この効率の向上により、より多くのサンプルを処理し、結果を迅速に生成することができます。さらに、私たちの方法は、移行免疫沈降アッセイと比較して、優れた効率を提供するだけでなく、安全性と費用対効果の点でも優れていることに注意することが重要です。

それでは、それがどのように行われるかを見てみましょう。私の研究助手であるテオ・カイ・ファが手順を主導します。10%ウシ胎児血清と1%抗生物質抗真菌薬を含むダルベッコの修飾イーグル培地で、加湿された5%CO2雰囲気で摂氏37度でHeLa細胞を維持します。

2〜3日ごと、または細胞が90〜100%のコンフルエンシーに達したときに、細胞を継代します。24ウェルプレートから各ウェルに70, 000個のHeLa細胞を配置します。トランスフェクションの24時間前に、約90%のコンフルエントである細胞をネット化します。

500ナノグラムのプラスミンと1.5マイクロリットルのトランスフェクション試薬をそれぞれ25マイクロリットルの還元血清培地で希釈します。希釈したDNAを加え、希釈したトランスフェクション試薬を1対1の比率で行います。よく混ぜて5分間インキュベートします。

1日前に座った細胞に混合物を加え、撹拌してDNA脂質複合体をすぐに混合します。細胞が80〜90%コンフルエントであることを確認します。細胞を摂氏37度で加湿した5%CO2半球で40〜4時間インキュベートし、免疫細胞化学に進みます。

市販のファクターを使用しています。詳細については、材料表を参照してください。それらのトランスフェクション有効性は50%ですトランスフェクションの成功と標的タンパク質の発現は、細胞に凍結タンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクトし、西部血液を伝導して標的タンパク質の発現を視覚化することによって決定できます インキュベーション後、細胞をPBSで2回洗浄して、残りの培地を除去します。

洗浄は、プレートまたはオービタルシェーカーを振ることによって行うことができます。PBS中の4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定します注意。パラホルムアルデヒドは有毒です。

適切な取り扱いガイドラインを使用してください。細胞を室温で15分間放置します。次に、固定試薬を廃棄します。

PBSを使用して細胞を2回洗浄します。Triton試薬を塗布し、細胞を室温で10分間放置します。Triton X 400を0.3%濃度のPBSで使用しました。10分後、Triton試薬を廃棄します。

PBSを加えて細胞を一度洗浄します。次のステップでは、PBS中の10%ウシ胎児血清でブロッキングを行い、細胞を室温で1時間放置し、ブロッキング試薬を取り除きます。次に、PBSを加えて細胞を一度洗浄します。

希釈した患者血漿を細胞に加えます。使用前に、患者の血漿をPBSで1対5, 000希釈の比率で希釈してください。希釈を調整して信号を強化したり、必要に応じてバックグラウンドを減らしたりして、偏りのない結果を保証します。

スタッフは検査を実施しましたが、どのサンプルが患者のもので、どのサンプルが健康な人からのものであるかは知りませんでした。サンプルを摂氏4度で12〜16時間インキュベートします。インキュベーション期間の後、患者のサンプルを取り出し、細胞をPBSで3回洗浄します。

希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ、抗ヒトIgGをPBS中で1対250希釈の比率で細胞を処理します。細胞を室温で1時間放置します。1時間後、二次抗体を廃棄します。

PBSで3回すすいでください。細胞を洗浄した後、ウェルあたり300マイクロリットルのDAB作業溶液で細胞を染色します。DAB作業溶液は、製造元の指示に従って、DABプロモーション濃縮液とDAB希釈剤を欠落させることによって調製されます。

細胞を5分間染色した後、色素を取り除きます。染料を取り除いた後、イオン化蒸留水ですすぎ、5分間振ってください。希釈したヘマトキシンで細胞核を対比染色します。

ヘモトキシンを10倍の希釈倍数で使用します。染色プロセスまで5分間待ちます。5分後、ヘモトキシンを廃棄し、分析した蒸留水で5分間ずつ2回洗浄します。

最後のステップでは、光学顕微鏡で染色結果を観察します。抗MDA5自己抗体の免疫細胞化学アッセイ結果を解釈してみましょう。肯定的な結果。

真陽性は、MDA5を発現するHeLa内部に強い茶色染色を示します。これにより、患者のサンプル中の抗MDA5自己抗体が確認されます。否定的な結果。

陰性の結果は、HeLa細胞に茶色染色がなく、抗MDA5自己抗体がないことを示しています。偽陽性の結果。重要なことに、偽陽性は、MDA5の発現に関係なく、すべての細胞で広範な褐色染色を示します。

自己免疫疾患の順序で見られるこの非特異的染色は、誤診を避けるために真陽性と区別する必要があります。当社の方法は、抗 MDA5 臓器抗体を検出するための、より速く、より安全で、よりコスト効率の高い方法を提供します。これは、間質性肺疾患の管理における患者の転帰に大きな影響を与える可能性があります。

このビデオを見た後、免疫細胞化学手順を実行する方法と、検査結果に関連する臨床を特定する方法を学ぶことができます。