Name: 生細胞における脂質交換アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぶシクロデキストリンを用いた脂質交換法で、生細胞の膜ダイナミクスと受容体シグナル伝達を解析する手法。この方法は膜タンパク質の挙動理解に貢献します。

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<ol><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+lipid+rafts+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions of lipid rafts in biological membranes.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 111-136 (1998).</li>
<li>Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts%2C+detergent-resistant+membranes%2C+and+raft+targeting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals.</a> Physiology. 21, 430-439 (2006).</li>
<li>Schroeder, R., London, E., Brown, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+saturated+acyl+chains+confer+detergent+resistance+on+lipids+and+glycosylphosphatidylinositol+%28GPI%29-anchored+proteins%3A+GPI-anchored+proteins+in+liposomes+and+cells+show+similar+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interactions between saturated acyl chains confer detergent resistance on lipids and glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins: GPI-anchored proteins in liposomes and cells show similar behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (25), 12130-12134 (1994).</li>
<li>Suresh, P., Miller, W. T., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+exchange+shows+insulin+receptor+activity+is+supported+by+both+the+propensity+to+form+wide+bilayers+and+ordered+raft+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phospholipid exchange shows insulin receptor activity is supported by both the propensity to form wide bilayers and ordered raft domains.</a> J Biol Chem. 297 (3), 101010(2021).</li>
<li>Delle Bovi, R. J., Kim, J., Suresh, P., London, E., Miller, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterol+structure+dependence+of+insulin+receptor+and+insulin-like+growth+factor+1+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Sterol structure dependence of insulin receptor and insulin-like growth factor 1 receptor activation.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1861 (4), 819-826 (2019).</li>
<li>Zidovetzki, R., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cyclodextrins+to+manipulate+plasma+membrane+cholesterol+content%3A+evidence%2C+misconceptions+and+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies.</a> Biochim Biophys Acta. 1768 (6), 1311-1324 (2007).</li>
<li>Ohtani, Y., Irie, T., Uekama, K., Fukunaga, K., Pitha, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+%CE%B1-%2C+%CE%B2-+and+%CE%B3-cyclodextrins+on+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Differential effects of α-, β- and γ-cyclodextrins on human erythrocytes.</a> Eur J Biochem. 186 (1-2), 17-22 (1989).</li>
<li>Suresh, P., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+cyclodextrin-induced+lipid+substitution+to+study+membrane+lipid+and+ordered+membrane+domain+%28raft%29+function+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Using cyclodextrin-induced lipid substitution to study membrane lipid and ordered membrane domain (raft) function in cells.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1864 (1), 183774(2022).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+replacement+of+plasma+membrane+outer+leaflet+phospholipids+and+sphingolipids+in+cells+with+exogenous+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient replacement of plasma membrane outer leaflet phospholipids and sphingolipids in cells with exogenous lipids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14025-14030 (2016).</li>
<li>Yoshimasa, Y., Paul, J. I., Whittaker, J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+amino+acid+replacements+within+the+tetrabasic+cleavage+site+on+the+processing+of+the+human+insulin+receptor+precursor+expressed+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of amino acid replacements within the tetrabasic cleavage site on the processing of the human insulin receptor precursor expressed in Chinese hamster ovary cells.</a> J Biol Chem. 265 (28), 17230-17237 (1990).</li>
<li>Gaus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+lipid+structure+and+raft+domains+in+living+cells+with+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing lipid structure and raft domains in living cells with two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15554-15559 (2003).</li>
<li>Klymchenko, S., Kreder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+for+lipid+rafts%3A+From+model+membranes+to+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes for lipid rafts: From model membranes to living cells.</a> Chem Biol. 21 (1), 97-113 (2014).</li>
<li>Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+receptors%2C+lipid+rafts+and+caveolae%3A+An+evolving+story%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+ActaMol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Growth factor receptors, lipid rafts and caveolae: An evolving story.</a> Biochim Biophys ActaMol Cell Res. 1746 (3), 260-273 (2005).</li>
<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+detergent-resistant+membrane+domains%3A+does+phase+separation+occur+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Structure of detergent-resistant membrane domains: does phase separation occur in biological membranes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 240 (1), 1-7 (1997).</li>
<li>Lin, Q., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+artificial+plasma+membrane+mimicking+vesicles+with+lipid+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preparation of artificial plasma membrane mimicking vesicles with lipid asymmetry.</a> PLoS One. 9 (1), e87903(2014).</li>
<li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+membrane+structure+and+protein+behavior+using+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).</li>
<li>Deveaux, P. F., Hermann, A., Ohlwein, N., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lipid+flippases+can+modulate+membrane+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">How lipid flippases can modulate membrane structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembr. 1778 (7), 1591-1600 (2008).</li>
<li>Balasubramaniam, K., Mirnikjoo, B., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+externalization+of+phosphatidylserine+at+the+cell+surface%3A+implications+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulated externalization of phosphatidylserine at the cell surface: implications for apoptosis.</a> J Biol Chem. 282 (25), 18357-18364 (2007).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacing+plasma+membrane+outer+leaflet+lipids+with+exogenous+lipid+without+damaging+membrane+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Replacing plasma membrane outer leaflet lipids with exogenous lipid without damaging membrane integrity.</a> PLoS One. 14 (10), e0223572(2019).</li>
<li>Contreras, F. X., Sanchez-Magraner, L., Alonso, A., Goni, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transbilayer+%28flip-flop%29+lipid+motion+and+lipid+scrambling+in+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Transbilayer (flip-flop) lipid motion and lipid scrambling in membranes.</a> FEBS Letters. 584 (9), 1779-1786 (2010).</li>
<li>Suresh, P., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%CE%B1CD-based+plasma+membrane+outer+leaflet+lipid+exchange+in+mammalian+cells+to+study+insulin+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Approach+Study+Memb+Struct+A+Exp%22%5BJournal%5D)">MαCD-based plasma membrane outer leaflet lipid exchange in mammalian cells to study insulin receptor activity.</a> Biophys Approach Study Memb Struct A Exp. 700, 485-507 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DLPC)</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>850335</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)</td>ア<td>バンティ極性脂質</td><td>850345</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)ア</td><td>バンティ極性脂質</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)</td><td>アバンティ極性脂質</td><td></td><td></td>850355</tr><tr><td>1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DSPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850365</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>抗インスリン受容体 & β; 抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>CST3025</td><td></td></tr><tr><td>抗 pYpY1162/1163 インスリン受容体抗体</td><td>R&株式会社Dシステムズ</td><td>AF2507</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギIgG、HRP結合抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス試験管 (12 x 75 mm)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>脳スフィンゴミエリン (bSM)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860062</td><td></td></tr><tr><td>卵スフィンゴミエリン (eSM)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860061</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>G418 二硫酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Antibiotic-antimycotic solution (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco'改変イーグル培地(DMEM、4.5 g / Lグルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>ギブコハムs F12 培地</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Gibco L-グルタミン</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030032</td><td></td></tr><tr><td>Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Gibco リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) with Caium and Magnesium (0.144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0.795 g/L Na2- HPO4 (anhydrous))</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Gibco トリプシン-EDTA (0.05%)、フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>高性能薄層クロマトグラフィー (HP-TLC)</td><td>メルク</td><td>HP-TLC シリカゲル 60 プレート</td><td></td></tr><tr><td>イモビロン-P PVDF メンブレン</td><td>ミリポア</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>メトトレキサート</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>454126</td><td></td></tr><tr><td>メチル-&α;-シクロデキストリン(M&α;CD)</td><td>AraChem</td><td>CDexA076/BR</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>オルトバナジン酸ナトリウム、活性化</td><td>シグマ Aldrich</td><td>5.08605</td><td></td></tr></tbody></table>

生細胞における脂質交換アッセイ

Lipid Exchange Assay in Living Cells

交換後の細胞脂質組成の観察可能な変化を実証するために、脳SM(bSM)および1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)交換後のCHO IR細胞でHP-TLCを実施しました(図1)。bSMのようなスフィンゴミエリンが交換に使用されている場合、SMバンド強度の増加が明らかであり、未処理のコントロールと比較してPCバンド強度の減少が見られます。逆に、DOPCのようにホスファチジルコリンを交換すると、PCバンドはより強くなり、SMバンドは強度が低くなります。交換効率は、ImageJソフトウェアで交換された脂質クラスの強度を測定し、未処理のサンプルと処理されたサンプルの比率を取ることで決定できます。市販の脂質を数希釈して作製したローディングスタンダードは、交換前後の脂質クラスの量を推定するオプションを示しています。SM標準バンドの強度を測定し、標準曲線を生成することにより、すべてのサンプルのSM強度を脂質定量のために曲線に適合させることができます。
次に、ウェスタンブロットによる脂質交換後の受容体の自己リン酸...

Lipid rafts are dynamic, ordered domains in the plasma membrane often formed during membrane protein clustering and signaling. The lipid identity of the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

そのターゲットの脂質とタンパク質の相互作用をテストするために我々は、MACSとターゲットの脂質とアネキシンV結合ホスファチジルセリンから合成されたアネキシンV...

磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

プロテオリポソームは、明確に定義された生化学的環境で再構成された精製チャネルとトランスポーターを研究するために使用されます。これらのタンパク質によって媒介される排出を測定するための実験的手順が示されています。プロテオリポソームを調製し、記録を行い、再構成されたタンパク質の機能特性を定量的に決定するためのデータを分析するための手順について説明します。...

プロテオリポソー​​ムベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する<sup&gt; -</sup&gt;チャネルとトランスポーター

私たちは、流体脂質二重層によって取り囲まれるナノメートルタンパク質のパッチでガラスを官能化するプロトコルを提示します。これらの基板は、高度な光学顕微鏡と互換性があり、細胞接着および遊走の研究のためのプラットフォームとして機能することが期待されます。...

サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

HDL 脂質過酸化反応の定量の蛍光細胞生化学アッセイをご紹介します。この迅速かつ再現可能な測定は大規模な研究で HDL 機能を決定するため使用することができ、ヒトの疾患における HDL...

高密度リポタンパク質の脂質過酸化反応の高スループット測定用無細胞生化学的蛍光酵素試金

このプロトコルは、ライブセル イメージング細胞型システムを使用したリアルタイム流入速度と LDL コレステロールの取り込みを測定する効率的な方法を提供します。この手法は、細胞の形態およびそれ故に潜在的な細胞毒性を監視しながら LDL...

LDL コレステロールの取り込みアッセイ セルにライブセル イメージングを使用して正常性の監視

ここでは、ジアシルグリセリルペプチドとアルキンリン脂質を基質としてクリックケミストリーを用いて、アポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼ活性をモニターするための高感度蛍光アッセイを紹介します。...

酵素特性評価からハイスループットスクリーニングまでのアポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼのクリックケミストリーベースの蛍光アッセイ(英語)

マイクロパターン配列を用いた単一細胞からの蛍光レポータータイムコースの取得方法を紹介する。このプロトコルは、単一細胞アレイの調製、ライブセルスキャンタイムラプス顕微鏡のセットアップと動作、および接着部位あたりの細胞統合蛍光時間コースの自動事前選択、視覚制御および追跡のためのオープンソース画像分析ツールを記述する。...

単細胞アレイの生細胞イメージング(LISCA) - 細胞動態を定量化する多目的な技術

ここでは、蛍光脂質センサーおよびリポソームを用いて、タンパク質抽出物を用いてホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトール4-リン酸...

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

このプロトコルは、ユニ脂質および多脂質小胞、支持脂質二重層、および懸濁された脂質二重層を模倣する細胞の形成を記述する。これらの in vitro モデルは、様々な脂質タイプを組み込むために適応することができ、様々な分子および高分子相互作用を調査するために使用することができる。...

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

脂肪食は、脂肪滴の分解を伴うオートファジーの選択的な形態です。このプロセスの機能不全は、がんの発症に関連しています。しかし、その正確なメカニズムはまだ完全には解明されていません。このプロトコルでは、オートファジー、脂質代謝、およびがんの進行の相互作用をよりよく理解するための定量的イメージングアプローチについて説明します。...

脂肪食法による脂質飛沫異化作用の制御の探索

本明細書では、ヒト血漿または血清全体に存在する高密度リポタンパク質(HDL)によって脂質ドナー粒子から特異的に除去された蛍光リン脂質の量を測定するためのプロトコルについて説明します。HDL...

高密度リポタンパク質特異的リン脂質流出アッセイ

学ぶシクロデキストリンを用いた脂質交換法で、生細胞の膜ダイナミクスと受容体シグナル伝達を解析する手法。この方法は膜タンパク質の挙動理解に貢献します。

生細胞における脂質交換アッセイ

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