Name: 前臨床モデルにおける肺線維症の評価を強化するためのマイクロCTを使用した片側肺活量分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T12:55:00.000+00:00
Duration: 3 min 38 s
Description: 学ぶマイクロCTを用いた片側肺活量解析法。マウス肺線維症モデルで換気領域を定量化し、AI支援セグメンテーションで前臨床介入評価の精度を向上させる革新的アプローチです。

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すべての動物実験は、広州医科大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。実験は、6-8週齢、25-30gの雄C57BL/6マウスで行った。マウスは、食物と水への自由的なアクセスを備えた12時間の明暗サイクル(明暗:25ルクス)の下で飼育され、対照群とBLM群に無作為に割り当てられました。
1. 片側性肺気管内点滴
<ol>
	<li>C57BL/6 雄マウス (6-8 週齢、25-30 g) に 1% ペントバルビタール ナトリウム (50 mg/kg) の腹腔内注射を麻酔します。</li>
	<li>呼吸数と四肢離脱反射を観察することにより、麻酔のレベルを監視します。</li>
	<li>マウスを70°〜90°の角度のプラスチックボードに仰臥位で固定し、切歯と手足で拘束します。</li>
	<li>滅菌された鈍い先端の鉗子を使用して、舌を静かに引っ込めます。</li>
	<li>小動物の喉頭鏡を使用してカスタムの22Gの鈍針を気管に挿入し、喉頭蓋と中咽頭の構造を視覚化します。ボードを反時計回りに-70°回転させて、左のメイン気管支をメイン気管支と平行に合わせます。抵抗が感じられるまで針を進めます。 注:最適な挿入長さを確保するために、同様のサイズの練習用マウスを使用してカテーテルの長さを事前に測定します。</li>
	<li>30°の角度まで素早く回転させ、40μLのブレオマイシン溶液(0.02mg)を注入します。針を外します。</li>
	<li>マウスを少なくとも30秒間所定の位置に保持して、適切な薬物分布を確保します。.</li>
	<li>マウスが温暖化ブランケットの上でうつ伏せに回復するのを待ちます。</li>
</ol>
2. マイクロCT(Micro-CT)スキャニング
注:マウスは、製造元の指示に従ってマイクロCTシステムを使用してスキャンされました。
<ol>
	<li>ブレオマイシン注入後3週間、マウスにマイクロCTスキャンを行います。</li>
	<li>小動物用ガス麻酔器の気化器に適量のイソフルランを追加し、気化器の電源を入れ、誘導濃度を3%に調整し、マウスを誘導ボックスに入れます。</li>
	<li>誘導ボックスからマウスを取り出し、スキャンテーブルに仰向けにして置き、マウスの手足を伸ばし、体を正中線に沿って整列させます。</li>
	<li>スキャンテーブルのイソフルラン維持濃度を1%に設定します。</li>
	<li>Micro-CTスキャンモードを設定します:横視野43 mm、解像度2K x 2K、ピクセルサイズ0.042 mm、スライス厚さ0.042 mm。</li>
	<li>スキャン後、マウスが目覚めるまでマウスを暖かい毛布の上に置きます。</li>
</ol>
3. マイクロCT後処理:片側選択的肺セグメンテーションと容積解析
注:画像処理と定量分析は、製造元の指示に従って、無料のオープンソースソフトウェア3Dスライサー(http://www.slicer.org)を使用して実行されました。肺窓の臨床ハウンズフィールド単位 (HU) 範囲を適用して HU 画像を正規化し、以前に報告された 8,9,11 のように、肺実質を正常通気領域 ([-1000、-350] HU) に分割しました。画像処理手順の概要は次のとおりです。
<ol>
	<li>3D スライサーを開きます。操作インターフェースを 図 1 に示します。</li>
	<li>[ロード]をクリックして、イメージングデータをDICOM形式でインポートします。軸方向、冠状、および矢状方向の画像がメインインターフェースに表示されます(図2)。</li>
	<li>図3に示すように、矢状ビューに関連するパラメータを調整します(オプション)。(1:非表示のオプションを表示する、2:現在のボリュームの名前を変更する、3:新しい名前を入力)。</li>
	<li>Segment Editorモジュールで、Add(追加)をクリックして、選択的肺分析(右肺)のセグメンテーションを作成します(図4)(1:ボリューム、2:セグメントエディタ、3:セグメントの追加、4:しきい値の設定、5:しきい値範囲の調整、6:マスキングに使用、7:球体ブラシの設定)。</li>
	<li>しきい値の範囲を [-1000, -350] HU に調整し、[ マスキングに使用 ] オプションを有効にします。</li>
	<li>ペイント ツールと球体ブラシを使用して、目的の肺領域をセグメント化します。</li>
	<li>アイランドツールを選択し、選択したアイランドを保持を選択します。右肺を強調表示し、[Show 3D]をクリックして、視覚化パネルに3Dモデルを表示します(図5)(1:島(接続されたコンポーネント)の編集、2:[選択した島を保持]の選択、3:3Dモデルの表示)。</li>
	<li>用語パネルで、3Dモデルの色を青に変更します(オプション)。</li>
	<li>左肺について手順3.4〜3.6を繰り返します。軸性胸部CT画像をレイヤーごとに処理して、人工呼吸器の左肺容積を計算し、3Dモデルを作成します(図6)。</li>
	<li>3D左肺モデルの色を黄色に変更します(オプション)。</li>
	<li>右肺セグメンテーションの不透明度を 0.2 に設定します。</li>
	<li>必要に応じて3Dモデルをエクスポートします(図7)。</li>
	<li>3Dビューのスクリーンショットをキャプチャするか、画像をスライスして保存します(図8)(1:注釈スクリーンショット、2:画像の形式を選択、3:保存パスを変更します)。</li>
	<li>Segment Statisticsモジュールを使用して、各セグメントの肺活量(mm3)を計算し、正常通気領域の定量分析を実行します(図9)。</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig01.jpg"> 
図1:3Dスライサーソフトウェアのインターフェース。 この図は、3Dスライサーソフトウェアの主な操作インターフェースを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig02.jpg"> 
図2:マウスの片側気管内注入によって誘発された肺線維症のCT画像。 軸方向、冠状、矢状面のビュー、およびブレオマイシン点滴後の 3D 肺再建。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig03.jpg"> 
図3:矢状図のパラメータ調整。 この図は、パラメータの調整を示しており、正確な視覚化と分析を可能にします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig04.jpg"> 
図4:セグメンテーション編集とパラメータ調整 この図は、セグメンテーション編集のプロセスと対応するパラメーターの調整を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig05.jpg"> 
図5:右肺の3Dセグメンテーション。 このプロセスには、肺セグメンテーションの接続されたコンポーネントの編集(ステップ1)、右肺を分離するための 選択 島の選択(ステップ2)、視覚化パネルでモデルをレンダリングするための 3Dの表示 (ステップ3)の3つの連続したステップが含まれます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig06.jpg"> 
図6:マイクロCT解析に基づく左肺の3D再構成。 軸性胸部CT画像をレイヤーごとに処理して、曝気領域をセグメント化し、換気量を定量化し、3Dモデルを再構築しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig07.jpg"> 
図7:片側性肺線維症モデルにおける換気肺量のマイクロCT分析に基づく3D肺再建。 再構築されたモデルは、指定された形式で事前定義されたディレクトリにエクスポートされました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig08.jpg"> 
図8:画像保存のガイド この図は、 Annotation Screenshot メニューからの保存機能の開始から、形式の選択と保存パスの定義まで、画像を保存するための一連の手順の概要を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig09.jpg"> 
図9:片側性肺線維症モデルにおけるマイクロCTに基づく統計解析。 ノルモエアレーション領域から得られた定量的データを分析しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
4. マッソンのトリコーム染色
<ol>
	<li>肺サンプルを4%パラホルムアルデヒドで室温(RT)で一晩固定し、等級別エタノールシリーズを使用して脱水し、パラフィンに包埋します。ロータリーミクロトームで厚さ5μmのスライスを調製します。</li>
	<li>Massonのトリクローム染色を切片に対して以下のように行います。<ol>
		<li>脱パラフィン化および再水和した切片を蒸留水ですすぎ、続いて予熱したBouin Fluidで56〜60°Cで1時間またはRTで一晩媒染剤処理を行います。</li>
		<li>洗浄後、切片をヴァイゲルトの鉄ヘマトキシリン溶液で10分間染色し、流水で10分間すすぎ、ビーブリッヒ緋色酸フクシン溶液に10〜15分間浸します。</li>
		<li>ホスホモリブディ-リンタングステン酸溶液を使用して10〜15分間分化し、コラーゲンに富む領域が赤から透明に遷移するまでモニターします。</li>
		<li>次に、スライドをアニリンブルー溶液に直接5〜10分間移し、蒸留水ですすぎ、1%酢酸溶液で2〜5分間分化します。</li>
		<li>等級付けされたエタノール(95%から無水アルコール)による脱水とキシレンの清澄化の後、切片を樹脂状媒体で取り付けます。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Massonのトリクローム染色機械学習解析
<ol>
	<li>Massonのトリクローム染色を使用して、コントロール肺およびブレオマイシン治療肺のコラーゲン組成分析を組織病理学的に評価します。</li>
	<li>観察者に依存するバイアスを減らすには、ホールスライドイメージスキャナーを使用して、染色された肺切片の高解像度デジタル画像を取得します。</li>
	<li>次いで、自動ソフトウェア軌道画像解析8,9,12を用いてコラーゲン領域を定量的に解析する。トレーニングプロセスについて、以下で簡単に説明します。<ol>
		<li>各組織カテゴリー(コラーゲン、正常組織、線維性組織など)の代表的なアノテーションをいくつか手動で描きます。注釈付き学習領域から抽出されたピクセル単位の特徴を使用して、サポート ベクター マシン (SVM) の学習セットを構築します。</li>
		<li>Masson染色切片の場合、組織分類をコラーゲン、正常組織、バックグラウンドの3つのカテゴリーに定義します。 注:機械学習モデルは、病理医が検証した評価によって正確な組織分類が確認されるまで、注釈付けと改良を繰り返すことにより、ホールスライド画像(WSI)の反復トレーニングを受けます。満足のいく分類精度が達成されると、プロセスは完全に自動化され、有効な関心領域(ROI)内の各ピクセルから特徴が抽出され、その後、SVMは対応する組織カテゴリーを高精度で予測します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Podolanczuk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+pulmonary+fibrosis%3A+state+of+the+art+for+2023%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Idiopathic pulmonary fibrosis: state of the art for 2023.</a> Eur Respir J. 61 (4), 2200957(2023).</li>
<li>Raghu, G., Selman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nintedanib+and+pirfenidone%3A+new+antifibrotic+treatments+indicated+for+idiopathic+pulmonary+fibrosis+offer+hopes+and+raises+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Nintedanib and pirfenidone: new antifibrotic treatments indicated for idiopathic pulmonary fibrosis offer hopes and raises questions.</a> Am J Respir Crit Care Med. 191 (3), 252-254 (2015).</li>
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<li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+fibroblast+activation+protein+expression+in+interstitial+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of fibroblast activation protein expression in interstitial lung diseases.</a> Am J Respir Crit Care Med. 207 (2), 160-172 (2023).</li>
<li>Liu, T., De Los, S. F., Phan, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bleomycin+model+of+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The bleomycin model of pulmonary fibrosis.</a> Methods Mol Biol. 1627, 27-42 (2017).</li>
<li>Ruscitti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+assessment+of+bleomycin-induced+lung+fibrosis+by+micro-CT+correlates+with+histological+evaluation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Multidiscip+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by micro-CT correlates with histological evaluation in mice.</a> Multidiscip Respir Med. 12, 8(2017).</li>
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<li>Ferrini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+anesthesia+protocol+enabling+longitudinal+lungfunction+measurements+in+neonatal+rabbits+by+microCT%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">A new anesthesia protocol enabling longitudinal lungfunction measurements in neonatal rabbits by microCT.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (6), L1206-L1214 (2021).</li>
<li>Jensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+whole+body+preclinical+microCT+database+of+subcutaneous+tumors+in+mice+with+annotations+from+3+annotators%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">3D whole body preclinical microCT database of subcutaneous tumors in mice with annotations from 3 annotators.</a> Sci Data. 11 (1), 1021(2024).</li>
<li>Lai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+longitudinal+and+regional+analysis+of+bleomycininduced+pulmonary+fibrosis+in+mice+by+microcomputed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">The longitudinal and regional analysis of bleomycininduced pulmonary fibrosis in mice by microcomputed tomography.</a> Heliyon. 9 (5), e15681(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.9%生理食塩水</td><td>ホープバイオ</td><td>HBPP008-100</td><td></td></tr><tr><td>22G鈍針</td><td>BDの</td><td>383922</td><td></td></tr><tr><td>3Dスライサー&nbsp;画像コンピューティングプラットフォーム</td><td>3Dスライサー&nbsp;</td><td>https://www.slicer.org/</td><td></td></tr><tr><td>ブレオマイシン</td><td>MCEの</td><td>ハイ-17565</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>RWDの</td><td>R510-22</td><td></td></tr><tr><td>マッソンステインキット</td><td>イェン</td><td>60532ES58</td><td></td></tr><tr><td>マイクロCT</td><td>ピンセン</td><td>SNC-100</td><td></td></tr><tr><td>軌道</td><td>軌道画像解析</td><td>https://www.orbit.bio/</td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td>シグマ</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>小動物用喉頭鏡</td><td>Yuyan Instruments(ユヤンインストゥルメンツ)</td><td>CG-02M</td><td></td></tr><tr><td>SPSSの</td><td>アイビーエム</td><td>バージョン19.0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>暖かいブランケット</td><td>ラボアニムテック</td><td>緯度-16-0323</td><td></td></tr></tbody></table>

前臨床モデルにおける肺線維症の評価を強化するためのマイクロctを使用した片側肺活量分析

Unilateral Lung Volume Analysis Using Micro-CT for Enhanced Assessment of Pulmonary Fibrosis in Preclinical Models

図10A-Dは、肺活量の変化と染色分析の結果を示しています。
ブレオマイシン(BLM)が肺組織に及ぼす影響を評価するために、3Dイメージング技術を用いて、生理食塩水治療群(Ctrl)とBLM治療群の肺容積の比較解析を行った。左肺容積の定量化(mm3)は、BLMグループで有意な減少を示しています(図10A、C)。
Massonのトリクローム染色は、肺組織における線維症の特徴であるコラーゲン沈着の程度を評価するために採用されました。定量的な結果では、BLMグループでMasson陽性染色が有意に増加していることが示され、BLMグループがコラーゲンなどの細胞外マトリックスを大量に分泌したことが示されています(図10B、D...

前臨床モデルにおける肺線維症の評価を強化するためのマイクロCTを使用した片側肺活量分析

Pulmonary fibrosis (PF) is a progressive and irreversible interstitial lung disease characterized by poor prognosis and limited treatment options. The ...

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この技術の目的は、肺インフレおよび肺動脈を介した放射線不透明ポリマー系化合物の注入を介した早期出生後および成人マウスの肺動脈ネットワークのex...

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虚血ラットの肺の血管新生

低酸素肺血管収縮(HPV)は、肺胞低酸素肺灌流で換気に一致する重要な生理学的現象である。HPVに寄与する主要な血管セグメントは、口腔内動脈である。ここでは、直径20~100μmのマウス肺血管のHPVの分析プロトコルについて説明します。...

マウス精密切り出肺スライスを用いた低酸素肺血管収縮のビデオモルフォメトリクス解析

学ぶマイクロCTを用いた片側肺活量解析法。マウス肺線維症モデルで換気領域を定量化し、AI支援セグメンテーションで前臨床介入評価の精度を向上させる革新的アプローチです。

前臨床モデルにおける肺線維症の評価を強化するためのマイクロCTを使用した片側肺活量分析

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