ゼブラフィッシュの低発現タンパク質を可視化するための蛍光標識

この製品は、蛍光タンパク質タグでタンパク質を平準化し、興味深いゼブラフィッシュラボ個体のタンパク質の位置と発現を視覚化するために最適化されています。特に、低存在量で発現するタンパク質のイメージングに有用です。私たちの方法は、ドナーの建設プロセスを簡素化し、加速します。

これらのコンポーネントは、CDSを除いて、事前にバックボーンに組み込まれています。ドナーも効率を上げるために最適化されました。伝送スクリーンワークフローは、継承可能な核を最小限の時間と労力で蓄積します。

ゼブラフィッシュは、感染や免疫の研究で広く使用されているモデル生物です。特に、敗血症の根底にあるメカニズムに関心があります。現在、私たちのプロトコールを使用して蛍光標識を簡単に行えるようになったため、ゼブラフィッシュの画像、敗血症タンパク質、および細胞の標識を試みます。

まず、健康なメスのゼブラフィッシュ1匹と健康なオスのゼブラフィッシュ2匹を交配水槽に入れます。仕切りを使ってオスとメスを分離し、交尾の準備をします。マイクロインジェクション当日は、RNaseフリー環境下で氷上でマイクロインジェクションミックスを調製します。

Rnaseフリーのピペットチップを使用して、マイクロインジェクション溶液を針にロードします。装填した針をマイクロインジェクターに取り付けられたマイクロマニピュレーターに入れます。顕微鏡で、先のとがったピンセットを使用して、針の先端が折れるまでそっとつまむようにして切ります。

針が一貫して1ナノリットルの液滴を排出するまで、注入圧力を調整します。次に、交配タンクから仕切りを取り外し、魚を6分間繁殖させます。1細胞期の胚を収集し、胚バッファーを含むシャーレに移します。

光学顕微鏡で胚の健康状態を調べ、未受精卵や破片を取り除きます。20個の健康な胚を別のシャーレに未注入のコントロールとして置いておき、ディッシュにラベルを付けます。小さなブラシを使用して、室温に温めたマイクロインジェクションプレートの溝に健康な1細胞期の胚を移し、穏やかに並べます。

プレートから余分なバッファーを取り除きます。針先の助けを借りて、動物の棒が針に向くように各胚の位置をゆっくりと調整します。1ナノリットルの混合溶液を動物極に注入します。

注入後、胚バッファーを入れた6ウェルプレートに胚を穏やかにすすぎます。プレートを摂氏28.5度の恒温インキュベーターに入れます。受精後10時間で、実体顕微鏡で胚の発生を調べ、死んだ胚を取り出します。

受精後24時間で、ジェノタイピングのために胚を1.5ミリリットルのチューブに集め、余分な水を慎重に捨てます。プロテイナーゼKを含む100マイクロリットルの溶解バッファーを各チューブに加えます。チューブを56°Cで1時間インキュベートし、次に95°Cで15分間インキュベートします。

インキュベーション後、200マイクロリットルのエタノールを加えてよく混ぜます。チューブを19, 000Gで10分間遠心分離し、上清を捨ててから、ペレットを500マイクロリットルの70%エタノールで再懸濁します。再度遠心分離機にかけ、ペレットを風乾してから、50マイクロリットルの二重蒸留水に溶解します。

1マイクロリットルの抽出物を使用して、PCR用の反応ミックスを調製します。PCR後、アガロースゲルを2マイクロリットルのPCR産物で泳動し、増幅が成功したことを確認します。酵素消化を行い、sgRNAの効率を評価します。

消化液を穏やかに混合し、製造元の指示に従って室温でインキュベートします。消化産物のアガロースゲルを未消化のPCRコントロールと並べて、消化を確認します。sgRNAの効率を解析するには、TIDE Webサイトを開き、[Start TIDE]をクリックします。

sgRNAのガイド配列をガイド配列フレームにインプットします。[Browse]をクリックして、ワイルドタイプコントロールのシーケンシング結果をコントロールサンプルクロマトグラムフィールドにアップロードします。同様に、編集したサンプルのシーケンシング結果を試験サンプルのクロマトグラムフィールドにアップロードします。

「ビューを更新」をクリックして、結果を分析します。まず、ライゲーション非依存クローニングまたはエキソヌクレアーゼIIIによるLICを使用して、ドナープラスミドを構築します。ベクトル要素 1 および要素 2 の一部と重複するシーケンスを持つプライマー F1 を設計します。

要素1、要素2、および要素3の一部を含むプライマーR2を設計します。プライマーF2を設計して、エレメント3と4、およびsgRNAターゲットサイトに続くCDSの5プライム配列を含めます。プライマーR1は、コーティングシーケンスの3つのプライムシーケンスとベクターとのオーバーラップシーケンスを使用して設計します。

ゼブラフィッシュCDNAをテンプレートとして使用し、設計されたプライマーでPCRを行います。エタノール沈殿物を使用してPCR産物を精製します。ドナーベクターをpCIやAcc65Iなどの制限酵素で消化し、消化したドナーベクターを精製します。

精製されたPCRフラグメントと消化されたドナーベクターをDNAゲル電気泳動を使用して定量します。次に、LICミックスを精製したドナーベクターと調製し、氷上で60分間インキュベートします。0.5モルのEDTAを1マイクロリットル追加して反応を停止します。

ピペットを上下に動かして溶液を混合します。反応混合物を摂氏60度で5分間インキュベートします。LIC製品を氷の上で冷却します。

次に、LIC製品を使用してDH5-Alphaコンピテントセルを形質転換します。形質転換細胞をアンピシリンを含むLuria-Bertaniプレート上に播種し、16時間増殖させます。インキュベーション後、LICプレートから単一コロニーをピックアップし、酵素消化分析とDNAシーケンシングを行います。

精製キットを使用して、正しいドナープラスミドを抽出し、精製します。ゼブラフィッシュの胚にマイクロインジェクションミックスを注入し、マイクロインジェクションの12〜48時間後に、マイクロインジェクションの12〜48時間後に、ゼブラフィッシュの幼生の蛍光を観察します。確立されたスクリーニング方法を使用して、蛍光幼虫を選択し、それらを別々に飼育します。

生後1か月で、麻酔をかけた各ゼブラフィッシュからコドルフィンの小片をラベル付きPCRチューブに集めます。対応する麻酔をかけたゼブラフィッシュを、チューブのラベルと一致するUV滅菌ろ過水で満たされた6ウェルプレートに入れます。アルカリ溶解法を用いてゲノムDNAを抽出します。

左ホモロジーアームの上流にフォワードプライマーを設計し、インサートにリバースプライマーを設計します。シーケンスの5つの主要な接合部を標的にして、PCRを実行します。スクリーニングしたFゼブラフィッシュと野生型ゼブラフィッシュを交配して得られたF1胚のGFP発現パターンを調べます。

ジャンクションPCRを使用してF1胚を遺伝子型決定します。遺伝性の特異的蛍光は、すべてのF1子孫の筋肉で観察され、connexon 39.9のGFP標識が成功したことを示しています。遺伝性の特異的蛍光は、すべてのF2子孫の水晶体で検出され、connexon 44.1のmCherryタグ付けが成功したことを示唆しています。

正しいノックイン結合39.9および44.1は、ジャンクションポリメラーゼ連鎖反応を通じて確認されました。