In-Cloning ツールキットを使用したモジュラークローニング (MoClo) によるポリシストロニックオペロンの標準化されたモジュラーアセンブリ

私は、小さな個々の分子部品から染色体サイズの構造体までモジュール式DNA組み立てを可能にする方法を開発し、これらの人工染色体で細胞を再プログラムする技術を開発しました。この分野における重要な革新の一つは、標準化された分子部品ライブラリから多遺伝子構成体をモジュール化組み立て可能なモジュールクローンツールキットの開発です。モジュール式クローニングツールキットは通常、モノシストロン転写単位のクローンを目的に設計されています。

このプロトコルは、インクローニングツールキットを用いたポリシストロン転写単位の組み立ての汎用的な方法を示しています。このポリシストロニック転写単位のクローニング戦略により、コーディング配列は個々の転写単位でもポリシストロニック配列でも柔軟に使用可能となります。まず、レベル0の部品を選択して転写ユニットに組み立てます。

これには少なくともRBS、符号シーケンス、ターミネーターが含まれなければなりません。オペロンで転写ユニットが組み立てられる位置を選択します。選択した位置に基づいて対応する受容体プラスミドを選択し、SnapGeneでゴールデンゲートアセンブリをシミュレートします。

ゴールデンゲート反応では、酵素SAP1を使ってリボソーム結合部位、コード配列、終端をそれぞれのプラスミドから解放し、受容体プラスミドを切り開きます。リボソーム結合部位、コード配列、ターミネーターを切断受容体プラスミドに組み立てます。次にゴールデンゲート反応では、ピペットを使って各挿入部位のフェムトモールを50個、受容プラスミドを50個追加します。

反応チューブに10×10×T4 DNAリガーゼバッファー、T4リガーゼ、SAP1をそれぞれ1マイクロリットル投与します。次にヌクレアーゼフリーの水を加え、最終的な容量を10マイクロリットルにします。チューブをサーモサイクルラーに入れます。

37度の温度を3分間、16度の温度で4分、50度の温度を20分間25サイクル走らせます。その後、酵素を80度で20分間加熱して不活性化します。オプションとして、GG反応にSAP1を0.5マイクロリットルピペットで送り込み、37度で1時間培養します。

反応液5マイクロリットルをピペットで、化学的に適切な大腸菌細胞50マイクロリットルに混ぜます。熱ショック変換を行い、チューブを42度の水浴に30秒間浸し、その後2分間氷の上に置きます。次に、細胞を1ミリリットルの培地で1時間培養し、回復を助けます。

形質転換から逸出した100マイクロリットルを、100マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンを含むLBオーガープレートにプレートします。プレートは37度で一晩孵化します。翌日、接種ループやピペットチップを使って白い菌株を2つ摘みます。

それぞれ1ミリリットルあたり100マイクログラムを含むLB培地5ミリリットルに接種します。振動するインキュベーターで毎分250回転で37度の状態で一晩孵化します。メーカーの指示に従ってチェック柄の抜き取りを行います。

抽出した血漿DNA1マイクログラムを消化し、10倍消化バッファー1マイクロリットルとBBS11マイクロリットルを加えて消化します。ヌクレアーゼフリーの水を加えて総体積10マイクロリットルにし、培養します。次に、消化済みプラスミドを1%アガロースゲルに装填し、100ボルトで35分間電気泳動を行います。

その後、ゲルを画像診断し、プラスミドの正しい組み立てを確認します。レベルM構成要素を組み立てるには、組み立てるレベル1の転写単位を選択します。BBS1酵素を用いて、第1および第2転写単位およびエンドリンカーを放出してゴールデンゲートアセンブリをシミュレートします。

同時に、受容体プラスミドを切り開き、3つの部分すべてを組み合わせてポリシストロニック転写単位を形成します。レベル1プラスミドアセンブリのネガティブコントロールはターミネーター部分を欠き、コロニーは得られませんでしたが、完全な反応では292個の白色コロニーと赤いコロニーはなしでした。37度の温度で2つ目のカセットを除いて多遺伝子構成体を組み立てると、白いコロニーは2つしか得られませんでしたが、完全な組み立てでは大きなコロニーが9つ、小さなコロニーが435個生まれました。

30度Cでは、多遺伝子組立の陰性対照では4つの白色コロニーが得られ、完全な反応では1,500以上のコロニーが得られました。受容体プラスミドPMA60のBSA1消化では、期待される単一バンドが5,500塩基対を示します。24コロニーのプラスミドのBSA1消化では、24コロニー中23コロニーが約4,300塩基対と1,700塩基対で2つのバンドの正しい制限パターンを示していることが明らかになりました。

蛍光画像ではOC6誘導物質を含むプレートのコロニーに強い緑色およびシアンの蛍光が見られましたが、誘導剤を持たないプレートでは蛍光はほとんどまたは全くありませんでした。