Name: G-四重鎖におけるDNAポリメラーゼダイナミクスの1分子蛍光可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: 学ぶG-四重鎖構造に遭遇したDNAポリメラーゼδの動態を1分子蛍光顕微鏡で可視化する手法。ポリメラーゼの交換経路を同定し、DNA複製障害における挙動を解明する。

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<ol><li>Sutton, M. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+DNA+polymerases%3A+Coordinating+DNA+replication%2C+DNA+repair%2C+and+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Managing DNA polymerases: Coordinating DNA replication, DNA repair, and DNA recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (15), 8342-8349 (2001).</li>
<li>Burgers Garg, P., J, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+that+propagate+the+eukaryotic+DNA+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases that propagate the eukaryotic DNA replication fork.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 40 (2), 115-128 (2005).</li>
<li>Burgers, P. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+polymerases+in+DNA+replication+and+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA polymerases in DNA replication and DNA repair.</a> Chromosoma. 107 (4), 218-227 (1998).</li>
<li>Tsai, M. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+DNA+polymerases+catalyze+DNA+replication%2C+repair%2C+and+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">How DNA polymerases catalyze DNA replication, repair, and mutation.</a> Biochem. 53 (17), 2749-2751 (2014).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunability+of+DNA+polymerase+stability+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication.</a> Mol Cell. 77 (1), 17-25 (2020).</li>
<li>Chilkova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eukaryotic+leading+and+lagging+strand+DNA+polymerases+are+loaded+onto+primer-ends+via+separate+mechanisms+but+have+comparable+processivity+in+the+presence+of+PCNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA.</a> Nucleic Acids Res. 35 (19), 6588-6597 (2007).</li>
<li>Sugino Kawasaki, Y., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+replicative+DNA+polymerases+and+their+role+at+the+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">Yeast replicative DNA polymerases and their role at the replication fork.</a> Mol Cells. 12 (3), 277-285 (2001).</li>
<li>Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+at+the+replication+fork+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes.</a> Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).</li>
<li>Shivji Wood, R. D., K, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+DNA+polymerases+are+used+for+DNA+repair+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Which DNA polymerases are used for DNA repair in eukaryotes.</a> Carcinogenesis. 18 (4), 605-610 (1997).</li>
<li>Campbell Budd, M. E., L, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+the+eukaryotic+DNA+polymerases+in+DNA+repair+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">The roles of the eukaryotic DNA polymerases in DNA repair synthesis.</a> Mutat Res DNA Repair. 384 (3), 157-167 (1997).</li>
<li>Gao Yang, W., Y, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translesion+and+repair+DNA+polymerases%3A+Diverse+structure+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Translesion and repair DNA polymerases: Diverse structure and mechanism.</a> Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).</li>
<li>Bridges, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair%3A+Polymerases+for+passing+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA repair: Polymerases for passing lesions.</a> Curr Biol. 9 (13), 475-477 (1999).</li>
<li>Wilkinson, E. M., Spenkelink, L. M., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+protein+dynamics+during+DNA-lesion+bypass+by+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci.+9%22%5BJournal%5D)">Observing protein dynamics during DNA-lesion bypass by the replisome.</a> Front Mol Biosci. 9. 968424, (2022).</li>
<li>Mueller, S. H., Spenkelink, L. M., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+proteins+play+tag%3A+The+dynamic+nature+of+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">When proteins play tag: The dynamic nature of the replisome.</a> Biophys Rev. 11 (4), 641-651 (2019).</li>
<li>Zybailov, B. L., Sherpa, M. D., Glazko, G. V., Raney, K. D., Glazko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4-quadruplexes%2C+and+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">G4-quadruplexes, and genome instability.</a> Mol Biol. 47 (2), 197-204 (2013).</li>
<li>Monnat Loeb, L. A., J, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases and human disease.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 594-604 (2008).</li>
<li>Bryan Oganesian, L., M, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+relevance+of+telomeric+G-quadruplex+formation%3A+A+potential+drug+target%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Physiological relevance of telomeric G-quadruplex formation: A potential drug target.</a> Bioessays. 29 (2), 155-165 (2007).</li>
<li>Chambers, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+DNA+G-quadruplex+structures+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 877-881 (2015).</li>
<li>Cheng, Y., Zhang, Y., You, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+G-quadruplexes+folding%2Funfolding+dynamics+and+interactions+with+proteins+from+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol%22%5BJournal%5D)">Characterization of G-quadruplexes folding/unfolding dynamics and interactions with proteins from single-molecule force spectroscopy.</a> Biomol. 11 (11), (2021).</li>
<li>Tippana, R., Xiao, W., Myong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplex+conformation+and+dynamics+are+determined+by+loop+length+and+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplex conformation and dynamics are determined by loop length and sequence.</a> Nucleic Acids Res. 42 (12), 8106-8114 (2014).</li>
<li>Kusi-Appauh, N., Ralph, S. F., Van Oijen, A. M., Spenkelink, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+G-quadruplex+biology+and+stability+using+single-molecule+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Understanding G-quadruplex biology and stability using single-molecule techniques.</a> J Phys Chem B. 127 (25), 5521-5540 (2023).</li>
<li>Obi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+G-quadruplex+DNA+structures+in+Schizosaccharomyces+pombe+causes+single-strand+DNA+lesions+and+impedes+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stabilization of G-quadruplex DNA structures in Schizosaccharomyces pombe causes single-strand DNA lesions and impedes DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 48 (19), 10998-11015 (2020).</li>
<li>Kamath-Loeb, A. S., Loeb, L. A., Johansson, E., Burgers, P. M., Fry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+Werner+syndrome+helicase+and+DNA+polymerase+delta+specifically+facilitate+copying+of+tetraplex+and+hairpin+structures+of+the+d%28CGG%29n+trinucleotide+repeat+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interactions between the Werner syndrome helicase and DNA polymerase delta specifically facilitate copying of tetraplex and hairpin structures of the d(CGG)n trinucleotide repeat sequence.</a> J Biol Chem. 276 (19), 16439-16446 (2001).</li>
<li>Clayton Kaguni, L. S., A, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-directed+pausing+in+in+vitro+DNA+synthesis+by+DNA+polymerase+a+from+Drosophila+melanogaster+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Template-directed pausing in in vitro DNA synthesis by DNA polymerase a from Drosophila melanogaster embryos.</a> Proc Natl Acad Sci. 79 (4), 983-987 (1982).</li>
<li>Sato, K., Martin-Pintado, N., Post, H., Altelaar, M., Knipscheer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+mechanism+of+G-quadruplex+resolution+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Multistep mechanism of G-quadruplex resolution during DNA replication.</a> Sci Adv. 7 (39), (2021).</li>
<li>Castillo Bosch,, P,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FANCJ+promotes+DNA+synthesis+through+G-quadruplex+structures%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FANCJ promotes DNA synthesis through G-quadruplex structures.</a> EMBO J. 33 (21), 2521-2533 (2014).</li>
<li>Paeschke, K., Capra, J. ohnA., Zakian, V. irginiaA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+through+G-quadruplex+motifs+is+promoted+by+the+Saccharomyces+cerevisiae+Pif1+DNA+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA replication through G-quadruplex motifs is promoted by the Saccharomyces cerevisiae Pif1 DNA helicase.</a> Cell. 145 (5), 678-691 (2011).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+efforts+of+replicative+helicase+and+SSB+ensure+inherent+replicative+tolerance+of+G-quadruplex%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci.+%28Weinh%22%5BJournal%5D)">Joint efforts of replicative helicase and SSB ensure inherent replicative tolerance of G-quadruplex.</a> Adv Sci. (Weinh. 11 (9), (2024).</li>
<li>Pham, S. Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+quadruplex+DNA-binding+nickel+Schiff+base+complexes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Trans%22%5BJournal%5D)">A new class of quadruplex DNA-binding nickel Schiff base complexes).</a> Dalton Trans. 49 (15), 4843-4860 (2020).</li>
<li>Georgescu, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+asymmetric+polymerase+assembly+at+the+eukaryotic+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of asymmetric polymerase assembly at the eukaryotic replication fork.</a> Nat Struct Mol Biol. 21 (8), 664-670 (2014).</li>
<li>Hansen, J. B., Au, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvolume+protein+concentration+determination+using+the+NanoDrop+2000c+spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microvolume protein concentration determination using the NanoDrop 2000c spectrophotometer.</a> J Vis Exp. 33, (2009).</li>
<li>Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
<li>Geertsema, H. J., Duderstadt, K. E., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeertsema%2C+HJ+%22in+DNA+Replication%3A+Methods+and+Protocols.%2C+eds+Vengrova%2C+S.%2C+Dalgaard%2C+J%22">in DNA Replication: Methods and Protocols., eds Vengrova, S., Dalgaard, J</a>. , Springer. New York, New York, NY. 219-238 (2015).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+visualization+of+fast+polymerase+turnover+in+the+bacterial+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-molecule visualization of fast polymerase turnover in the bacterial replisome.</a> eLife. 6, 23932(2017).</li>
<li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Curr Protoc Cytom. 12, 12-18 (2009).</li>
<li>Sommers, J. A., Estep, K. N., Maul, R. W., Brosh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+DNA+synthesis+blockage+by+G-quadruplex+structure+and+bypass+facilitated+by+a+G4-resolving+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of DNA synthesis blockage by G-quadruplex structure and bypass facilitated by a G4-resolving helicase.</a> Methods. , 207-214 (2022).</li>
<li>Edwards, D. N., Machwe, A., Wang, Z., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+telomeric+G-quadruplexes+dramatically+inhibit+DNA+synthesis+by+replicative+and+translesion+polymerases%2C+revealing+their+potential+to+lead+to+genetic+change%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intramolecular telomeric G-quadruplexes dramatically inhibit DNA synthesis by replicative and translesion polymerases, revealing their potential to lead to genetic change.</a> PLoS One. 9 (1), 80664(2014).</li>
<li>Mueller, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-molecule+characterization+of+enzymes+involved+in+nucleic-acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid single-molecule characterization of enzymes involved in nucleic-acid metabolism.</a> Nucleic Acids Res. 51 (1), 5(2022).</li>
<li>Lewis, J. S., Van Oijen, A. M., Spenkelink, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embracing+heterogeneity%3A+Challenging+the+paradigm+of+replisomes+as+deterministic+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Embracing heterogeneity: Challenging the paradigm of replisomes as deterministic machines.</a> Chem Rev. 123 (23), 13419-13440 (2023).</li>
<li>Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA-protein+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA-protein crosslink repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (9), 563-573 (2017).</li>
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<table><tbody><tr><td>100 nt コントロールDNAテンプレート</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td></td><td>プライマー拡張アッセイにおける一次制御テンプレート</td></tr><tr><td>100 nt G4形成DNAテンプレート</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td></td><td>プライマー拡張アッセイにおける一次G4形成テンプレート</td></tr><tr><td>15% Mini-PROTEAN TBE-尿素ゲル、12 ウェル、20 &micro;L</td><td>バイオ・ラッド</td><td>4566055</td><td>ゲル電気泳動</td></tr><tr><td>20 nt 標識/ビオチン化プライマー オリゴヌクレオチド</td><td>統合 DNA テクノロジー</td><td></td><td>100 nt テンプレートのプライマー伸長に必要</td></tr><tr><td>22 nt コントロール DNA テンプレート</td><td>統合 DNA テクノロジー</td><td></td><td>円二色性分光法実験における一次制御テンプレート</td></tr><tr><td>22 nt G4 形成 DNA テンプレート</td><td>統合 DNA技術</td><td></td><td>円二色性分光法実験における一次G4形成テンプレート</td></tr><tr><td>24 x 24 mm カバーガラス</td><td>マリエンフェルド 優れた</td><td>100062</td><td>TIRF顕微鏡に必要</td></tr><tr><td>3-アミノプロピルトリエトキシシラン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A10668.22</td><td>カバーガラス機能化</td></tr><tr><td>647 nmレーザー</td><td>コヒーレント</td><td>1196627</td><td>染色/染料に対応する波長を選択選択肢</td></tr><tr><td>670 nm 蛍光フィルター</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET655lp</td><td>関連する波長のみが検出器に通されることを保証します</td></tr><tr><td>アマシャム タイフーン 5 生体分子イメージャー</td><td>Cytiva</td><td>29187191</td><td>ゲル分析</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SVA (MW 5000)</td><td>Laysan Bio</td><td>BIO-PEG-SVA-5K-100MG</td><td>カバースリップ 機能化</td></tr><tr><td>デオキシヌクレオチド三リン酸溶液ミックス</td><td>イエナバイオサイエンス</td><td>NU-1005L</td><td>レプリケーションビルディングブロック</td></tr><tr><td>デジタルドライバス(115V)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1660571</td><td>加熱ソリューション</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>646563</td><td>ジスルフィド結合還元</td></tr><tr><td>EM-CCDカメラ</td><td>アンドール</td><td>iXon 897</td><td>単一分子映画のキャプチャ</td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>F9037</td><td>DNA変性アンサンブル DNA複製アッセイ</td></tr><tr><td>ガスタイトシリンジ、1mL</td><td>SGE</td><td>21964</td><td>円二色性分光法用充填キュベット</td></tr><tr><td>CFI Apo TIRF 100x油浸対物レンズ付き倒立顕微鏡</td><td>ニコン&nbsp;</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>は、単一分子TIRF顕微鏡法</td></tr>を容易にする <tr><td>J-810 分光光度計</td><td>Jasco</td><td>J-810</td><td>円二色性分光法の測定</td></tr><tr><td>mPEG-SVA (MW 5000)</td> <td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5K-100MG</td><td>カバースリップ 機能化</td></tr><tr><td>NanoDrop One 分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ND-ONE</td><td>タンパク質とラベルの濃度を測定する</td></tr><tr><td>NeutrAvidin</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31000</td><td>DNAテンプレートを1分子実験中に官能化カバースリップにテザリング</td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ</td><td>インテック</td><td>BTPE-60</td><td>フローセルの構築に必要</td></tr><tr><td>クォーツキュベット、10 mm</td><td>Starna Scientific</td><td>1/Q/10/CD</td><td>円二色性分光法用サンプルを保持</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Adelab Scientific</td><td>NE-1002X</td><td>マイクロ流体フローセルを介してバッファーと基質を流すために使用されます</td></tr><tr><td>トリス-EDTAバッファー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>93283</td><td>DNA溶液バッファー</td></tr><tr><td>酵母ポリメラーゼ&デルタ;</td><td>Michael O'Donnell Lab</td><td></td><td>DNA テンプレートの複製</td></tr><tr><td>Zeba スピン脱塩カラム、7 K MWCO、0.5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89882</td><td>ポリメラーゼ精製</td></tr></tbody></table>

g-四重鎖におけるdnaポリメラーゼダイナミクスの1分子蛍光可視化

Single-Molecule Fluorescence Visualization of DNA Polymerase Dynamics at G-Quadruplexes

このアッセイでは、蛍光標識された20-ntプライマーを持つ2つのDNA基質を設計しました:1つはG4形成配列を含む(図1A、左)もう1つはこの配列を欠く(図1A、右)。G-四重鎖がポリメラーゼ活性の効果的な障害であることを確認するために、Pol δによるDNA合成を変性PAGEゲル上でモニターしました。DNA基質上の精製標識Pol δの活性をゲル電気泳動により調べた。 図1B (左)は、蛍光標識されたPol δがG四重鎖を超えて合成できないことを示しています。合成の開始前(t = 0 min)には、テンプレート鎖から変性した標識プライマーを表す20 ntに対応するバンドが存在します。3分後、この20-ntバンドは60-ntバンドに変換され、すべてのDNAで合成が行われたことを示し、ポリメラーゼがG-四重鎖構造によって完全にブロックされたことを確認しました。このブロッキングは、ポリメラーゼが構造を解きほぐすこともバイパスすることもできないことを意味します。対照的に、G-四重鎖形成配列を含まないコントロールテンプレート(図1A右)を合成すると、3分後に100-ntバンドが生成されました(図1B右)。
テンプレート上での合成とG-quadruplexによる効率的なブロッキングを確認した後、これらの測定を1分子蛍光顕微鏡で繰り返してポリメラーゼの挙動をモニターしました。DNAテンプレートをマイクロ流体フローセル内の官能基化されたカバースリップ(図2A)につなぎ、蛍光標識プライマーを視覚化して各基質の位置を決定しました。次に、標識されたPol δをdNTPの存在下でロードして合成を開始しました。一般的なFOV内では、個々のスポットを追跡して、Pol δがDNAに結合および解離する頻度を定量化します(図2B、C)。各DNA基質の強度を時間の関数として測定することにより、単一分子の軌跡を生成できます(図2C、 補足図3)。特徴的な「滞留時間」、つまりPol δがテンプレートにバインドされたままである平均時間を測定できます。G4基板では、滞留時間は6秒±2秒と決定されましたが、制御基板では10秒±3秒でした(図2D、 補足図4)。さらに、各軌跡について、Pol δがテンプレートに結合する回数を定量化できます。G4基質への結合イベントの数は、コントロールテンプレートと比較してはるかに多くなっています(図2E)。制御テンプレートには、学問的な結合と結合解除のために複数の結合イベントのインスタンスがありますが、G4 形成テンプレートの平均結合イベントの数は明らかに増加しています。このことは、G-四重鎖によって合成が停止された後、結合したポリメラーゼがDNAから解離し、溶液からの新しいポリメラーゼが結合と非結合の連続サイクルを繰り広げることを示唆しています。したがって、この単一分子アッセイは、DNAポリメラーゼがDNAの障害にどのように反応するかについて、比類のない洞察を提供します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig01.jpg"> 
図1:Ensembleプライマー伸長アッセイ。 (A)DNA基質の概略図。G4基質(左)はG-四重鎖形成配列を含んでいるが、対照基質(右)は含んでいない.(B)プライミングされたG4および対照DNA基質のアンサンブルDNAプリマーゼ伸長アッセイは、蛍光標識酵母Pol δがG-四重鎖によって完全にブロックされていることを示している。PAGEゲルは、DNAテンプレートの経時的な複製を示しており、その結果、標識された20 ntプライマーがG4基質の60 nt製品(左)とコントロールテンプレートの100 nt製品(右)にシフトします。Mは、標識された20 nt、60 nt、および100 ntのオリゴを含むラダーを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig02.jpg"> 
図2:単一分子蛍光顕微鏡 (A)AF647標識酵母Pol δを用いた単一分子プライマー伸長アッセイの概略図(B)単一分子アッセイから得られた典型的なFOV。各スポットは、蛍光標識されたPol δ DNAテンプレートに結合していることを表しています。スケールバー:10 μm. (C) (上) Pol δ交換によるオン/オフ結合を示す単一分子アッセイの例。(ボトム)実験の時間経過に伴う強度を示す同じ分子の単一分子の軌跡。黒い線は、データに当てはめられた隠れマルコフモデル(HMM)を表しています。(D)G4基板(紫色)と制御基板(灰色)上のPol δの滞留時間。線は指数関数的な近似を表しており、G4 基板で 6 秒± 2 秒、制御基板で 10 秒± 3 秒の寿命を示します。(E)単一のDNA基質へのPol δ結合イベントの数。G4基質上の結合イベント数の中央値(紫色)は、対照基質1(灰色)と比較して3.5です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:CD分光法。 25 °C で 200 mM の KCl を含む TE バッファー中の G4 形成 (紫) および制御配列 (灰色) の CD スペクトル。 260 nmの特徴的なピークとそれに続く240 nmの負のピークは、並行分子内GQの特徴です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%201%20(CD).pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:フローセルの構造。(A)フローセルの個々の部分の概略図。正方形のPDMSブロックは、顕微鏡のカバーガラスの上にあります。これらのピースは、フローセルホルダーの蓋と底部の内側に一緒にはめ込まれます。(B)完全なフローセル。PDMSブロックの両側にチューブを挿入して、マイクロ流体 を介して バッファーをデバイス内を流れることができるチャネルを形成できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%202%20(Flow%20Cell).pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図3:単一分子の軌跡。 (A)実験の10分間の時間枠中に単一の結合イベントを受ける分子の軌跡の例。(B)実験の10分間の時間枠で結合がゼロの分子の軌跡の例。(A)と(B)の黒い線は、データに当てはめられた隠れマルコフモデル(HMM)を表しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%203%20(Extra%20Traces).pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図4:滞留時間。 (A)G4基板上のPol δの滞留時間。この線は指数関数的な近似を表しており、制御基板上のPol δの滞留時間は6秒±2秒です。指数関数的なフィットは、10秒±3秒の寿命を与えます。 この<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%204%20(Split%20Lifetimes).pdf" target="_blank">ファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図5:光退色制御。 このプロットは、個々のAF647標識酵母Pol δ酵素が647 nmレーザーによって光退色される平均時間を示しています。この線は指数関数的な近似を表しており、寿命は39 ± 6秒です <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%205%20(Photobleaching%20Control).pdf" target="_blank">。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

G-四重鎖におけるDNAポリメラーゼダイナミクスの1分子蛍光可視化

The ability of proteins&#160;involved in eukaryotic DNA replication to&#160;overcome obstacles &#8212; such as protein and DNA ...

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JoVE Journal

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