糖鎖分析のためのミクログリアからのミトコンドリア調製

大まかに言えば、私たちの研究は、糖(糖鎖)のメカニズム的役割の決定と、老化や脳障害においてこれらの細胞および細胞内グリコシル化経路をどのように活用できるかに焦点を当てています。現在、脳卒中やアルツハイマー病などの急性および慢性の脳疾患を含む、さまざまな疾患の病態生理学における細胞内糖鎖の役割と調節に関する知識にはギャップがあります。このプロトコルと私たちの研究は、神経免疫相互作用における糖鎖の役割と、その情報を活用してより優れた効率的な中枢神経系治療を設計する方法についての知識を前進させることを目的としています。

[ナレーター]まず、C57BL/6マウス由来のBV-2ミクログリア細胞を入手します。10%FBS、1%ペニシリンストレプトマイシン、および1%の非必須アミノ酸を添加したDMEM低グルコース培地で維持します。T175フラスコで細胞を70〜80%のコンフルエンシーに達するまで増殖させます。フラスコから培地を吸引します。細胞ペレットを1ミリリットルの増殖培地に再懸濁します。トリパンブルーを使用して、細胞を数えます。2ミリリットルの微量遠心チューブで細胞を500 Gで5分間遠心分離します。慎重に吸引して上清を捨てます。800マイクロリットルのミトコンドリア分離試薬Aを加え、中速で5秒間ボルテックスします。次に、チューブを氷上で正確に2分間インキュベートします。10マイクロリットルのミトコンドリア単離試薬Bを加え、最高速度で5秒間ボルテックスします。氷上で5分間インキュベートし、毎分最高速度でボルテックスします。次に、800マイクロリットルのミトコンドリア単離試薬Cを加え、チューブを反転させて混合します。そして、摂氏4度で700Gで10分間遠心分離します。上清を新しい2ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度で3,000Gで15分間遠心分離します。細胞質ゾル部分を含む上清を新しいチューブに移します。ペレットには単離されたミトコンドリアが含まれています。500マイクロリットルのミトコンドリア単離試薬Cをペレットに加え、12,000 Gで5分間遠心分離します。単離したミトコンドリアを50マイクロリットルのタンパク質単離バッファーに再懸濁します。懸濁液を氷の上に20分間放置します。吸引して3回分注し、氷の上に20分間放置し、使用前にボルテックスします。完全に可溶化していない場合は、さらに50マイクロリットルのバッファーを加え、同じチューブにプールします。13,000 Gで10分間遠心分離します。上清を回収・凍結した後、真空濃縮器で乾燥させる。遊離糖鎖を検出するには、乾燥および結合した糖鎖を50マイクロリットルのLCMSグレードの水に再懸濁します。5マイクロリットルの再懸濁ミトコンドリア糖鎖をテフロンマイクロウェルスライド上のサンプルスポットにピペットで移動します。60%アセトニトリルと1ミリモル酢酸からなるエレクトロスプレー溶媒を、毎分2マイクロリットルの流量と3.2キロボルトの電圧で、負イオン化モードでN-糖鎖をイオン化および検出します。IR-MALDESIを、質量電荷比200で半分の半分の分解能で設定されたHRAM質量分析計に結合し、負イオン化モードで502,000の質量電荷比を分析します。モノアイソトーマスの質量を検索して、N-結合型糖鎖を手動で同定します。質量対電荷間隔を使用して同位体分布を確認し、最小イオンフラックスしきい値が1,000イオン/秒で二重および三重電荷イオンを決定します。質量電荷比の生の質量スペクトルを中性モノアイソトープ質量に変換します。次に、モノアイソトープ質量をオンラインのオリゴ糖構造予測ツールにアップロードして、潜在的な糖鎖組成を決定します。実験的にキュレーションされた糖鎖データベースを使用してアノテーションを確認します。各同定が質量測定精度マージンの 2.5 ppm 以内であること、コアおよび結合糖鎖構造を含み、ペントース、3-デオキシ-d-マンノ-オクト-2-ウロソニック酸、またはウロン酸単糖類を除外していることを確認します。6つの独立した製剤から得られたミトコンドリアタンパク質濃度は有意な変動を示さず、高い再現性が確認されました。ウェスタンの血液分析では、CoxIVはミトコンドリア画分のみで、GAPDHは細胞質画分でのみ発現し、ミトコンドリア単離の純度と非ミトコンドリア汚染がないことが確認されました。IR-MALDESIを用いて、ミトコンドリア抽出物において、異なるシアリル化、リン酸化、硫酸化N-糖鎖構造を検出しました。適合度をテストした高二乗値により、1つおよび2つの塩素付加物を持つN結合型糖鎖の検出が確認され、IR-MALDESIを使用してこれらの糖鎖組成が検出されたことが確認されました。