シングルセルマイクロリットル液滴培養オミクスシステムを使用した自動およびハイスループット微生物モノクローナル培養およびピッキング

この研究では、自動プラットフォームを使用して微生物培養オミクスを探索し、微生物の分離、培養、モノクローナルスクリーニングを強化します。その目的は、ヒトの腸、マイクロバイオーム、およびそれらの応用についての理解を深めることです。マイクロバイオーム研究を推進する技術者には、ドロップオブマイクロフルイディクス、自動株分離およびスクリーニングプラットフォーム、機械学習アルゴリズム、高ひずみ培養オミクスおよびマイクロバイオーム分析のためのモノクローナルディスペンサーなどがあります。

ミッドセルシステムは、マイクロビュー、モノクローナル単離、着色を大幅に強化し、従来の方法と比較してほぼ2倍の数のクローンを生成し、腸内マイクロビュー培養ミックスの研究能力を向上させます。このプロトコールは、低コストで高支持の微生物スクリーニングプラットフォームのニーズに対応し、培養ミックス研究の効率とスコアリング能力における従来の方法の限界を克服します。私たちの研究室では、技術応用の範囲を拡大するために、液滴の分割や合体など、追加の液滴操作技術の統合にさらに焦点を当てます。

まず、MISSセルの液滴生成と培養チャンバーのドアを開きます。マイクロチューブと液滴発生マイクロ流体チップの保護カバーを垂直に取り外します。使い捨て注射器を使用して、チャンバー内の加湿器に10ミリリットルの滅菌蒸留水を追加し、保護カバーを再度取り付けます。

マイクロチューブと液滴発生マイクロ流体チップの滅菌パッケージを開き、培養チャンバーの真上に垂直に置きます。次に、ソフトウェアインターフェイスで、[インストール]をクリックします。確認のポップアップ ウィンドウが表示されたら、[はい] をクリックしてインストールを開始します。

気泡除去剤を取り出し、チャンバー内の気泡除去剤の配置に逆さまに固定します。気泡除去剤の液滴出口チューブをclに取り付けますampその下のバルブ。液滴検出および収集チャンバーにつながる全体をガイドします。

チャンバーのドアを開けた後、検出チューブを検出ソケットに垂直に挿入します。検出チューブが完全に挿入されていることを確認してください。検出チューブを時計回りに固定しているネジを締めます。

完全挿入と固定を確認したら、チャンバーのドアを閉めます。マイクロ流体チップの10本のシリコンチューブ(L1からL10)をそれぞれ、対応する番号の付いたクランプバルブに接続します。次に、マイクロ流体チップからのクイックコネクタをオミックシステムの対応するポートに、適切に接続して接続します。

チップの取り付けが完了すると、ポップアップウィンドウが表示され、「液滴チューブクランプバルブが開いています」というメッセージが表示されます。マイクロチューブと液滴発生チップの取り付けが完了したら、OKをクリックします。すべてのチューブが対応するクランプバルブに正しく取り付けられていることを確認したら、[OK]をクリックします。

初期化を実行する前に、設定インターフェースをクリックして、選択モード、インキュベーション温度、インキュベーション時間、攪拌機速度、OD検出波長、蛍光検出の励起波長と発光波長などの関連パラメータを設定します。ホームインターフェイスに移動し、[初期化]をクリックします。確認のポップアップウィンドウが表示されたら、「はい」をクリックすると、ICシステムは、注入ポンプ、温度設定、廃液排出試験、スクリーニングモジュール、液滴検出モジュールなどのコンポーネントのセルフチェックを実行できます。

初期化が完了したら、ポップアップウィンドウから[OK]をクリックします。サンプルを調製するには、微生物サンプルを採取し、対応する培地で段階希釈を行い、1ミリリットルあたり約50細胞の濃度を達成し、40ミリリットルのサンプル懸濁液を得ます。次に、サンプルボトルのキャップを緩め、希釈した糞便懸濁液をマグネティックスターバーでサンプル添加位置までボトルに注ぎます。

キャップをねじ込み、しっかりと締めます。次に、クイックコネクタAをクイックコネクタBに挿入して、サンプルのロードプロセスを完了します。サンプルボトルを所定の位置に置いた後、クイックコネクターAとBをサンプルボトルから分離します。

サンプルボトルのクイックコネクターAをオミクスシステムのO3ポートに接続します。マイクロ流体チップのC3コネクタをクイックコネクタBに接続し、チャンバーのドアを閉じます。ソフトウェアのホームインターフェースで、生成するドロップレットチューブの数を選択し、[プロデュース]をクリックしてシングルセルドロップレットの生成を開始します。

ドロップレットの作成が完了したことを示すポップアップウィンドウを待ち、[OK]をクリックします。clを閉じますamp 3つのコネクタのamp サンプルボトルを取り外します。ソフトウェアのホームインターフェースで、液滴生成時に使用したものと同じ液滴チューブ番号を選択します。

カルチャをクリックします。栽培時間と温度を確認し、作業を開始します。液滴培養の完了を示すポップアップウィンドウを待ちます。

オミックシステムのUVボタンを押すと、紫外線がオンになります。液滴検出収集室に30分間照射してから、消灯してください。液滴回収に使用した96枚のウェルプレートを全て開け、蓋をせずに下から上に順番に番号を振って積み重ねるスーパークリーンベンチです。

トップウェルプレートが蓋で覆われていることを確認してください。液滴検出収集室のドアを開け、ウェルプレートを所定の位置に置きます。トップウェルプレートから蓋を取り外し、チャンバードアを閉じます。

オミクスシステムのUVライトを再度30分間点灯させ、二次滅菌を行います。次に、気泡除去剤を配置位置から取り外します。キャップを緩め、バタフライ型のネジをキャップから取り外します。

気泡除去剤に200ミリリットルの気泡除去油を注ぎます。キャップをしっかりと固定し、気泡除去剤を逆さまにして所定の位置に固定します。ホームインターフェースで、ソート用の液滴チューブを選択します。

[並べ替え] をクリックします。回収するウェルプレートの数を入力し、選別を開始します。液滴の光学密度または蛍光値のリアルタイム測定のために、プロセス表示領域を観察します。

約20〜30個の液滴を分析して、OD値を確認します。ほとんどの液滴の OD が約 0.2 の場合は、OD の下限しきい値を 0.5 に、OD の上限しきい値を 4 に設定します。この範囲内の液滴を96ウェルプレートに自動的に収集します。

ドロップレットのソートと収集が完了したことを示すポップアップウィンドウを待ってから、[OK]をクリックします。飛沫検出および収集チャンバーのドアを開きます。ウェルプレートの蓋をトップウェルプレートに置き、プレートを一緒に取り外します。

[データのエクスポート] をクリックして、収集した液滴信号データを保存します。[ヒート マップ] をクリックします。液滴採取データファイルを選択し、マイクロプレート形式で表示されるODを観察します。

これらのOD値をヒートマップとして視覚化し、色の強度がウェル全体のOD分布に対応することで、明確で直感的な表現が可能になります。オミクスシステム、ソリッドプレート法、および初期便サンプルから得られたヒト腸内細菌叢の種多様性を家族レベルで比較しました。Solid Plate法とProven Omics法の両方により、34の微生物ファミリーが濃縮され、オミクスシステムではさらに4つのファミリーが濃縮されました。

また、オミクスシステムは、存在量の少ないファミリーの一部を効果的に濃縮しました。属レベルでは、どちらの方法でも74の微生物属が濃縮され、MISS細胞法ではさらに13の属が濃縮されました。さらに、当初は低存在量であった2つの属は、OMICシステムを使用して効果的に濃縮されました。

これらの結果から、MISS細胞培養法は、元の微生物懸濁液中に低の割合で存在する株や増殖性能が劣る菌株に対して、より良い増殖条件を提供することが示されました。