生および調理済み鶏肉製品中の サルモネラ菌 を定量するための修正最確数アッセイ

私たちの研究では、実世界の環境で汚染を特定することにより食品の安全性を向上させることができる高感度な方法に焦点を当てて、食品媒介病原体の迅速な検出、定量化、および特性評価技術を開発しています。主な課題には、高感度の迅速な検出と複雑なマトリックスを低コストでありながらスケーラブルなソリューションで実現することが含まれます。また、誤検知を減らし、多様なテスト環境との互換性を向上させることの難しさにも対処します。

食品の安全性のために、これはさまざまな食品マトリックス中の低濃度の病原体を正確に検出することを意味します。当社のプロトコルは、サルモネラ菌の有病率検出と定量化の間のギャップに対処し、食品の汚染レベルに決定論的な値を提供します。このプロセスには、FSISプロトコルで使用される検証済みのアッセイが組み込まれており、追加の病原体や食品マトリックスに対応するのに十分な柔軟性があるため、混乱が最小限に抑えられます。

まず、地元の小売店の生肉部門から購入した鶏ひき肉を作業プラットフォームに置きます。肉を無菌的に25グラムのサンプルに分割します。地元の小売店の冷凍食品セクションから調理可能な鶏肉製品を入手し、それらを無菌的に25グラムのサンプルに分割します。

脳の心臓注入オーガープレート上の縞サルモネラenterica serovar Typhimurium ATCC 14028。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、25ミリリットルの脳心臓注入ブロスに、新たに栽培したサルモネラ菌のコロニーを1つ接種します。

好気的に培養物を摂氏37度で一晩中成長させ、100RPMで振とうします。一連の10倍希釈液を調製するには、0.5ミリリットルの培養物を4.5ミリリットルの緩衝ペプチド水またはBPWに移し、十分に混合します。次に、準備した希釈液から0.5ミリリットルを、その後の希釈ごとに4.5ミリリットルのBPWに移します。

次に、照射した25グラムの鶏ひき肉を無菌ストマッカーバッグに無菌に移します。サンプルに、所望の濃度の培養希釈液の1ミリリットルを接種します。滅菌セルスプレッダーを使用して、接種物を鶏肉の表面に均等に穏やかに分散させ、摂氏4度で1時間放置します。

照射した鶏ひき肉サンプルをサルモネラ菌培養物と1時間インキュベートした後、各サンプルに225ミリリットルのBPWを添加して、目的のサンプル対培地比を達成します。ストマッカーを使用して、鶏肉のサンプルを通常の速度で120秒間均質化します。50ミリリットルのピペットを使用して、ストマッカーのろ過側から液体を慎重に取り出し、2つの滅菌遠心分離ボトルに分割します。

サンプルを10, 000 Gで10分間遠心分離し、上清を捨てます。滅菌ヘラを使用して、細胞ペレットを3ミリリットルのBPWに再懸濁します。再懸濁したペレットに12ミリリットルのBPWを加え、滅菌ヘラで攪拌して完全に混合します。

両方の遠心分離ボトルの内容物を1つのボトルにまとめます。再懸濁したサンプルを 3 ミリリットルの 48 ウェルブロックの列 1 の各ウェルに追加して、8 回の反復を作成します。8チャンネルピペットを使用してカラム1から6までの一連の10倍希釈を調製するには、各ウェルからのサンプルを次のカラムで2.7ミリリットルのBPWに加え、完全に混合します。

ブロックを摂氏37度で一晩インキュベートし、100 RPMで振とうします。翌日、マルチチャンネルピペットを使用して、各希釈液から7マイクロリットルの培養物を4×6グリッドの脳心臓注入オーガープレートにプレートします。プレートを10分間乾燥させてから、摂氏37度で18〜24時間インキュベートします。

インキュベーション後、オーガープレートを検査し、少なくとも1つのコロニーを陽性とし、成長をゼロに陰性としてマークします。ワークシートに希釈数と希釈係数を入力します。サンプルの適切な容量または重量を入力します。

次に、反復数を指定し、陽性と判定されたサンプルの数を入力します。「結果の計算」をクリックすると、注釈付きの正と負の結果が単純な最大確率解決法を使用して分析されます。まず、ニワトリサンプルを接種したサルモネラ菌培養用の48ウェルMPNブロックを設定します。

48ウェルブロックで培養物を数回ピペッティングして混合します。各培養物の200マイクロリットルを96ウェルPCRプレートに移します。プレートを密封し、6, 600 Gで10分間遠心分離します。

上清を取り除き、20マイクロリットルのDNA抽出キット試薬をペレットに加えます。ペレットをピペッティングで上下に混合します。再度、プレートを密封し、摂氏99度で10分間加熱した後、摂氏20度に冷却します。

遠心分離後、2マイクロリットルの上清を使用して、確立されたプロトコルに従ってQPCR混合物を調製します。以下の条件でリアルタイムPCRを行います。PCR後、結果をエクスポートし、サイクルしきい値が30以下のウェルを正、30より大きいウェルを陰性と見なします。

48ウェルブロックで培養物を数回ピペッティングして混合します。各サンプルの20マイクロリットルを、溶解チューブに付属の分子検出アッセイサルモネラキットに移します。サンプルを摂氏100度で15分間加熱します。

その後、サンプルを室温で10分間インキュベートします。各溶解チューブから20マイクロリットルの溶解液を試薬チューブに移し、試薬チューブをホルダーにロードします。試薬チューブ付きホルダーを分子検出システム装置に追加します。

分子検出システムアッセイのソフトウェア設定を行います。アッセイを実行し、分析のためにレポートをエクスポートします。MDS Run レポートは、正または負の詳細な出力情報を提供します。