頭蓋窓を介して新皮質の血流の2光子イメージングのための方法
2008年2月25日
皮質血流のダイナミクスは、2光子顕微鏡による齧歯類の尾静脈に注射イメージング蛍光デキストランの色素によってin vivoで研究することができます。このビデオでは、どのようにガラスで覆われた頭蓋窓の準備を通じて、マウスの新皮質における画像の血流動態に表示されます。
生きているげっ歯類の無傷の脳内の脳血管系を画像化し、血流のダイナミクスを記録する能力は、脳虚血または正常な脳生理学の研究に適用できる強力な技術です。ここでは、2つの光顕微鏡を使用して、尾静脈に注入された蛍光色素を使用して、生きたマウスの新皮質の血流動態を画像化する方法を示します。この手法は、もともと David Kleinfeld によって Winfred Dank で開発されました。
こんにちは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校神経学部のカルロス・ポーター・カヨ研究室のリカルド・モタです。前回のビデオでは、in vivoでの慢性イメージング実験のために頭蓋窓を埋め込む方法を紹介しました。今日は、頭蓋窓を通じて大脳皮質の血流ダイナミクスをイメージングする手順をお見せします。
この調製物は、光子レーザー顕微鏡を使用して脳の深部を画像化できるため、非常に便利です。それでは始めましょう。脳血管系を画像化するためには、動物に蛍光色素を静脈内注射する必要があります。
デクストロンのモティが染料が血液脳関門を通過して血管から漏れるのを防ぐため、デクスター共役染料を使用しています。マウスは、誘導のために4%、注射中に1.5〜2%のisofフッ素で麻酔されます。次に、尾部を26ゲージの針で70%アルコールの3本の綿棒で消毒し、生理食塩水に溶解したRドミンデキストランの5%溶液の75〜100マイクロリットルを尾静脈から注入します。
尾のシャフトの途中の動物は、尾静脈注射の直後にダイが尿中に排泄されるまで画像化され、EROドミン色素を使用するとピンク色に変わります蛍光デクスター色素注射の約2時間後に、マウスをイソフッ素で麻酔します。繰り返しになりますが、誘導の場合は4%、イメージングの場合は1〜1.5%です。マウスは、動物を暖かく保つための温度調節された加熱パッドを含む顕微鏡ステージにチタンバーを使用してしっかりと取り付けられています。
目を潤すために、いくつかの目の軟膏が塗られます。頭蓋窓のカバーガラスは70%アルコールで洗浄されています。ウィンドウは焦点面と平行に配置され、視野の中央に配置されます。
4倍対物レンズの下では、デジタルカメラで脳表面血管の写真を撮るのが最善です。この画像は、その後のイメージングセッションで参照画像として使用され、日々繰り返し画像領域を見つけます。その後、4 x 対物レンズは水浸 40 x 対物レンズに置き換えられます。
ステージを動かさずに、景色のデジタル写真が撮影されます。ここでも、ステージ マニピュレーターの座標は 0 に設定されます。画像取得ソフトウェアとしてスキャン画像を使用します。
これは、Carls Voto の研究室で Tom Paul Rudo と Bernardo Sabatini によって MATLAB で記述されました。次に、レーザー、パワーメーター、光電子増倍管、アンプなど、他のすべての機器の電源を入れます。画像化に適したウィンドウの領域を低倍率で短時間スキャンして、最適な領域を見つけます。
これらが特定されると、画像化する選択した領域の低倍率スタックが取得され、そのXY座標に注釈が付けられます 小さな血管または毛細血管の血流ダイナミクスを記録する。対象血管の少なくとも40ミクロンに沿ってラインスキャンを使用します。これらの1秒間の1回のスイープは、できるだけ少ないレーザーパワーで行われ、スキャンの座標と角度が書き留められます。
イメージングセッションが終了すると、動物は麻酔から回復できる暖かいチャンバーに移されます。ここでは、尾静脈からr Domineデキストランを注射した生後5か月齢のマウスの体性感覚皮質の上に置かれた頭蓋窓を通して、2光子顕微鏡で5ミクロンごとに撮影された100枚の画像のスタックを示します。この一連の画像は、毛細血管を含む大小の血管の複雑なネットワークを示しています。
頭蓋窓を通じて生体内の血流動態を可視化する方法をお見せしました。これは、脳卒中後の血流の変化を調べるために、皮質血管系内の脳血流動態をイメージングするための非常に強力な方法です。蛍光色素の尾静脈注入を繰り返すことにより、BULでさまざまな時間に複数の想像力を働かせることができます。
この手順を行うときは、可能な限り清潔で無菌的な条件で作業すること、そして非常に安定した手を持つことを覚えておくことが重要です。さて、これで完了です。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
このビデオでは、二光子顕微鏡を用いて生きているマウスのneocortexにおける血流ダイナミクスのイメージング技術を紹介します。蛍光性デキストラン染料を尾静脈に注入し、脳血管の生体内観察を可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 血管イメージング
- 生体内技術
背景
- 脳血流のイメージングは、脳の生理学を理解する上で重要です。
- この技術は脳虚血の研究に適用できます。
- 二光子顕微鏡は血流ダイナミクスの詳細なイメージングを可能にします。
- 蛍光性染料は血管の可視化にコントラストを提供します。
研究の目的
- neocortexにおける血流ダイナミクスのイメージングを実証すること。
- 慢性イメージングのための頭蓋窓の使用を紹介すること。
- この技術に興味を持つ研究者に視覚的なガイドを提供すること。
使用された方法
- マウスの尾静脈への蛍光性デキストラン染料の注入。
- イメージングのための二光子顕微鏡の使用。
- neocortexへのアクセスのためのガラス被覆頭蓋窓の準備。
- 生きているげっ歯類における血流ダイナミクスの生体内イメージング。
主要な結果
- neocortexにおける血流ダイナミクスの成功的な可視化。
- 頭蓋窓の準備の有効性の実証。
- イメージングにおける蛍光性染料の応用の説明。
- 脳血管と血流調節に関する洞察。
結論
- この技術は脳の生理学に関する貴重な洞察を提供します。
- 脳血流に関わる様々な研究に適用できます。
- この方法は脳虚血および関連疾患の理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
In vivo 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window enables high-resolution, quantitative assessment of cerebral microvascular dynamics in living rodents. This capability is critical for mechanistic de-risking and target validation in neurovascular and neurodegenerative disease research pipelines. The method supports predictive confidence at early discovery and preclinical inflection points, informing portfolio decisions for CNS-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of vascular responses to experimental perturbations in disease-relevant brain regions.
- Supports functional target validation by quantifying blood flow changes in response to candidate interventions.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking molecular targets to physiological vascular outcomes.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vivo system for quantitative measurement of blood flow dynamics.
- Enables reproducible imaging of the same cortical region across multiple sessions for longitudinal studies.
- Supports assay standardization through controlled dye administration and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling measurement of vascular function in models of stroke, neurodegeneration, and brain tumors.
- Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by providing quantitative endpoints relevant to human disease.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling robust, physiologically relevant readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a bridge between molecular target identification and functional validation in living systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on neurovascular mechanisms and target engagement.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible blood flow measurements for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of blood flow parameters across experimental groups and timepoints.
- Translational Research: Provides endpoints aligned with clinical imaging biomarkers of cerebral perfusion.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse CNS vascular studies across therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurovascular research.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions with quantitative, physiologically relevant data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in small animal surgery, in vivo imaging, and quantitative analysis.
- Demands access to 2-photon microscopy, image acquisition software, and animal support infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of dye preparation, injection, and imaging protocols.
- Adaptation to other rodent models or brain regions may require protocol optimization.
- Imaging depth and dye clearance kinetics may limit applicability for certain experimental designs.
