放射線感受性および放射線耐性遺伝子を明らかにするためのゲノムワイドCRISPRスクリーニング

本研究は、ゲノムワイドCRISPRスクリーニングと放射線治療に焦点を当てています。照射後の肺がん細胞におけるゲノムワイドCRISPRスクリーニングを用いて、放射線感受性遺伝子と放射線耐性遺伝子を観察するためのプロトコルを提供します。現在の実験上の課題には、ゲノムの膨大な複雑さと、根底にあるメカニズムの探索における潜在的な困難によって引き起こされるオフターゲット効果が含まれます。従来のスクリーニング方法と比較して、CRISPR は永久的な遺伝子組み換えを達成し、優れた精度を示すため、機能ゲノム研究や標的発見において特に価値があります。将来的には、私たちのチームは、この研究が残した問題を解決するために in vivo CRISPR スクリーンの研究に注力し、CRISPR テクノロジーの最適化に取り組んでいきます。

[ナレーター]まず、接着細胞密度を10の5倍の10の5乗に調整します。ピペットを使用して、細胞懸濁液2ミリリットルを各3.5センチメートルの培養皿に分配し、異なる線量で放射線治療を行います。皿を摂氏37度に設定したインキュベーターに入れ、5%の二酸化炭素を入れ、一晩インキュベートします。マーカーを使用して、各3.5センチメートルの培養皿に1から5までの番号を付けます。放射線源を使用して、皿2〜5にそれぞれ2、4、6、および8グレーの放射線量を投与します。照射された細胞密度を10の1倍の5細胞/ミリリットルの累乗に調整します。ウェルあたり10マイクロリットル、つまり100マイクロリットルあたり1000細胞を6ウェルプレートに播種し、放射線量ごとに3回繰り返します。次に、ウェルあたり30マイクロリットル、つまり100マイクロリットルあたり3000細胞に相当し、放射線量ごとに5回繰り返して96ウェルプレートに播種します。次に、CCK-8試薬をFBSを含まないRPMI 1640培地と1対9の比率で混合します。混合物を96ウェルプレートに加え、プレートを暗所で1時間インキュベートします。次に、マイクロプレートリーダーを使用して、450ナノメートルの光学密度を測定します。感染プロセスを開始するには、レンチウイルスの対数濃度勾配をミリリットルあたりゼロから800単位まで設定します。対応する量のレンチウイルスをディッシュあたり2マイクロリットルのポリブレンに加え、室温で5分間平衡化させます。レンチウイルスポリブレン混合物を各ウェルにゆっくりと滴下します。親細胞密度を10の3倍に10倍の5細胞の累乗に調整し、12ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルを接種します。ピューロマイシンを濃度勾配でウェルに加えます。感染の72時間後、各ウェルの培地を、細胞を殺すための最小ピューロマイシン濃度を含む完全培地と交換します。生き残った細胞に基づいて、各ウェルの感染の多様性を計算します。接着細胞密度を10の1倍の7細胞/ミリリットルの累乗に調整します。ポリブレンのディッシュあたり30マイクロリットルに0.3に等しい感染の倍数でレンチウイルスを加え、室温で5分間平衡化させます。レンチウイルスとポリブレンの混合物を15センチメートルの培養皿にゆっくりと滴下します。よく混ぜて、摂氏37度で5%の二酸化炭素で一晩インキュベートします。感染後2日目に、培地を培養皿から吸引し、10%FBSを含む15ミリリットルのRPMI 1640完全培地と交換します。感染していない親細胞に対してネガティブコントロールと同じ処理を繰り返し、72時間培養を続けます。次に、0.25%トリプシンを使用して1つの15センチメートルの培養皿から細胞を消化します。細胞を10%PBSを含むRPMI 1640完全培地に再懸濁し、細胞数をカウントします。0日目のゲノムDNAを抽出した後、NanoDrop UV分光光度計を使用してDNA濃度と純度を測定します。治療群の細胞に適切な線量の放射線を投与し、対照群の細胞は正常に増殖するように未処理のままにしておく。14日間の治療後、0.25%トリプシンを使用して治療群と対照群の両方の細胞を消化します。細胞を10%FBSを含むRPMI 1640完全培地に再懸濁します。細胞を300 Gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁します。遠心分離ステップを繰り返した後、ペレットから14日目のゲノムDNAを抽出し、DNA濃度を測定します。次に、必要なプライマーを準備し、10マイクロモルに希釈します。成分を加えて20マイクロリットルの反応システムをセットアップした後、チューブを300 Gで5秒間短時間遠心分離します。アガロースゲル電気泳動の場合は、ゲルを調製し、そこからコームを取り外し、電気泳動タンクにゲルを覆うのに十分なバッファーを満たします。DNAサンプルにローディングバッファーを加え、よく混合します。 最後に、混合物をウェルにロードし、電気泳動を開始します14日後にコロニー形成を開始すると、2つのグレイの放射線への曝露は、ゼログレイと比較して生き残ったコロニーの数が大幅に減少することが明らかになりました。CCKAアッセイでは、2グレイで細胞生存率が大幅に低下し、放射線量が高いとさらに低下することが示されました。ピューロマイシンの濃度を72時間増加させて処理したところ、A549細胞を除去するために必要な最小濃度が1マイクロモルであることが示されました。PCR検証では、231塩基対に異なるバンドが示され、CRISPRライブラリー内のsgRNA配列の予想長が確認されました。シーケンシング分析により、リードの約60%がリファレンスゲノムへのマッピングに成功したことが明らかになりました。sgRNAリードカウントはポアソン分布に従い、ゲノムスケールスクリーニングの理論的期待と一致しました。PCAおよびヒートマップ分析では、高いグループ間変動性と低いグループ間変動が示され、実験の一貫性が検証されました。遺伝子オントロジー解析により、上位15の結果の中で上位に濃縮された経路としてDNA損傷応答が特定されました。