Name: In-Cloning ツールキットを使用したモジュラークローニング (MoClo) によるポリシストロニックオペロンの標準化されたモジュラーアセンブリ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 学ぶモジュラークローニングによるポリシストロニックオペロンの標準化されたアセンブリ手法。In-Cloningツールキットを用いて多遺伝子構築物を効率的に組み立て、遺伝子工学研究の柔軟性を向上させる実験プロトコルです。

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<ol><li>James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+engineering+of+synthetic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The design and engineering of synthetic genomes.</a> Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).</li>
<li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+cloning+system+for+standardized+assembly+of+multigene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs.</a> PLoS One. 6 (2), e16765(2011).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Pingoud, A., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+type+II+restriction+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure and function of type II restriction endonucleases.</a> Nucleic Acids Res. 29 (18), 3705-3727 (2001).</li>
<li>Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golden+Gate+shuffling%3A+A+one-pot+DNA+shuffling+method+based+on+type+IIs+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Golden Gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes.</a> PLoS One. 4 (5), e5553(2009).</li>
<li>de Vries, S. T., Kley, L., Schindler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Golden+Gate+plasmid+set+enabling+scarless+MoClo-compatible+transcription+unit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Golden+Gate+Cloning%3A+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Use of a Golden Gate plasmid set enabling scarless MoClo-compatible transcription unit assembly.</a> Golden Gate Cloning: Methods Protoc. 2850, 105-132 (2024).</li>
<li>de Vries, S. T., Köbel, T. S., Sanal, A., Schindler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-%26+Out-Cloning%3A+Plasmid+toolboxes+for+scarless+transcription+unit+and+modular+Golden+Gate+acceptor+plasmid+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">In-& Out-Cloning: Plasmid toolboxes for scarless transcription unit and modular Golden Gate acceptor plasmid assembly.</a> Synth Biol. 9 (1), ysae016(2024).</li>
<li>Schindler, D., Milbredt, S., Sperlea, T., Waldminghaus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+assembly+of+DNA+sequence+libraries+for+chromosomal+insertion+in+bacteria+based+on+a+set+of+modified+MoClo+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and assembly of DNA sequence libraries for chromosomal insertion in bacteria based on a set of modified MoClo vectors.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1362-1368 (2016).</li>
<li>Zumkeller, C., Schindler, D., Felder, J., Waldminghaus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+assembly+of+synthetic+secondary+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Bacterial+Chromatin%3A+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Modular assembly of synthetic secondary chromosomes.</a> Bacterial Chromatin: Methods Protoc. 2819, 157-187 (2024).</li>
<li>Hoffmann, S. A. YeastFab cloning of toxic genes and protein expression optimization in yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoffmann%2C+SA+%22Golden+Gate+Cloning%3A+Methods+and+Protocols%22">Golden Gate Cloning: Methods and Protocols</a>. , Springer, New York. (2025).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-evaluation+of+E.+coli%27s+operon+structures+via+a+whole-cell+model+suggests+alternative+cellular+benefits+for+low-+versus+high-expressing+operons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Cross-evaluation of E. coli's operon structures via a whole-cell model suggests alternative cellular benefits for low- versus high-expressing operons.</a> Cell Syst. 15 (3), 227-245.e7 (2024).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+stoichiometry+control+of+bacterial+operons+revealed+by+deep+proteome+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Multifaceted stoichiometry control of bacterial operons revealed by deep proteome quantification.</a> Front Genet. 10, 1-12 (2019).</li>
<li>Müntjes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+polycistronic+expression+in+the+model+microorganism+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Establishing polycistronic expression in the model microorganism Ustilago maydis.</a> Front Microbiol. 11, 1-10 (2020).</li>
<li>Behrendt, G., Frohwitter, J., Vlachonikolou, M., Klamt, S., Bettenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymo-Parts%3A+A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+heterologous+gene+expression+in+Zymomonas+mobilis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Zymo-Parts: A Golden Gate modular cloning toolbox for heterologous gene expression in Zymomonas mobilis.</a> ACS Synth Biol. 11 (11), 3855-3864 (2022).</li>
<li>Green, R., Rogers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+transformation+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chemical transformation of E. coli.</a> Methods Enzymol. 529, 329-336 (2013).</li>
<li>Köbel, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy-to-use+plasmid+toolset+for+efficient+generation+and+benchmarking+of+synthetic+small+RNAs+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">An easy-to-use plasmid toolset for efficient generation and benchmarking of synthetic small RNAs in bacteria.</a> ACS Synth Biol. 11 (9), 2989-3003 (2022).</li>
<li>Meyer, A. J., Segall-Shapiro, T. H., Glassey, E., Zhang, J., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+%26%2334%3BMarionette%26%2334%3B+strains+with+12+highly+optimized+small-molecule+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli &#34;Marionette&#34; strains with 12 highly optimized small-molecule sensors.</a> Nat Chem Biol. 15 (2), 196-204 (2019).</li>
<li>Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+design+of+synthetic+ribosome+binding+sites+to+control+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression.</a> Nat Biotechnol. 27 (10), 946-950 (2009).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+582+natural+and+synthetic+terminators+and+quantification+of+their+design+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints.</a> Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).</li>
<li>Togna, A. P., Shuler, M. L., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+plasmid+copy+number+and+runaway+plasmid+replication+on+overproduction+and+excretion+of+beta-lactamase+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Effects of plasmid copy number and runaway plasmid replication on overproduction and excretion of beta-lactamase from Escherichia coli.</a> Biotechnol Prog. 9 (1), 31-39 (1993).</li>
<li>Messerschmidt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+the+synthetic+secondary+chromosome+synVicII+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of the synthetic secondary chromosome synVicII in Escherichia coli.</a> Front Bioeng Biotechnol. 4, 1-9 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>アンピシリン</td><td>メルク・ライフサイエンス</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>細菌寒天</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック&nbsp;</td><td>P0011B</td><td></td></tr><tr><td>BBSI-HF</td><td>ニューイングランド・バイオラボ</td><td>R3539</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF V2</td><td>ニューイングランド・バイオラボ</td><td>R3733</td><td></td></tr><tr><td>E. coliDH5&alpha;有能な細胞</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ&nbsp;Mastercycler&nbsp;ネクサス・サーマルサイクラー</td><td>エッペンドルフ</td><td>6333000014</td><td></td></tr><tr><td>EzDrop 1000マイクロ体積分光光度計</td><td>ブルーレイ・バイオテクノロジー</td><td>BRED-1000</td><td></td></tr><tr><td>GeneJETプラスミドミニプレップキット</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>イン&アウト- クローンツールキット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リガーゼバッファー</td><td>ニューイングランド・バイオラボ</td><td>B0216</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック&nbsp;</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>ニューブランズウィック州イノバリッジ;&nbsp;42/42R - 積み重ね可能なインキュベーターシェーカー</td><td>エッペンドルフ</td><td>M1335-0080</td><td></td></tr><tr><td>フェノブース+</td><td>シンガー楽器</td><td>PHB-007</td><td></td></tr><tr><td>サップ</td><td>ニューイングランド・バイオラボ</td><td>R0569</td><td></td></tr><tr><td>スペクチノマイシン</td><td>メルク・ライフサイエンス</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>標準的なラボウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>ニューイングランド・バイオラボ</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>サーモミックスMM</td><td>B. ブラウン・バイオテック・インターナショナル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック&nbsp;</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック&nbsp;</td><td>LP0021B</td><td></td></tr></tbody></table>

in-cloning ツールキットを使用したモジュラークローニング (moclo) によるポリシストロニックオペロンの標準化されたモジュラーアセンブリ

Standardized Modular Assembly of Polycistronic Operons with Modular Cloning (MoClo) using the In-Cloning toolkit

In-Cloning ツールキットを使用したモジュラークローニング (MoClo) によるポリシストロニックオペロンの標準化されたモジュラーアセンブリ

Modular Cloning (MoClo) toolkits enable the rapid assembly of multigene constructs. They are based on Golden Gate cloning, which uses Type IIS restriction ...

standardized-modular-assembly-polycistronic-operons-with-modular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このビデオでは、タンパク質間相互作用を評価するためのBiFC-PALM(光活性化局在顕微鏡と二分子蛍光相補の組み合わせ)について説明しています。BiFCは、2つの蛍光タンパク質フラグメントと2つの相互作用する目的のタンパク質との融合を伴います。2つのタンパク質が相互作用すると、フラグメントが近接し、2つの部分が一緒になって機能的な蛍光タンパク質を再構成できます。単一の蛍光色素の蛍光は、PALMによって細胞内の単一分子レベルで局在します。...

二分子蛍光相補結合光活性化局在顕微鏡法

タンパク質複合体は、重要な細胞機能を触媒する。多くの重要な複合体の詳細な機能と構造解析、組換え生産を必要とします。 MultiBacは、特に真核生物タンパク質及びそれらの複合体を発現するために調整バキュロウイルス/昆虫細胞系である。...

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

カスタムプラスミドの合成は、手間と時間がかかります。このプロトコルでは、ギブソンアセンブリクローニングを使用して、カスタムDNAクローニング手順の作業と期間を短縮する方法について説明します。記載されているプロトコルは、従来のカットアンドペーストDNAクローニングと同様のコストで、哺乳類の発現のための信頼性の高いタグ付きタンパク質コンストラクトも生成します。...

ギブソンアセンブリを使用して、ヒト伸長因子1αプロモーターの制御下でFLAGタグ化タンパク質を発現するプラスミドベクターの作製

タンパク質間相互作用は、二分子蛍光相補(BiFC)と光活性化局在顕微鏡(PALM)を組み合わせることにより、ナノメートルの空間分解能で細胞内で可視化されます。ここでは、個々のRas-Raf複合体のナノスケールクラスタリングと拡散を視覚化するためのU2OS細胞内のRas-Raf相互作用をイメージングするためのBiFC-PALMの使用について説明します。...

二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

私たちは、有能な外胚葉で応答を誘発することができる遺伝子の発現クローニングのためのXenopus卵子と動物キャップシステムについて説明し、そのような遺伝子のその後の解析技術について議論します。このシステムは、幅広い遺伝子産物の機能同定に役立ちます。...

用いた機能クローニング<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵母細胞発現システム

ここで、液体ハンドリング ロボットのクローン DNA のモジュラー アセンブリの方法を使用してモジュールの DNA「デバイス」アセンブリを実行する自動化されたワークフローが表示されます。プロトコルは、組合せの DNA デバイス ライブラリ世代は、我々 の 2 つの液体処理プラットフォームを使用して例を示す液体ハンドラー候補リストを生成するための直感的なソフトウェア...

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

ここでは、i)CyanoGateモジュラークローニングツールキットを用いて自己複製ベクターを組み立てる方法を記述するプロトコルを提示し、ii)結合によりシアノバクテリア宿主にベクターを導入し、iii)を用いてトランスジェニックシアノバクテリア株を特徴付ける。プレートリーダーまたはフローサイトメトリー。...

シアノゲートモジュラークローニングツールキットを用いたコンジュゲーションによるシアノバクテリアの遺伝子改変

このプロトコルの目的は、ゴールデンゲートクローニングに基づくモジュラークローニングシステムを使用して、マルチ遺伝子構造を組み立てるための詳細なステップバイステップガイドを提供することです。また、当社の経験に基づいて最適なアセンブリを確保するための重要な手順に関する推奨事項も示します。...

モジュラーゴールデンゲートクローニングを用いた多遺伝子構造の迅速な組み立て

この研究は、クローニングや生きている細胞を使用せずに、合成遺伝子断片からタンパク質スクリーニングキャンペーンのための大量(μg-mg)量のDNAを作成するためのプロトコルを記述しています。最小のテンプレートは酵素的に消化され、円形化され、等熱転がり円増幅を使用して増幅される。無細胞発現反応は、非精製物で行うことができる。...

無細胞システムを用いたタンパク質プロトタイピングのための、最小の線形テンプレートの増幅のための迅速で酵素的な方法

適応性のある分子クローニングコースベースの学部研究経験による学生の成果の向上

学ぶモジュラークローニングによるポリシストロニックオペロンの標準化されたアセンブリ手法。In-Cloningツールキットを用いて多遺伝子構築物を効率的に組み立て、遺伝子工学研究の柔軟性を向上させる実験プロトコルです。

In-Cloning ツールキットを使用したモジュラークローニング (MoClo) によるポリシストロニックオペロンの標準化されたモジュラーアセンブリ

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