Name: 頭蓋窓を介して新皮質の血流の2光子イメージングのための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-25T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: 学ぶ マウスの新皮質における血流ダイナミクスの2光子顕微鏡イメージング法。蛍光デキストラン染料を尾静脈に投与し、頭蓋窓を介して脳血管の生体内観察を行います。脳虚血や正常な脳生理学の研究に応用可能です。

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蛍光デキストランの色素の尾静脈に注射<ol><li>イメージ脳血管系への順序で、動物が蛍光色素を静脈内注射する必要があります。デキストランの部分は、脳血液関門を通過し、血管外に漏れるの染料を防止するため我々は、デキストランコンジュゲート色素を使用してください。 </li><li>マウスは、（誘導4％、注入時の1.5から2パーセント）イソフルランで麻酔する。 </li><li>尾は70％アルコールで消毒されています。 </li><li> 26ゲージの針で、生理食塩水に溶解したローダミンデキストランの5％v / v溶液の75〜100μlを尾のシャフトの途中、尾静脈を介して注入される。 </li><li>染料は、約2時間でローダミン染料を使用している場合はピンクオンになります尿に排泄されるまで、動物は、尾静脈注射後すぐに画像化されることがあります。 </li></ol>二光子顕微鏡を用いて血流のイメージング（画像化船の数に応じて継続時間の合計、セッションごとに30〜60分間、） <ol><li>蛍光デキストラン色素の注入に続いて、マウスが（誘導のための4％、イメージングのための1から1.5パーセント）イソフルランで麻酔です。 </li><li>マウスは、しっかりと動物を暖かく保つために熱安定化加熱パッドが含まれている顕微鏡のステージにチタン棒を、使用して接続されます。いくつかの眼軟膏は、目の潤いを保つために適用されます。 </li><li>頭蓋窓のカバーガラスを70％アルコールで洗浄される。 </li><li>ウィンドウは、焦点面に平行に配置し、4X目的で視野の中央に置かれます。 </li><li>デジタルカメラで脳表面の血管の写真を撮影するのが最善です。この写真は、日ごとに繰り返し画像形成された領域を検索するには、次のイメージングセッションで基準の画像として使用されます。 </li><li> 4X目的は、ステージを移動することなく、水浸40倍目標に置き換えられます。ビューのフィールドのデジタル画像が再び取得されます。ステージマニピュレータの座標がゼロに設定されています。 </li><li>我々は、画像取得ソフトウェアとしてscanimageを使用してください。これは、カレルヴォ（Pologrutoら、2003）の研究室でトムPologrutoとベルナルドサバティーニことで、MATLABで書かれています。レーザー、パワーメータ、フォトマルチプライヤチューブ、アンプ、など：私たちは、次のすべての他の機器の電源をオンに</li><li>撮像する適当なウィンドウの領域を簡単に最適な領域を見つけるために、低倍率でスキャンされます。一度これらは、画像が撮影さまでした地域の低倍率のスタックを同定し、そのXY座標は、アノテートされます。 </li><li>小血管や毛細血管の血流動態を記録するために我々は、関心の血管の少なくとも40ミクロ​​ンに沿ってラインスキャンを使用してください。これらのシングル&quot;スイープ&quot;持続的な一秒を少しレーザーの可能​​な限り消費電力とスキャンの座標と角度がダウン書かれているとして使用して行われます。 </li><li>イメージングセッションが終了すると、動物はそれが麻酔から回復できる暖かい部屋に移動されます。 </li></ol>

<ol><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Eng.+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).</li>
<li>Zhang, S., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+impact+of+cortical+microcirculation+on+synaptic+structure+and+sensory-evoked+hemodynamic+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo.</a> 5, (2007).</li>
<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).</li>
</ol>

皮質血流のダイナミクスは、二光子顕微鏡による齧歯類の尾静脈に注射イメージング蛍光デキストランの色素によってin vivoで研究することができます。このビデオでは、どのようにガラスで覆われた頭蓋窓の準備を通じて、マウスの新皮質における画像の血流動態にするための方法を示した。

<table><tbody><tr><td>フルオレセインイソチオシアネートデキストラン</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD500S</td><td>分子量 500,000</td></tr><tr><td>ローダミンBイソチオシアネートデキストラン</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379</td><td>分子量 ~70,000</td></tr></tbody></table>

頭蓋窓を介して新皮質の血流の2光子イメージングのための方法

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

生きているげっ歯類の無傷の脳内イメージを脳血管系を（大血管から毛細血管まで）と、レコードの血流の力学への能力は強力な手法です。頭蓋窓を通して、生体内での2光子顕微鏡を使用して、それは、静脈内に注射画像蛍光色素に可能です。これは、画像皮質血管系を、また、血流の測定値を得るために1つが許可されます。この技術は当初、David K​​leinfeldとヴィンフリートデンクによって開発されました。方法は、神経変性疾患で、脳の腫瘍に、または正常な脳生理学では、脳虚血中または後に血流のダイナミクスを研究するために使用することができます。例えば、それはどのように脳卒中の原因の血流の方向の変化と梗塞とその周辺の赤血球速度または磁束の変化を研究するために使用されています。ここでは、尾静脈に注入する蛍光染料を使用して生きているマウスの新皮質での画像の血流動態を2光子顕微鏡を使用する方法を示します。

皮質血流のダイナミクスは、2光子顕微鏡による齧歯類の尾静脈に注射イメージング蛍光デキストランの色素によってin vivoで研究することができます。このビデオでは、どのようにガラスで覆われた頭蓋窓の準備を通じて、マウスの新皮質における画像の血流動態に表示されます。

生存しているげっ歯類の脳において、大血管から毛細血管に至るまでの脳血管系をイメージングし、血流動態を記録できる能力は、...

生存しているげっ歯類の脳において、脳血管をイメージングし血流動態を記録できる能力は、脳虚血や正常な脳生理学の研究に適用可能な強力な手法です。ここでは、尾静脈に注入した蛍光染料を用いて、生存マウスの新皮質における血流動態をイメージングするための二光子顕微鏡の使用方法を実演します。この手法は、もともとDavid KleinfeldとWinfred Dankによって開発されました。こんにちは。カリフォルニア大学ロサンゼルス校、神経学部のCarlos Porter Cayo研究室のRicardo Motaです。前回のビデオでは、in vivoでの慢性的なイメージング実験に向けた頭蓋窓の埋め込み方法をご紹介しました。本日は、頭蓋窓を通じて大脳皮質における血流動態をイメージングする手順について解説します。この作製法は、2光子レーザー顕微鏡を用いて脳の深部をイメージングできるため、非常に有用です。それでは、手順を開始しましょう。脳血管系をイメージングするために、動物に蛍光色素を静脈注射する必要があります。デキストラン結合色素を使用するのは、デキストラン基が色素の血液脳関門の通過および血管外への漏出を防ぐためです。マウスをイソフルランで麻酔し、導入には4%、注入中は1.5〜2%を用います。次に、尾を70%アルコールで3回拭いて消毒し、26ゲージの針を用いて、生理食塩水に溶解した5% Rhodamine Dextran溶液75〜100 µLを尾静脈に注入します。尾のシャフトの中ほどで、尾静脈注射の直後から、色素が尿中に排泄されるまで動物のイメージングが可能です。ERODomine色素を使用した場合、尿はピンク色になります。蛍光Dexter色素の注射から約2時間後、マウスをイソフルランで麻酔します。導入には4％、イメージングには1〜1.5％を用います。マウスはチタンバーを使用して顕微鏡ステージにしっかりと固定します。ステージには、動物の体温を維持するための温度調節機能付き加熱パッドが備わっています。眼を湿潤に保つため、眼軟膏を塗布します。頭蓋窓のカバーガラスを70%アルコールで洗浄します。窓を焦点面と平行に配置し、視野の中心に合わせます。4倍対物レンズを用いて、デジタルカメラで脳表面血管の写真を撮影するのが最適です。この写真は、日々のイメージングセッションにおいて、同一の画像領域を繰り返し特定するための参照画像として使用されます。その後、4倍対物レンズを水浸40倍対物レンズに交換します。ステージを動かさずに、視野のデジタル画像を撮影します。その後、ステージマニピュレーターの座標を再びゼロに設定します。画像取得ソフトウェアにはscan imageを使用します。これは、Carls Votoの研究室にて、Tom Paul RudoとBernardo SabatiniによってMATLABで作成されました。次に、レーザー、パワーメーター、光電子増倍管、アンプなどのその他のすべての装置を起動します。イメージングに適したウィンドウ領域を低倍率で簡潔にスキャンし、最適な領域を特定します。これらを特定した後、撮影対象領域の低倍率スタック画像を取得し、小血管または毛細血管における血流ダイナミクスを記録するためにそのXY座標を注記します。目的の血管に沿って、少なくとも40 µmのラインスキャンを行います。1秒間に1回行うこれらのシングルスイープは、可能な限り低いレーザー出力で実施し、スキャンの座標と角度を記録します。イメージングセッションが終了後、動物を温熱チャンバーに移し、麻酔から回復させます。ここでは、尾静脈からr-dextranを注入した5ヶ月齢のマウスの体性感覚野上に設置した頭蓋窓を通じて、2光子顕微鏡を用いて5 µm間隔で撮影した100枚の画像スタックを示します。この一連の画像には、毛細血管を含む大小さまざまな血管の複雑なネットワークが示されています。私たちは、頭蓋窓を通じて生体内の血流ダイナミクスを可視化する方法を実演しました。これは、皮質血管における脳血流ダイナミクスをイメージングするための非常に強力な手法であり、例えば脳卒中後の血流の変化を調査する場合などに有用です。蛍光色素を尾静脈に繰り返し注入することで、個体ごとに異なる時間経過で複数回のイメージングを行うことが可能です。この手順を行う際は、可能な限り清潔で無菌の状態を保ち、非常に慎重に操作することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

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生物学

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出典:Bisht, K., et al.マウスの神経免疫ダイナミクスの反復in vivoイメージングを実行するための正確な脳マッピング。J. Vis. Exp.

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