Name: 前処理腫瘍細胞の同種共培養環境におけるヒトT細胞活性の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶ 前処理腫瘍細胞との同種共培養系におけるヒトT細胞活性解析法。放射線治療とキナーゼ阻害剤の併用療法がT細胞増殖を促進するメカニズムを解明し、がん免疫療法の最適化に貢献します。

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このアッセイには、採血とヒト初代細胞の培養が含まれます。したがって、これらの分析には倫理的な投票が必須です。この原稿で提示されたすべての結果は、IMMO-NHD試験の倫理的承認によってカバーされており、すべてのドナーから書面によるインフォームドコンセントが得られました。2022年11月9日、エアランゲン・ニュルンベルク大学の機関審査委員会により承認が下されました(出願番号21-415-B)。この研究で使用されたHSC4腫瘍細胞は、市販の細胞株に由来します。
このアッセイは、放射線療法(RT)と2つの特異的キナーゼ阻害剤を含む治療環境でヒト頭頸部扁平上皮がん(HNSCC)細胞株HSC4を使用したT細胞および腫瘍細胞共培養アッセイのすべてのステップを例示しています。したがって、細胞数、トリプシン化時間、治療スキームなどのパラメータは、この共培養環境に固有であり、他の腫瘍細胞株にも適合させる必要があります(「ディスカッション」セクションも参照)。すべての遠心分離ステップを室温で行いました。本研究では、キナーゼ阻害剤であるAZD0156とVE-822を用いて、HSC4細胞のDNA損傷修復(DDR)系を標的とした。AZD0156(Selleckchem)は毛細血管拡張性運動失調症変異(ATM)タンパク質を阻害し、VE-822(Selleckchem)は毛細血管拡張性運動失調症およびRad3関連(ATR)タンパク質を標的とします。両方の阻害剤は、腫瘍細胞の放射線感受性を高めるための潜在的な薬剤として議論されています。 図1 は、 ex vivo アッセイのフローチャートを示しており、前処理した腫瘍細胞とCD3/CD28刺激ヒトCD8+ T細胞との共培養について詳しく説明しています。使用した試薬や機器は 、材料表に記載されています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig01.jpg"> 
図1:(CD3/CD28)刺激ヒトCD8+ T細胞との共培養における前処理腫瘍細胞の ex vivo アッセイのフローチャート。 1日目:HSC4腫瘍細胞の播種。2日目:腫瘍細胞の処理と単離、CFSE染色、およびヒトCD8 + T細胞のCD3 / CD28コーティングプレートへの播種。3日目:腫瘍細胞の治療。4日目:腫瘍細胞の代表的なウェルのカウント。すべてのT細胞の採取とカウント。T細胞とHSC4腫瘍細胞を1:1の比率で共培養します。5日目-8日目:共培養インキュベーション。8日目:共培養の収穫、上清の凍結、抗体ベースの染色、およびフローサイトメトリーによる細胞の分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
1. 腫瘍細胞の播種(1日目)
注:タイミング:1時間。ヒトHSC4腫瘍細胞は、T75細胞培養ボトルから96ウェルプレートに播種されます。
<ol>
	<li>細胞培養ボトルの上清(D10培地)を捨ててください。</li>
	<li>腫瘍細胞を5 mLの37°C温PBSで洗浄します。PBS を破棄します。</li>
	<li>HSC4腫瘍細胞は細胞培養フラスコにしっかりと接着する傾向があるため、すべての細胞を確実に剥離させるために2段階のトリプシン処理が推奨されます。このためには、3mLのトリプシンを加え、ボトルを37°Cの加熱プレートに3分間置き、ピペットでトリプシンを捨てます。</li>
	<li>さらに3 mLのトリプシンを加え、ボトルを加熱プレートにセットし、単一細胞懸 ?? 液が得られるまで待ちます。.顕微鏡で単一細胞懸濁液を確認します。</li>
	<li>D10 Medium(10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM)の2倍容量を添加してトリプシンを停止し、完全に再懸濁し、細胞を50 mLの遠心分離チューブに移します。</li>
	<li>単一細胞懸濁液の細胞数を決定し、総量に応じて腫瘍細胞の総量を計算します。ノイバウアー細胞チャンバーは、細胞数の測定に推奨されます。</li>
	<li>腫瘍細胞を含む50 mLの遠心分離チューブを300 x g で室温で5分間遠心分離します。上清を捨てます。</li>
	<li>HSC4腫瘍細胞を適切な容量のD10培地に再懸濁して、200 μL培地中の15,000細胞の濃度に到達させます。</li>
	<li>腫瘍細胞の計画された処理に従って、2つの96ウェルプレート(1xサンプル、1x腫瘍細胞のみコントロール、1x細胞カウントウェル)の200μL培地に15,000個のHSC4腫瘍細胞を含む少なくとも3つのウェルを各条件で播種します。 注:セル番号は、細胞株と倍加時間によって異なります。インキュベーション中に100%のコンフルエントを避けるために、さまざまな処理の細胞数を実験前に調べる必要があります。</li>
	<li>細胞を37°C、5%CO2 、飽和湿度で24時間インキュベートします。</li>
</ol>
2. 腫瘍細胞の治療(2日目)
注:タイミング:3〜5時間。24時間のインキュベーション時間後、以前に播種したHSC4細胞を所望の処理スキームに従って処理することができる。この例示的なケースでは、腫瘍細胞はATM阻害剤またはATR阻害剤で治療される。本明細書では、さらに、2つの96ウェルプレートのうちの1つも、その後に2×5Gyを照射する。
<ol>
	<li>腫瘍細胞を治療するために、1 μM AZD0156 (ATM阻害剤)および0.1 μM VE-822(ATR阻害剤)の濃度を得るためのキナーゼ阻害剤を調製します。</li>
	<li>それに応じて腫瘍細胞を治療します、例えば、各プレートで1列のサンプルを3.1μLのATM阻害剤で処理し、2列目のサンプルを3.1μLのATR阻害剤で処理します。</li>
	<li>37°Cで3-5時間のインキュベーション後、1枚のプレートに5Gyを照射する。</li>
	<li>さらに24時間インキュベートした後、同じプレートに再び5Gyを照射します。</li>
</ol>
3. T細胞の単離(2日目)
注:タイミング:4時間CD8 + T細胞は、健康な成人ドナーに由来する末梢血(PB)の密度勾配遠心分離後、PBMCから抗CD8マイクロビーズで磁気的に単離されます。次に、単離されたT細胞をCFSEで染色し、CD3/CD28でコーティングしたウェルプレートでインキュベートして刺激します。後のステップでリソースと材料に配慮した作業を可能にするには、共培養実験に必要なT細胞の量を推定することが重要です。ドナーに依存して、約 45 ml の EDTA 血液から 50,000,000 から 100,000,000 の PBMC を分離できます。PBMC全体の約10%はCD8+ T細胞です。
<ol>
	<li>密度勾配遠心分離<ol>
		<li>健康なドナーから得られた9mLのEDTA血液チューブ3〜5本を2本の50mL遠心分離チューブに移します。</li>
		<li>両方の遠心分離チューブをPBS + 2% FBSで50 mLに充填します。</li>
		<li>6本の遠心分離チューブ(PBMCの分離用のプラスチックインレイ付き)を準備し、それぞれに15 mLの+ 4°C冷密度グラジエント培地を充填します。</li>
		<li>密度勾配培地に、ステップ3.1.2で希釈した血液12〜15mLを慎重に重ねます。</li>
		<li>1200 x g で10分間遠心分離します(減速は不要)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>T細胞刺激用の6ウェルプレートの調製<ol>
		<li>抗体の調製:1 mg / mLの抗CD3(クローンOKT3)溶液をPBSで調製します。0.1 mg/mL の抗 CD28(クローン 28.2)溶液を PBS で調製します。</li>
		<li>推奨事項:遠心分離中(ステップ3.1.5)は、コーティング溶液の調製に、ウェル自体のコーティングにはT細胞の刺激に使用します。</li>
		<li>5 μL の CD3-抗体溶液を 4.995 μL の PBS と、50 μL の CD28-抗体溶液と 4.950 μL の PBS を混合します (最終濃度: 1 μg/μL)。</li>
		<li>1.000 μLの両抗体溶液を6ウェルプレートの各ウェルに添加します。</li>
		<li>予想されるT細胞の量に応じて、6ウェルプレートの2ウェルまたは3ウェルをコーティングし、37°Cで少なくとも2時間インキュベートします。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>T細胞培地の調製 注:100x L-リジンの調製:200 mgのL-リジン塩酸塩を50 mLの蒸留水に50 mLの遠心分離チューブで溶解します。0.2 μmシリンジフィルターを使用して溶液を滅菌し、50 mL灌流シリンジを使用して新しい50 mLチューブに移します。溶液を4〜8°Cで保存し、3か月以内に使用してください。15 mM L-アルギニンの調製:26 mgのL-アルギニンを10 mLのDPBSに溶解します。0.2 μmシリンジフィルターを使用して溶液を滅菌し、10 mLシリンジを使用して新しいチューブに移します。溶液を4〜8°Cで保存し、3か月以内に使用してください。<ol>
		<li>ステップ1.5で述べた遠心分離時間を使用して、T細胞培地を調製します。</li>
		<li>予想されるT細胞の量に応じて、約10〜30mLのT細胞培地を調製します。</li>
		<li>L-アルギニンおよびL-リジンを含まないRPMI培地を、10%熱不活化FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、1%L-アルギニン、1%L-リジン、1%L-グルタミンと混合します。例:RPMI培地25.8mL+FBS3mL+ペン/連鎖球菌0.3mL+L-アルギニン0.3mL+L-リジン0.3mL+L-グルタミン0.3mL。</li>
		<li>残りの培地を次の2日間4°Cで保存し、4日目(共培養開始)に使用します。実験全体の新しい実行ごとに、新鮮な培地を調製することをお勧めします。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PBMCアイソレーション<ol>
		<li>遠心分離後(ステップ3.1.5)、上清を4つの新しい50 mL遠心分離チューブに移し、使用済みのチューブを廃棄します。</li>
		<li>遠心分離チューブを最大50mLにPBS + 2% FBSで満たします。</li>
		<li>300 x g で8分間、室温で遠心分離します。</li>
		<li><li><li></li><li><li><li></ol></li><li> <ol><li></li><li> </li><li></li><li></li><li></li><li><li><li><li><li></li><li><li> </li><li></ol></li><li><ol><li></li><li><li></li><li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li><li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li></li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li></li></ol></li></ol><ol><li><li><ol><li><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li></ol></li><li><ol><li><li><li></li><li></li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></li><li> </li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li> </li><li> </li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig03large.jpg" target="_blank"></a>

<ol><li>Hiam-Galvez, K. J., Allen, B. M., Spitzer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+immunity+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Systemic immunity in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 21 (6), 345-359 (2021).</li>
<li>Mantovani, A., Allavena, P., Marchesi, F., Garlanda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+as+tools+and+targets+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Macrophages as tools and targets in cancer therapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (11), 799-820 (2022).</li>
<li>Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+cancer+immunotherapy%3A+From+t+cell+basic+science+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">A guide to cancer immunotherapy: From t cell basic science to clinical practice.</a> Nat Rev Immunol. 20 (11), 651-668 (2020).</li>
<li>Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunobiology+of+cancer+immunosurveillance+and+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting.</a> Immunity. 21 (2), 137-148 (2004).</li>
<li>Mittal, D., Gubin, M. M., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+cancer+immunoediting+and+its+three+component+phases--elimination%2C+equilibrium+and+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">New insights into cancer immunoediting and its three component phases--elimination, equilibrium and escape.</a> Curr Opin Immunol. 27, 6-25 (2014).</li>
<li>Irianto, T., Gaipl, U. S., Ruckert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+modulation+during+anti-cancer+radio%28immuno%29therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immune modulation during anti-cancer radio(immuno)therapy.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 382, 239-277 (2024).</li>
<li>Burtness, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+alone+or+with+chemotherapy+versus+cetuximab+with+chemotherapy+for+recurrent+or+metastatic+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck+%28keynote-048%29%3A+A+randomized%2C+open-label%2C+phase+3+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab alone or with chemotherapy versus cetuximab with chemotherapy for recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (keynote-048): A randomized, open-label, phase 3 study.</a> Lancet. 394 (10212), 1915-1928 (2019).</li>
<li>Hecht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+single+cycle+induction+treatment+with+cisplatin%2Fdocetaxel%2F+durvalumab%2Ftremelimumab+in+locally+advanced+HNSCC%3A+First+results+of+checkered-CD8%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of single cycle induction treatment with cisplatin/docetaxel/ durvalumab/tremelimumab in locally advanced HNSCC: First results of checkered-CD8.</a> J Immunother Cancer. 8 (2), e001378(2020).</li>
<li>Chen, J. A., Ma, W., Yuan, J., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+biomarkers+and+rationale+strategies+to+overcome+resistance+to+immune+checkpoint+inhibitors+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Translational biomarkers and rationale strategies to overcome resistance to immune checkpoint inhibitors in solid tumors.</a> Cancer Treat Res. 180, 251-279 (2020).</li>
<li>Solomon, B., Young, R. J., Rischin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+Genomics+and+emerging+biomarkers+for+immunomodulatory+cancer+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Head and neck squamous cell carcinoma: Genomics and emerging biomarkers for immunomodulatory cancer treatments.</a> Semin Cancer Biol. 52 (Pt 2), 228-240 (2018).</li>
<li>Meidenbauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+atm+or+atr+in+combination+with+hypo-fractionated+radiotherapy+leads+to+a+different+immunophenotype+on+transcript+and+protein+level+in+HNSCC%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of atm or atr in combination with hypo-fractionated radiotherapy leads to a different immunophenotype on transcript and protein level in HNSCC.</a> Front Oncol. 14, 1460150(2024).</li>
<li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of radiotherapy.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 8151(2020).</li>
<li>Wimmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypofractionated+radiotherapy+upregulates+several+immune+checkpoint+molecules+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells+independently+of+the+HPV+status+while+icos-l+is+upregulated+only+on+HPV-positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Hypofractionated radiotherapy upregulates several immune checkpoint molecules in head and neck squamous cell carcinoma cells independently of the HPV status while icos-l is upregulated only on HPV-positive cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (17), 9114(2021).</li>
<li>Derer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoradiation+increases+pd-l1+expression+in+certain+melanoma+and+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemoradiation increases pd-l1 expression in certain melanoma and glioblastoma cells.</a> Front Immunol. 7, 610(2016).</li>
<li>Schatz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normofractionated+irradiation+and+not+temozolomide+modulates+the+immunogenic+and+oncogenic+phenotype+of+human+glioblastoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlenther+Onkol%22%5BJournal%5D)">Normofractionated irradiation and not temozolomide modulates the immunogenic and oncogenic phenotype of human glioblastoma cell lines.</a> Strahlenther Onkol. 199 (12), 1140-1151 (2023).</li>
<li>Xu, M. M., Pu, Y., Zhang, Y., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+adaptive+immunity+in+the+efficacy+of+targeted+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of adaptive immunity in the efficacy of targeted cancer therapies.</a> Trends Immunol. 37 (2), 141-153 (2016).</li>
<li>Olivo Pimentel, V., Yaromina, A., Marcus, D., Dubois, L. J., Lambin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+co-culture+assay+to+assess+anti-tumor+cd8%28%2B%29+t+cell+cytotoxicity+via+luminescence+and+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel co-culture assay to assess anti-tumor cd8(+) t cell cytotoxicity via luminescence and multicolor flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 487, 112899(2020).</li>
<li>Kulp, M., Diehl, L., Bonig, H., Marschalek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+primary+human+t+cells+with+leukemia+cells+to+measure+regulatory+t+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Co-culture of primary human t cells with leukemia cells to measure regulatory t cell expansion.</a> STAR Protoc. 3 (3), 101661(2022).</li>
<li>Ruckert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+modulatory+effects+of+radiotherapy+as+basis+for+well-reasoned+radioimmunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlenther+Onkol%22%5BJournal%5D)">Immune modulatory effects of radiotherapy as basis for well-reasoned radioimmunotherapies.</a> Strahlenther Onkol. 194 (6), 509-519 (2018).</li>
<li>Samstein, R. M., Riaz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response+in+immunotherapy+and+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Radiat+Oncol%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response in immunotherapy and radiation.</a> Adv Radiat Oncol. 3 (4), 527-533 (2018).</li>
<li>Meeren, A. V., Bertho, J. M., Vandamme, M., Gaugler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+enhances+il-6+and+il-8+production+by+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation enhances il-6 and il-8 production by human endothelial cells.</a> Mediators Inflamm. 6 (3), 185-193 (1997).</li>
<li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ifn-gamma+upregulates+survivin+and+ifi202+expression+to+induce+survival+and+proliferation+of+tumor-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ifn-gamma upregulates survivin and ifi202 expression to induce survival and proliferation of tumor-specific T cells.</a> PLoS One. 5 (11), e14076(2010).</li>
<li>Saraiva, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+HLA-dr+in+cytotoxic+t+lymphocytes%3A+A+validated+predictive+biomarker+and+a+potential+therapeutic+strategy+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Expression of HLA-dr in cytotoxic t lymphocytes: A validated predictive biomarker and a potential therapeutic strategy in breast cancer.</a> Cancers (Basel). 13 (15), (2021).</li>
<li>Dillon, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr+inhibition+potentiates+the+radiation-induced+inflammatory+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Atr inhibition potentiates the radiation-induced inflammatory tumor microenvironment.</a> Clin Cancer Res. 25 (11), 3392-3403 (2019).</li>
<li>Geiger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Arginine+modulates+T+cell+metabolism+and+enhances+survival+and+anti-tumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">L-Arginine modulates T cell metabolism and enhances survival and anti-tumor activity.</a> Cell. 167 (3), 829-842.e13 (2016).</li>
<li>Rodriguez, P. C., Quiceno, D. G., Ochoa, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Arginine+availability+regulates+t-lymphocyte+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">L-Arginine availability regulates t-lymphocyte cell-cycle progression.</a> Blood. 109 (4), 1568-1573 (2007).</li>
<li>Lozano-Ojalvo, D., López-Fandiño, R., López-Expósito, I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLozano-Ojalvo%2C+D+%22The+impact+of+food+bioactives+on+health%3A+In+vitro+and+ex+vivo+models%22">The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models</a>. Verhoeckx, K., et al. , Springer International Publishing. Cham. 169-180 (2015).</li>
<li>Gronholm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+for+precision+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy.</a> Cancer Res. 81 (12), 3149-3155 (2021).</li>
<li>Perez, C., Gruber, I., Arber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-the-shelf+allogeneic+t+cell+therapies+for+cancer%3A+Opportunities+and+challenges+using+naturally+occurring+%26%2334%3Buniversal%26%2334%3B+donor+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Off-the-shelf allogeneic t cell therapies for cancer: Opportunities and challenges using naturally occurring &#34;universal&#34; donor t cells.</a> Front Immunol. 11, 583716(2020).</li>
<li>Martinez Bedoya, D., Dutoit, D., Migliorini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+car+t+cells%3A+An+alternative+to+overcome+challenges+of+car+t+cell+therapy+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Allogeneic car t cells: An alternative to overcome challenges of car t cell therapy in glioblastoma.</a> Front Immunol. 12, 640082(2021).</li>
<li>Schnellhardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+value+of+FOXP3%2B+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+rectal+cancer+depends+on+immune+phenotypes+defined+by+CD8%2B+cytotoxic+T+cell+density%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The prognostic value of FOXP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in rectal cancer depends on immune phenotypes defined by CD8+ cytotoxic T cell density.</a> Front Immunol. 13, 781222(2022).</li>
<li>Zitvogel, L., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+W+%22Oncoimmunology%3A+A+practical+guide+for+cancer+immunotherapy%22">Oncoimmunology: A practical guide for cancer immunotherapy</a>. , Springer International Publishing. Cham. 23-39 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>15 mL Cellstarチューブ</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cellstarチューブ</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養プレート滅菌、蓋付き</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル細胞培養プレート滅菌、F底、蓋付き</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>AZD0156</td><td>Selleck Chemicals GmbH</td><td>S8375</td><td></td></tr><tr><td>ベルゾセルチブ (VE-822)</td><td>Selleck Chemicals</td> GmbHS7102 <td></td><td></td></tr><tr><td>CASYcups</td><td>OMNI Life Science GmbH &Co KG&nbsp;</td><td>5651794</td><td></td></tr><tr><td>CASYton</td><td>OMNI Life Science GmbH &Co KG&nbsp;</td><td>5651808</td><td></td></tr><tr><td>CD25a、PE-Dazzle594、マウス IgG1</td><td>Biolegend</td><td>356126</td><td></td></tr><tr><td>CD28-UNLB</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>IM1376</td><td></td></tr><tr><td>CD3a、Krome Orange、マウス IgG1</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>B00068</td><td></td></tr><tr><td>CD3e モノクローナル抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td>MA1-10176</td><td></td></tr><tr><td>CD4、APC、マウス抗ヒトマウス IgG1</td><td>BD Pharmingen</td><td>555349</td><td></td></tr><tr><td>CD8 MicroBeads、ヒト</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-045-201</td><td></td></tr><tr><td>CD8a、PerCP-Cy5.5、マウス IgG1</td><td>Biolegend</td><td>300924</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker ディープレッド色素</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック社</td><td>C34565</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>&nbsp;Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (ダルベッコ&急性;s 修正イーグル&急性;s Medium)</td><td>PAN-Biotech GmbH</td><td>P04-02500</td><td></td></tr><tr><td>DxFlex フローサイトメーター (オートローダー付き)</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>C44326、C02846</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二ナトリウム塩二水和物</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior&nbsp;</td><td>&nbsp;メルクKGaA(シグマアルドリッチ)</td><td>S0615-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FBSスーペリア&nbsp;</td><td>&nbsp;メルクKGaA(シグマ・アルドリッチ)&nbsp;</td><td>S0615-100ML</td><td>熱不活化FBSの製造用。56°Cで30分間加熱します。補体タンパク質を不活性化するために混合したC。</td></tr><tr><td>グラフパッドプリズム(バージョン番号9)</td><td>GraphPad</td> <td>Software-HLA-DR</td><td></td></tr><tr><td>, DP, DQ Antibody, anti-ヒト, APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-123-550</td><td></td></tr><tr><td>Kaluza (バージョン番号 2.1)</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>L-アルギニン</td><td>メルク KGaA (シグマ アルドリッチ)</td><td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-リジン モノ塩酸塩</td><td>メルク KGaA (シグマ アルドリッチ)</td><td>L5626-100G</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA 原液</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>MS カラム</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>ノイバウアー改良型計数室</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG&nbsp;</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>D8537-500mL</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>1514-122</td><td></td></tr><tr><td>ROTISep 1077</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 ミディアム</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>R1790</td><td></td></tr><tr><td>SepMate 50mL チューブ</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>T6146-25G</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>15400054</td><td></td></tr></tbody></table>

前処理腫瘍細胞の同種共培養環境におけるヒトt細胞活性の解析

Analysis of Human T Cell Activity in an Allogeneic Co-Culture Setting of Pre-Treated Tumor Cells

HNSCCに由来するHSC4腫瘍細胞を播種し、一晩インキュベートしました。24時間後、細胞をキナーゼ阻害剤で処理した。3時間後、画分あたり5Gyの最初の2回の投与を適用した。24時間後、2回目の投与を適用し、細胞を再び一晩インキュベートした。並行して、共培養開始の48時間前に、健康なドナーの血液からT細胞を単離した。まず、密度勾配遠心分離チューブと滅菌分離培地を使用してPBMCを単離しました。PBMCは細胞計数チャンバーを使用してカウントし、CD8+ T細胞はCD8+ T細胞単離キットを使用して単離しました。次に、単離されたCD8+ T細胞をCFSE(1 μM)で染色し、その後カウントしました。T細胞は、密度1.5 x 106 細胞/3 mLのCD3/CD28プレコートウェルプレートに播種しました。48時間の刺激後、T細胞を回収し、カウントし、10,000細胞/10μLの密度で再懸濁した。T細胞を腫瘍細胞に1:1の比率で添加した。共培養物を96時間後に回収し、上清を-20°Cで保存し、細胞を染色し、フローサイトメトリーで測定しました(図1)。
T細胞は、サイズ排除およびCD3/CD8陽性によって同定された。CD3+/CD8+陽性細胞のCFSEシグナルは、非増殖性T細胞の分布(高CFSEシグナル)と増殖性T細胞の異なる亜集団(CFSEシグナル強度の喪失)を示しました。増殖するT細胞の割合を、HSC4 HNSCC細胞株について例示的に測定しました(図4A)。少なくとも1つの分裂を示したすべてのT細胞を「増殖性」と定義しました。3回以上の分裂を示したT細胞は、「高増殖性」と定義されました(図4B)。HPV陰性細胞株HSC4については、T細胞を照射した腫瘍細胞と共培養すると、増殖速度のわずかな増加が認められました。RTおよびRTとATRの阻害の併用は、T細胞とRTとATMの阻害を併用したHSC4細胞の共培養と比較して、連続的なT細胞増殖を有意に増加させました。T細胞の「増殖性の高い」画分に関しては、HSC4細胞をRTで前処理し、さらにATRを阻害することが、T細胞の増殖を刺激するのに最も効果的でした(図4B)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig04v2.jpg"> 
図4:HSC4治療依存性T細胞増殖の変化を解析するためのCFSE染色T細胞の増殖(A)前処理済みHPV陰性HSC4腫瘍細胞との共培養96時間後の増殖T細胞の割合。RT+ATMi処理HSC4腫瘍細胞との共培養後のT細胞増殖は、RTまたはRTとATRiの併用療法と比較して有意に低かった。(B)HSC4腫瘍細胞のRTは、高増殖性T細胞のより高い割合(3つ以上の細胞分裂)を誘導した。RT+ATRi前処理したHSC4腫瘍細胞をT細胞と共培養したところ、増殖性の高いT細胞の割合が最も高かった。バーは、4人の独立した健康なドナー(n = 4;平均±SD)。(*p≤ 0.05, **p≤ 0.01, ***p≤ 0.001, ****p≤ 0.0001; 統計的有意性は、正規分布していないデータに対して両側のマンホイットニーUを使用して、すべての実験条件をそれぞれと比較することによって検定されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig04largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
増殖ベースのCFSE損失は、T細胞の増殖速度を定量化するために使用できます。さらに、CD25およびHLADRなど、いくつかの細胞表面マーカーがT細胞活性と関連していると記載されている。そこで、すべてのCD3+およびCD8+ T細胞の表面上のCD25およびHLA-DRをフローサイトメトリーで解析しました(図5)。この発現は、異なるCD25高 またはHLA-DR高 亜集団が検出され、これらの高陽性細胞をゲーティングすることで識別できる場合に定量化できます(図3B)。明確な部分集団が検出されない場合は、全集団の平均蛍光強度(MFI)を測定し、MFIの状態ベースのシフトを定量化できます(図3C)。
例示的に、CD25およびHLA−DRのMFIによって同定された発現を、前処理したHSC4腫瘍細胞との共培養の96時間後に分析した(図5)。T細胞とRT処理HSC4腫瘍細胞を共培養した後、T細胞上のCD25の発現は強くダウンレギュレーションされました。特に、ATMiのみによる腫瘍細胞の前処理は、ATRiの前処理と比較して、CD25の発現を有意に減少させる結果となりました。RTとの組み合わせでは、RTはT細胞上のCD25の発現を減少させるが、RTとATMiの組み合わせは、RTとATRiの併用と比較してCD25の発現を増加させる結果となった(図5A)。T細胞上でのHLA-DRの発現に関しては、RTは一般にHLA-DRのアップレギュレーションをもたらしましたが、ここでもATMiまたはATRiのいずれかとの組み合わせでは、異なる挙動が観察されました(図5B)。RT+ATRiの組み合わせで前処理したHSC4細胞と共培養したT細胞は、RT単独またはRT+ATMiと比較してHLA-DRの発現を増加させました。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig05v2.jpg"> 
図5:前処理したHSC4腫瘍細胞との共培養96時間後のT細胞表面での活性化マーカーCD25およびHLA-DRの発現。 CD25とHLA-DRの発現は、T細胞集団全体のMFIのシフトに基づいて解析されました。HSC4のRTは、T細胞上のCD25の発現減少とHLA-DRの発現増加をもたらしました。RTとATMiの組み合わせは、RTとATRiの併用と比較して、発現パターンが大きく異なる結果となりました。箱ひげ図は、4人の独立した健康なドナー(n = 4;平均±SD)。データは、正規分布していないデータ(*p≤ 0.050)に対して両側のMann-Whitney-U検定を使用して、すべての実験条件を相互に比較することによって分析されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig05largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
これらのデータは、腫瘍細胞、この場合はHSC4 HNSCC細胞の治療が腫瘍細胞の免疫原性に影響を与えることを例示しています。これは、腫瘍細胞と事前に刺激されたT細胞との共培養によって監視でき、これにより、適用された腫瘍細胞治療レジームに基づいて、ヒトT細胞に対する多様な増殖挙動と活性化マーカーの発現がもたらされます。

前処理腫瘍細胞の同種共培養環境におけるヒトT細胞活性の解析

Cytotoxic T cells play a key role in the elimination of tumor cells and are, therefore, intensively studied in cancer immunology. The frequency and ...

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前処理腫瘍細胞の同種共培養環境におけるヒトT細胞活性の解析

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