前処理腫瘍細胞の同種共培養環境におけるヒトT細胞活性の解析

腫瘍細胞は治療中に免疫表現型を変化させ、それが転帰に影響を与える可能性があるため、私たちの研究の目的は、T 細胞と腫瘍細胞の間の相互作用を調査して、それらの相互作用をより深く理解することです。

キナーゼ阻害剤と放射線療法を組み合わせることにより、特に放射線耐性腫瘍における放射線感受性を高めます。DNA損傷応答を標的とすることは、現在、最近の開発の中心的な部分です。現在、放射線生物学の分野では、in vitro データと in vivo データの比較可能性を高めるために、3 次元細胞培養モデルと共培養モデルが確立されています。

[ナレーター]まず、HSC4腫瘍細胞を適切な容量のD10培地で取得します。条件ごとに少なくとも3つのウェルを播種し、それぞれに96ウェルプレートの200マイクロリットルの培地に15,000個の細胞を含みます。腫瘍細胞のみのウェルとT細胞のみのコントロール用のウェル、および共培養日の各処理の細胞計数用のウェルを含む、サンプル処理用に1つのプレートを指定します。2日目に、腫瘍細胞を必要な濃度のキナーゼ阻害剤で処理します。3〜4時間後に1枚のプレートを照射し、24時間のインキュベーション後に5グレイで低分割照射用に同じプレートを照射します。末梢血単核球、またはPBMC単離の場合は、健康なドナーから採取したEDTA混合血液を2本の50ミリリットル遠心分離チューブに移します。両方の遠心分離チューブに最大50ミリリットルのPBSと2%FBSを充填します。次に、PBMC分離用のプラスチックインレイを備えた6本の遠心分離チューブを準備します。それぞれに15ミリリットルの低温密度勾配媒体を充填します。密度勾配培地に12〜15ミリリットルの希釈血液を慎重に重ねます。チューブを1,200 Gで減速せずに10分間遠心分離します。遠心分離後、上清を4本の新しい50ミリリットル遠心分離チューブに移します。使用済みのチューブは廃棄してください。新しい遠心分離チューブに最大50ミリリットルのPBSと2%FBSを充填し、室温で120 Gで10分間遠心分離します。上清を慎重に捨てます。細胞ペレットを2%FBSを含む1ミリリットルのPBSに再懸濁し、2つのペレットを1つのファルコンチューブに結合します。遠心分離チューブに2%FBSを含むPBSを再び50ミリリットルまで充填します。PBMCを300 Gで10分間遠心分離します。上清を慎重に捨てます。細胞ペレットを80マイクロリットルのMACSと10あたりのバッファーに7細胞の累乗で再懸濁します。10個あたり20マイクロリットルのCD8マイクロビーズを7細胞の累乗に加え、上下にピペッティングして慎重に混合します。摂氏4度で15分間インキュベートします。インキュベーション後、2ミリリットルのMACSと10あたりのバッファーで細胞を7つの細胞の累乗で洗浄します。チューブを室温で300Gで10分間遠心分離します。上清を廃棄した後、細胞を1000マイクロリットルのMACSとバッファーに再懸濁します。マグネットに2つのMSカラムをセットし、その下に2本の15ミリリットルの遠心分離チューブを置きます。500マイクロリットルのMACSとバッファーでカラムを平衡化します。次に、同量の細胞懸濁液を調製したMSカラムにロードします。500 マイクロリットルの MACS とバッファーでカラムを 3 回すすぎます。最終的に収集した細胞をフロースルーまたはCD8陰性としてラベル付けし、1つの遠心分離チューブに結合します。次に、CD8陽性T細胞を標識した新しい15ミリリットルの遠心分離チューブを取ります。磁気標識されたCD8陽性T細胞を含む両方のカラムを、それぞれ1000マイクロリットルのMACSとバッファーで洗い流します。T細胞を染色する前に、300 Gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞ペレットを1000マイクロリットルのPBSに再懸濁します。懸濁液を300 Gで5分間再度遠心分離します。上清を廃棄した後、細胞ペレットを2000マイクロリットルの1マイクロモルCFSE染色液に再懸濁します。摂氏37度で20分間インキュベートします。次に、染色した細胞を300 Gで5分間遠心分離します。細胞をPBSで洗浄した後、T細胞培地に再懸濁します。細胞をCD3およびCD28でコーティングされた6ウェルプレートに播種し、インキュベートします。4日目に、T細胞を回収し、それぞれの培地に再懸濁します。指定されたウェルをカウントした後、必要な数のT細胞を腫瘍細胞ウェルに1対1の比率で追加します。7日目に、T細胞増殖を定量するために培養プレートをインキュベーターから取り出します。細胞を洗浄した後、目的の抗体で染色し、フローサイトメトリーを実行してT細胞を評価します。前方散乱領域と前方散乱の高さに基づいてダブレット母集団を除外して、一重項を取得します。 一重項をプロットして、前方散乱領域と側面散乱領域に基づいてT細胞を識別します。側面散乱領域に対するCD3発現をプロットして、T細胞を識別します。さらに、側方散乱領域に対してCD8シグナルをプロットした後、CD8陽性T細胞を同定します。すべてのT細胞はCD3とCD8を発現する必要があります。すべてのCD8陽性T細胞のCFSEシグナルをヒストグラムとしてプロットします。ゲーティングステップを完了した後、CD8陽性T細胞をインプットとして選択し、側面散乱領域に対してそれぞれの表面マーカー蛍光をプロットすることにより、それらのCD25またはHLA-DRアイソタイプ発現を分析します。増殖性T細胞の割合は、照射されたHSC4腫瘍細胞と共培養すると増加しました。放射線療法または RT および RT と ATR の阻害は、RT と ATM 阻害と比較して T 細胞増殖を大幅に促進しました。増殖性の高いT細胞の中で、RTとATRの阻害は増殖の刺激に最も効果的でした。T細胞上のCD25の発現は、RT処理されたHSC4腫瘍細胞との共培養後にダウンレギュレートされました。ATM阻害剤単独による腫瘍細胞の前処理は、ATR阻害剤と比較してCD25発現を有意に減少させました。RT と ATM 阻害剤の組み合わせにより、RT と ATR 阻害剤の併用と比較して CD25 発現が増加しました。T細胞上のHLA-DR発現は、一般にRTによってアップレギュレートされました。RTとATR阻害剤で前処理されたHSC4細胞との共培養は、RT単独またはRTとATM阻害剤と比較して、HLA-DR発現をさらに増加させました。