G-四重鎖におけるDNAポリメラーゼダイナミクスの1分子蛍光可視化

私たちの仕事は、複雑な生物学的システムのダイナミクスを研究するための単一分子方法論の開発と使用に焦点を当てています。特に、DNAポリメラーゼが障害(この場合はG四重鎖)に遭遇したときにどのように振る舞うかを知ることに関心があります。私たちは、蛍光可視化に基づく1分子法を開発し、G四重鎖に遭遇した際の個々のDNAポリメラーゼの挙動を見ることを可能にしました。

私たちのアッセイでは、これまで特徴付けられていなかったDNAポリメラーゼデルタの交換経路を特定しました。そこでは、G-四重鎖に衝突すると、ポリメラーゼが脱落し、新しいポリメラーゼが再結合します。私たちのプロトコルが開発されたことで、私たちはついに次の質問に答えました:G-四重鎖に遭遇したとき、さまざまなDNAポリメラーゼがどのように振る舞うのか、それは、時間とともに動力学と力学がどのように変化するかをリアルタイムで見ることができますか?まず、機能化されたカバースリップを真空から取り出し、部分的に水で満たされたマイクロチューブラックに置いて、湿度の高い環境を作り出します。

100マイクロリットルのブロッキングバッファーをチューブにピペットで移し、次に25マイクロリットルのニュートラアビジン溶液を加えてよく混合します。溶液をカバースリップの表面に広げ、湿ったボックス内で室温で15分間インキュベートします。次に、カバースリップを水で洗い、窒素ガスで乾燥させます。

カスタムメイドのポリジメチルシロキサンブロックをフローセルホルダー内のカバースリップに置きます。ポリエチレンチューブをフローセルの穴に挿入します。次に、Tweenブロッキングバッファーの1ミリリットルアリコート、500マイクロリットルの洗浄バッファー、およびレプリケーションバッファーを摂氏40度に15分間加熱して、溶液からガスを放出します。

真空チャンバー内で溶液を大気圧より800ミリバール低くしてさらに15分間脱気します。対物レンズにオイルを一滴垂らします。構築したフローセルを取り出し、顕微鏡ステージに置きます。

次に、カバースリップに合うように対物レンズを上げます。インレットチューブを脱気したTweenブロッキングバッファーに挿入し、アウトレットをシリンジポンプに接続します。次に、シリンジを引き戻して、Tween ブロッキングバッファーをチューブを通してチャネルに引き込みます。

200マイクロリットルの脱気洗浄バッファーを毎分100マイクロリットルの速度でチャネルに流し込み、Tweenブロッキングバッファーを洗い流します。次に、DNAテンプレート溶液を500マイクロリットルの複製バッファーで0.5ピコモルに希釈します。150マイクロリットルの溶液を毎分10マイクロリットルの速度でチャネルに流し込みます。

サンプル平面で647ナノメートルのレーザーを約900ミリワット/平方センチメートルで照らし、個々のDNAテンプレートを視覚化します。十分な密度のスポットが見えたら、複製バッファーの新鮮な溶液を流して、余分なDNAを洗い流します。新しい視野に移動し、DNAの画像をキャプチャして、標識されたポリメラーゼとDNA基質との間の共局在の程度を決定します。

完了したら、レーザー出力を上げて残りのスポットを光退色します。次に、レプリケーションバッファーにジチオスレイトール、dNTP、および蛍光プローブを含むポリメラーゼ溶液を調製します。100マイクロリットルのポリメラーゼ溶液を毎分5マイクロリットルの速度でチャネルに流します。

サンプルにピントが合い、全反射蛍光角度を調整したら、647ナノメートルレーザーのレーザー出力をサンプル平面で約900ミリワット/平方センチメートルに設定します。目的の時間だけ視野のイメージングを開始します。G-四重鎖配列は、ページゲル中に60ヌクレオチドバンドが存在することからわかるように、ポリメラーゼデルタ合成を阻害し、一方、G-四重鎖を持たない対照基質は100ヌクレオチドバンドを産生した。

1分子蛍光顕微鏡法により、ポリメラーゼデルタは、G-四重鎖基板上での滞留時間が6秒またはマイナス2秒と短いことが確認されました。これは、対照基板の滞留時間が11プラスマイナス3秒であったのに対し、G-四重鎖基質上において6秒またはマイナス2秒であることが確認されました。ポリメラーゼデルタ結合イベントの数は、対照と比較してG-四重鎖基質で有意に多く、合成阻害による複数の結合および非結合サイクルを示唆しています。