多様な組織微小環境におけるGPCR媒介T細胞局在の研究のための効率的なレトロウイルス形質導入と競合的ホーミング

私たちの研究では、GPCR がさまざまな組織微小環境にわたる免疫細胞の輸送と位置決めにどのような影響を与えるかを調査しています。このプロトコルと他の補完的なプロトコルを使用して、私たちの研究室は、非腸粘膜組織における臓器特異的な化学誘引軸を特定しました。これで、リンパ球が胃、肺、気管、GU路にどのように存在するかがわかりました。私は、個々のGPCRがin vivoでT細胞の動きにどのように影響するかをテストするための効率的で改良された方法を提示しています。私たちは、これらの受容体をT細胞に導入する信頼性の高い方法を開発し、競合するホーミングアッセイで直接並べて比較できるようになりました。GPCRがin vivoでT細胞をどのように誘導するかがわかったので、研究者は受容体の発現を免疫機能にうまく結び付けることができます。これは、基礎免疫学や治療研究の研究者に役立ちます。このアプローチにより、あまり知られていない、または特徴付けられていないGPCRが、T細胞を特定の組織に誘導するのにどのように関与しているかを尋ねることができます。GPCRシグナル伝達を微調整して、がんや自己免疫を治療する方法を学ぶことができます。私たちは、T細胞が治療アプローチのために適切なタイミングで適切な場所に到達するのを助けることができます。

[ナレーター]まず、1日目に、滅菌水で調製した50マイクログラムのポリ-D-リジン溶液で10センチメートルの組織培養プレートを5ミリリットル/ミリリットルでコーティングします。プレートを室温で45分間インキュベートし、次にプレートをカルシウムとマグネシウムを含まない滅菌PBSで2回洗浄して、残留物が残らないようにします。次に、2ミリリットルの0.05%トリプシンと0.5ミリモルのEDTAを摂氏37度で3分間使用して、Plat-E細胞を分離します。トリパンブルー排除アッセイを使用して細胞生存率を確保するには、等量の細胞懸濁液をトリパンブルー溶液と混合します。次に、抗生物質を含まないPlat-E培地で10センチメートルの組織培養ペトリ皿に300万個の生細胞を播種します。2日目に、Plat-E細胞培養上の培地を6.5ミリリットルの還元血清培地に置き換えます。製造元の指示に従ってトランスフェクションミックスを調製します。各プレートについて、45マイクロリットルのリポフェクタミン2000を1つのチューブに210マイクロリットルの還元血清培地と混合し、15マイクログラムのDNAを別のチューブに235マイクロリットルの還元血清培地と混合します。チューブの内容物を3〜4回ピペッティングして結合し、室温で20分間インキュベートして複雑な形成を促進します。次に、混合物をプレートに滴下し、摂氏37度で16時間インキュベートします。次に、T細胞活性化用の24ウェルプレートを抗マウスCD28およびCD3でPBSウェルあたり375マイクロリットルでコーティングします。プレートを摂氏4度で一晩、または摂氏4度に設定したインキュベーターで3〜4時間インキュベートします。3日目に、シリンジプランジャーを使用して、RPMI培地を含む6ウェルプレートに入れられた100マイクロメートルのナイロンメッシュセルストレーナーで単離されたマウス脾臓を穏やかにつぶします。細胞懸濁液を40マイクロメートルのナイロンメッシュ細胞ストレーナーを通して50ミリリットルの円錐形チューブに移し、単一細胞懸濁液を得る。溶液を450gで摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、カルシウムとマグネシウムを含まないPBSで細胞を洗浄します。次に、製造元の指示に従って、マウスT細胞CD4分離キットを使用して磁気ネガティブセレクションを実行します。細胞カウンターを使用して単離されたT細胞をカウントします。1ミリリットルのRPMI10培地にウェルあたり1〜150万個の細胞の密度で、コーティングされたT細胞活性化ウェルのT細胞をプレーティングします。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素とともに加湿インキュベーターで24〜48時間インキュベートします。4日目に、約12ミリリットルのウイルス上清を10センチメートルのプレートから円錐形のチューブに集めます。Plat-E培養プレートの培地を10ミリリットルの抗生物質を含まないPlat-E培地に交換して、翌日の2回目の形質導入のためにより多くのウイルス上清を生成します。収集したウイルス上清をろ過するには、0.45マイクロメートルのシリンジフィルターに通します。ろ過した上清に、1ミリリットルあたり8マイクログラムのポリブレンと1〜100希釈のHEPESバッファーを加えます。24ウェルT細胞プレートを950gで7分間回転させます。次に、T細胞を外すことなく上清を慎重に収集して保存します。感染を行うには、各ウェルに1ミリリットルのウイルス上清を加えます。プレートをラップで密封し、1,150gで32°Cで4時間回転させます。感染後、各ウェルの培地を以前に保存したT細胞上清に慎重に交換します。6日目に、プレートからT細胞を円錐形のチューブと遠心分離機に集めます。カルシウムとマグネシウムを含むPBSでペレットを洗浄します。マウスインターロイキン-2ミリリットルあたり130単位、マウスインターロイキン-7ミリリットルあたり10ナノグラムを含む新しい培養プレートに細胞を移します。細胞を少なくとも2日間、または注射に必要な細胞の数に基づいて所望の増殖レベルに達するまでインキュベートします。8日目に、摂氏4度で450gで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。15ミリリットルのチューブに5ミリリットルのヒストパケ-1077を加えます。T細胞ペレットをカルシウムとマグネシウムを含む5ミリリットルのPBSに再懸濁します。遠心分離管内の5ミリリットルのHistopaque-1077の上に細胞懸濁液を慎重に重ねます。サンプルを室温で400〜500gで20分間遠心分離し、遠心分離機の破断または加速が0に設定されていることを確認します。遠心分離後、異なる細胞層の形成を観察します。他の層との汚染を避けながら、目的の細胞を含む界面層をピペットを使用して慎重に収集します。GPR25形質導入T細胞は、スタッファー形質導入対照と比較してhCXCL17およびmCXCL17への移動が増強され、機能的受容体の発現が検証されました。GPR25は、泌尿生殖器、胃、気管などの非腸粘膜組織に優先的に局在する形質導入細胞であり、注射後7週間で有意な濃縮が観察されましたが、注射後1週間では観察されませんでした。短期ホーミングアッセイでは、GPR25が気管、胃、舌、胆嚢、子宮粘膜などのCxcl17に富む臓器に優先的に定着したT細胞を形質導入し、Cxcl17欠損マウスには蓄積しなかったことが示されました。GPR25形質導入細胞は主に気管支に局在していましたが、対照細胞は静脈の近くでより頻繁に見られました。