Name: 乳がん患者由来異種移植片のハイスループット解離と同所性移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: 学ぶ乳がん患者由来異種移植片のハイスループット解離とマウスへの同所性移植法。この手法により、研究者はヒト腫瘍に対する全身応答を効率的に研究でき、乳がんの筋疲労メカニズム解明に貢献します。

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<meta charset="utf8"></head><body>乳がん患者由来異種移植片のハイスループット解離と同所性移植

<ol><li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2020%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 3 (3), 209-249 (2021).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+renewable+tissue+resource+of+phenotypically+stable%2C+biologically+and+ethnically+diverse%2C+patient-derived+human+breast+cancer+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models.</a> Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).</li>
<li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> J Hematol Oncol. 13 (1), 1-16 (2020).</li>
<li>Wilson, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+xenograft+model+implicates+peroxisome+proliferator-activated+receptor+signaling+as+driver+of+cancer-induced+muscle+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer xenograft model implicates peroxisome proliferator-activated receptor signaling as driver of cancer-induced muscle fatigue.</a> Clin Cancer Res. 25 (7), 2336-2347 (2019).</li>
<li>Wilson, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+reprogramming+by+breast+cancer+regardless+of+treatment+history+or+tumor+molecular+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle reprogramming by breast cancer regardless of treatment history or tumor molecular subtype.</a> NPJ Breast Cancer. 6 (1), 18(2020).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R%CE%B3null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+models+of+human+breast+cancer%3A+Protocols+for+in+vitro+and+in+vivo+applications+in+tumor+biology+and+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived models of human breast cancer: Protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine.</a> Curr Protoc Pharmacol. 14, Unit14.23(2013).</li>
<li>Whittle, J. R., Lewis, M. T., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models+of+breast+cancer+and+their+predictive+power%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models of breast cancer and their predictive power.</a> Breast Cancer Res. 17 (1), 17(2015).</li>
<li>Fleming, J. M., Miller, T. C., Meyer, M. J., Ginsburg, E., Vonderhaar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+regulation+of+human+breast+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Local regulation of human breast xenograft models.</a> J Cell Physiol. 224 (3), 795-806 (2010).</li>
<li>Okano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+implantation+achieves+better+engraftment+and+faster+growth+than+subcutaneous+implantation+in+breast+cancer+patient-derived+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Orthotopic implantation achieves better engraftment and faster growth than subcutaneous implantation in breast cancer patient-derived xenografts.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).</li>
<li>Ryu, A. H., Eckalbar, W. L., Kreimer, A., Yosef, N., Ahituv, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+antibiotics+in+cell+culture+with+caution%3A+Genome-wide+identification+of+antibiotic-induced+changes+in+gene+expression+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Use antibiotics in cell culture with caution: Genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation.</a> Sci Rep. 1 (1), 7533(2017).</li>
<li>Amens, J. N., Bahçecioglu, G., Zorlutuna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+system+effects+on+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Immune system effects on breast cancer.</a> Cell Mol Bioeng. 14 (4), 279-292 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 mL ツベルクリンシリンジ</td><td>BD</td><td></td><td>305945 滅菌</td></tr><tr><td>1x リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>2.0 mL 丸底マイクロ遠心チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>0030123620</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>26 G 針、&frac12; in.</td><td>BD</td><td>305111</td><td>滅菌済み</td></tr><tr><td>5.0 mL マイクロチューブ</td><td>Eppendorf</td><td>0030119401</td><td>滅菌済み</td></tr><tr><td>8+ 週齢 NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>#005557</td><td></td></tr><tr><td>アルコール調製パッド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-363-750</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>基底膜抽出物 (マトリゲル)</td> <td>Cultrex</td><td>3632-005-02</td><td></td></tr><tr><td>綿先端アプリケーター、6 インチ。</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-029-553</td><td></td></tr><tr><td>滅菌湾曲鉗子、中型非鋸歯状チップ、152 mm</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>50-365-845</td><td></td></tr>滅菌<tr><td>脱毛クリーム</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジェントルMACS Cチューブ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACSオクトディスソーシエーターヒーター付き</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>No. 10 メスの刃</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>12-000-162</td><td>滅菌不織布</td></tr><tr><td>ガーゼ スポンジ、4x4 インチ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>22-028-558</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>RPMI 1640 1x + L-グルタミン</td><td>ギブコ</td><td>11875093</td><td>滅菌腫瘍</td></tr><tr><td>解離キット、ヒト</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr></tbody></table>

乳がん患者由来異種移植片のハイスループット解離と同所性移植

High-Throughput Dissociation and Orthotopic Implantation of Breast Cancer Patient-Derived Xenografts

この研究では、マウスにおける患者由来の乳がん異種移植片の同所性移植のための効率的で非外科的アプローチを概説しています。乳房腫瘍組織をヒト特異的酵素と機械的攪拌を用いて解離し、Matrigel:RPMI 1640の1:1 v/v比で再懸濁し、NSGマウスの鼠径部乳脂肪パッドに同所的に注射しました(図1および図2)。PDXモデルの忠実度を確保するために、元の患者腫瘍サンプルと継代した腫瘍との一致は、確立された組織病理学的およびゲノム技術によって検証されました。受容体発現は、エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体(PR)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER2)などの標準的な乳がん受容体の免疫組織化学(IHC)染色を用いてプロファイリングしました(図3)。細胞形態は、切片化された腫瘍切片のヘマトキシリンおよびエオシン(H&amp;E)染色および染色された切片の専門の病理学者の解釈を用いて評価された。ヒト細胞の遺伝的ランドスケープの保存と保持は、バルクRNAシーケンシングと短タンデムリピート(STR)認証を使用して検証しました(図4および表1)。さらに、病原体検査では、患者や継代した腫瘍サンプルの汚染は確認されておらず、これは免疫不全マウスの使用を考えると重要な検証ステップです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67607/67607fig1.jpg"> 
図1:プロトコルの概要。 腫瘍の解離と注射のワークフローの表現。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67607/67607fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
NSGマウスは、時計回りと反時計回りに交互に塗布する脱毛クリームを使用して注射用に調製し、鼠径部の乳房脂肪パッド領域から毛を完全に除去しました(図2A)。露出した腹部の皮膚から余分な脱毛クリームを滅菌ガーゼで拭き取り、その部分をアルコールパッドで消毒しました(図2B)。解離した腫瘍細胞を装填した滅菌針を、第4鼠径乳頭乳腺脂肪パッドに対して0.5〜1mm尾側に約45度の角度で配置しました(図2C)。腫瘍細胞を制御された方法で第4鼠径乳頭乳腺脂肪パッドに注入しました(図2D)。腫瘍の成長は、最初に脂肪パッドのデジタル触診によって検出されました。その後、腫瘍体積の進行を磁気共鳴画像法(MRI)を用いて定量的に追跡した(図2E)。体重(図2F)と腫瘍体積(図2G)の両方を毎週測定し、体重の変動と腫瘍体積の進行を監視しました。腫瘍は、早期終了を必要とする潰瘍形成などの創傷を監視するために目視検査されました。鼠径乳腺脂肪パッドにおけるPDXの両側生着の成功を 図2Hに示し、腫瘍切除後の脂肪パッドを 図2Iに示します。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67607/67607fig2.jpg"> 
図2:マウスの調製、PDX注射、および腫瘍進行のモニタリング(A)乳腺脂肪パッドを徹底的に脱毛した。(B)ターゲット注入領域が明確に見える注入部位の提示。(C)脂肪パッド上のシリンジの位置、針の長さに応じて、通常は0.5〜1mmの尾側から脂肪パッドまで。白矢印は挿入時の針のターゲット領域を示しています。(D)左第4鼠径乳頭乳腺脂肪パッドへの解離細胞注入の描写。注射の場合、針は図のように約45度の角度で保持する必要があります。.(E) 注射部位の両側生着腫瘍の代表的なMRI画像。腫瘍は緑色で強調表示されます。(F)腫瘍細胞注射後の体重の代表的な進行(グラム単位)(n = 5)。濃い青色の線は単純な線形回帰を表し、これは有意にゼロではありません (p &lt; 0.0001)。マウスは平均して22mg増加しました。1日目。濃い青色の網掛けは 95% 信頼区間、水色の陰影は 95% の予測区間、オレンジ色の線は縦方向の体重測定値です。(G)腫瘍細胞注射後の個々の腫瘍体積の代表的な進行(mm3)(n = 10)。濃い青色の線は指数回帰を表します。腫瘍体積倍加時間は19.08日であった。濃い青色の陰影は95%信頼区間、水色の陰影は95%の予測区間、オレンジ色の線は縦方向の腫瘍体積です。(H)鼠径乳腺脂肪パッドへのPDX細胞の両側生着の成功。血管新生が各腫瘍に供給されていることに注目してください。白い矢印は腫瘍を示しています。(I)腫瘍の切除後の鼠径乳腺脂肪パッド領域。(H,I)定規の単位はcm単位です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67607/67607fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
代表的なPDX(PEN_056)は、ステージ3Aの浸潤性乳がんを患う31歳の白人女性に由来します。右乳房から採取した原発腫瘍の受容体状態はERでPR陰性、HER2陽性(ER-PR-HER2+)であった。ER、PR、およびHER2受容体のIHC染色では、患者とPDX腫瘍との間に一致が示されました(図3)。しかし、PDXはHER2の発現が強く、これはHER2+細胞の選択的増殖によるものと考えられます。病理医によるH&amp;E染色切片の評価では、患者とPDXサンプルの両方で形態と細胞診が一貫している低分化型がんが確認されました(図3)。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67607/67607fig3.jpg"> 
図3:IHC受容体とH&amp;E染色 (左列)ER、PR、HER2受容体のIHC染色と患者腫瘍のH&amp;E染色。ERおよびPR染色は、予想されたように明らかな陽性染色を示していません。HER2染色はHER2(茶色)の陽性を示します。(右列)ER、PR、HER2受容体のIHC染色、および継代したPDXサンプルのH&amp;E染色。受容体の染色は、患者サンプルで見られるものと非常によく似ていますが、HER2は継代後により大きな発現を示します。スケールバー:50μm;倍率:20倍。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67607/67607fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ショートタンデムリピート(STR)ジェノタイピングにより、American Type Cell Culture Collection(ATCC)ASN-0002-2022コンセンサスガイドラインで定義された13の常染色体遺伝子座と3つの追加遺伝子座で&gt;80%の類似性が確認されました(表1)。患者の腫瘍サンプルとPDXのバルクRNAシーケンシング(RNA-seq)により、最新のヒト参照ゲノム(T2T CHM13v2.0)と同等のレベルのアラインメントが確認され、リードのそれぞれ82.3%と79.1%がアラインメントされました。さらに、患者の腫瘍とPDXは、ピアソンr値が0.9559と強い正の相関を示しました(図4A)。PDXと患者腫瘍を比較した遺伝子セット濃縮解析では、遺伝子オントロジーの生物学的プロセスから有意に濃縮された上位10の経路が主に免疫学的遺伝子セットであることが明らかになり、PDXと患者腫瘍との間の転写分散の大部分は、PDXサンプル中の免疫細胞の欠如に由来することが示唆されました(図4B)。
<table border="1" fo:font-size="7px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>D5S818</td>
			<td>D13S317</td>
			<td>D7S820</td>
			<td>VWAの</td>
			<td>TH01</td>
			<td>午前</td>
			<td>TPOXの</td>
			<td>CSF1POの</td>
			<td>D3S1358</td>
			<td>D21S11</td>
			<td>D18S51</td>
			<td>Penta_E</td>
			<td>Penta_D</td>
			<td>D8S1179</td>
			<td>FGAの</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>患者の腫瘍</td>
			<td>12 13</td>
			<td>8 8</td>
			<td>8 9</td>
			<td>17 17</td>
			<td>9 9.3</td>
			<td>X X</td>
			<td>8 10</td>
			<td></td>
			<td>15 16</td>
			<td>29 31.2</td>
			<td>16 19</td>
			<td>12 13</td>
			<td>14 14</td>
			<td>10 14</td>
			<td>21 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDX腫瘍</td>
			<td>13 14</td>
			<td>8 8</td>
			<td>8 9</td>
			<td>17 17</td>
			<td>9 9.3</td>
			<td>X X</td>
			<td>10 10</td>
			<td></td>
			<td>15 15</td>
			<td>29 29</td>
			<td>16 19</td>
			<td>12 13</td>
			<td>14 14</td>
			<td>10 14</td>
			<td>21 25</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:ショートタンデムリピート(STR)認証。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67607/67607fig4.jpg"> 
図4:RNAシーケンシングの相関と遺伝子セットの濃縮。 (A)患者腫瘍(x軸)とPDX(y軸)のすべての遺伝子のlog2正規化100万あたりのカウント(CPM)を視覚化した散布図。強い正の相関が見られ、ピアソンのr値は0.9559でした。(B) PDXとPDX を比較した場合の上位10の濃縮遺伝子オントロジー生物学的プロセス遺伝子セットのリッジプロット。患者の腫瘍。曲線は、各遺伝子セットのエンリッチメントスコア分布を示しています。color は、各遺伝子セットの FDR q 値を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67607/67607fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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