慢性脳イメージングのための開頭手術の手順

脳機能の研究において、イメージング技術はますます重要になってきています。その中で、2光子レーザー顕微鏡法は、生きた蟻の脳の研究を可能にし、適切な準備をすることで非常に有用な方法として浮上しています。この技術により、同じ皮質領域を数分から数か月まで慢性的に観察することができます。

このビデオでは、2つの顕微鏡写真を用いた脳の慢性in vivoイメージングの準備を示しています。ジャネリアファームのハワードヒューズ医学研究所の研究者であるカール・ボーダ博士は、今日私たちが示す頭蓋窓の準備を最初に開拓しました。こんにちはそしてリカルドは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校神経学部のカルロス・ポーター・カヨの研究室からでなければなりません。

今日は、慢性的なin vivoイメージングのための頭蓋窓を作成する手順をお見せします。この調製物は、光子レーザー顕微鏡を使用して脳の深部を画像化できるため、非常に便利です。それでは、始めましょう。

手術を開始する前に、マウスはイソフッ素で麻酔されます。誘導のために4%、手術のために1ポイント半から2%、I-A-C-U-C承認の手順を使用して、動物が完全に鎮静されていることを確認するために尾やつま先のピンチを使用することが重要です。げっ歯類のトリマーを使って、首の後ろから目元までの毛を剃ります。

髭剃り後、マウスを定位固定装置フレームに置き、水循環ブランケットの上に置きます 摂氏37度で、頭はイヤーバーを使用してしっかりと固定されます。次に、動物の目が乾燥するのを防ぐために、目の軟膏が適用されます。次に、デキサメタゾン、0.2ミリグラム/キログラム、カルプロフェン5ミリグラム/キログラムを皮下投与します。

脳の腫れや炎症反応をそれぞれ防ぐため。手術を開始する前に、70%アルコールとベタジンの綿棒を3回交互に使用して皮膚を拭いて、手術領域を滅菌してください。すべての手術器具は、エタノールを噴霧したハサミを使用してガラスビーズ滅菌器を使用して事前に滅菌されています。

頭蓋骨の上の皮膚は、頭の付け根に沿った水平の切り込みから始まり、続いて吻側方向に2回の切り込みが続き、まぶたにほぼ達します。次に、正中線で収束する2つの斜めのカット。この時点で、メスによる過度の出血や痛みを避けるために、リドカインとエピネフリン溶液を骨膜に一滴垂らし、骨膜を頭蓋骨の端まで引っ込めます。

首の後ろの筋肉組織も軽く引っ込められています。次に、頭蓋骨の露出部分全体をメスで優しくこすり落とし、乾燥した表面を作ります。これは、後で接着剤を塗布したときに接着剤がよりよく付着することを可能にするため、非常に重要です。

イメージング部位が選択されたら、最初に頭蓋窓を作成する準備が整います。直径約4mmの円を空気圧式デンタルドリルで優しく描きます。わずかな穴あけの後、リドカインエピネフリン溶液を再び頭蓋骨表面に塗布します。

骨の非常に薄い層(通常は片方の鼻)が残ったときに穴あけは停止します。この段階は、開頭術の中心をそっと押して、生理食塩水の滴の下でそれがどのように道を譲るかを感じ、骨小柱を利用することによって到達します。骨の海綿状の構造。

開頭術は、非常に細い先端鉗子で頭蓋骨から持ち上げられます。生理食塩水は、頭蓋骨を持ち上げ、硬膜の出血を防ぐのに役立つため、重要です。次に、以前に生理食塩水に浸したジェルフォームを硬膜に塗布して、頭蓋骨を切除するときに時々発生する小さな出血を止めます。

硬膜物質の表面を乾燥させ、出血がないことを確認した後、滅菌済みの5ミリメートルガラスカバースリップを硬膜物質の上にそっと置きます。シアノアクリレートベースの接着剤を一滴垂らし、頭蓋骨の反対側の半球に塗布します。針の助けを借りて、接着剤はガラスの下に置かないように注意しながら、窓の周り全体に優しく塗布されます。

これで、接着剤を頭蓋骨の表面全体に薄い層で塗布できるようになりました。接着剤が乾いたら、歯科用アクリルを混合して頭蓋骨の表面全体に塗布し、カバースリップの小さな縁も覆って固定します。カバースリップを固定した後、デンタルアクリルで窓の周りに小さなウェルを作ります。

チタンバーも歯科用アクリルに埋め込まれています。このバーは、後でマウスを顕微鏡のステージにしっかりと取り付けるために使用されます。イメージングでは、バーが頭蓋窓と平行になるようにバーが水平であることを確認することが重要です。

バーの下に一枚の紙を置くと、アクリルが硬化している間、バーは水平に保たれ、歯科用アクリルは10分間硬化または硬化し、その時点でチタンバーは所定の位置に固定されています。その後、動物は回復するまで暖かいケージに入れられます。麻酔から回復した後、動物は同じ日に画像化することができます。

この動画は、生後3ヶ月のGFPMマウスの体性感覚皮質の上に置かれた頭蓋窓を通して、カスタムビルドの2光子顕微鏡で5ミクロン間隔で撮影された160枚の画像のスタックを示しています。このトランスジェニック系統のマウスは、パルマルニューロンの小さなサブセットでGFPを発現します。レイヤー5とレイヤー2の3では、40倍水浸対物レンズ、開口数0.8、励起波長910ナノメートルで撮影しました。

より表面的な画像では、パラメタル細胞の頂端樹状突起の樹状突起を認識するのは簡単です。各ニューロンの樹状突起の頂端房は、単一の大きな頂端樹状突起に収束します。小さな斜めの樹状突起も見られ、この主要な頂端樹状突起軸索が視野を横切ることも明らかです。

これは、同じ40倍対物レンズを高倍率で使用して1ミクロン半ごとに撮影した12枚の画像のスタックであり、表在樹状突起が個々の樹状突起棘を解像するのに十分な高解像度で示されています。写真顕微鏡を使用して脳の慢性イメージングのための頭蓋窓の準備を行う方法を示しました。これは、生きている脳の構造と機能の両方を、単一の想像力だけでなく、数か月にわたる複数の想像力を通じて慢性的に研究できるため、脳の研究にとって非常に強力な方法です。

頭蓋窓の準備のもう一つの利点は、大きな視界を画像化できるため、ミリメートルのスパンにわたって全体のアクションやinriアーバーなどの大きな構造を画像化できることです。この手順を行うときは、可能な限り清潔で無菌的な条件で作業すること、そして非常に安定した手を持つことを覚えておくことが重要です。さて、これで完了です。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。