DNAマイクロアレイチップ法による マイコバクテリウム 種の同定

[ナレーター]本研究は、臨床微生物学における分子診断に着目しています。従来の検出方法と比較して、マイコバクテリウム種を同定するための DNA マイクロアレイ チップ法は感度が高く、特異的で、迅速であり、臨床患者の早期診断に重要な支援を提供します。現在、非結核性抗酸菌の迅速な同定方法は多くの草の根研究所で限られており、患者の臨床診断と治療に直接影響します。まず、恒温水浴の温度を摂氏50度に設定し、予熱します。チップを調製するには、遺伝子マイクロアレイチップハイブリダイゼーションボックスの底に200マイクロリットルの蒸留水を加えます。ボックス内の 2 つのポジショニング コラムの間にブラケットを置きます。表側を上にしてチップをブラケットに慎重に置き、カバースリップで覆い、4つのボスが下を向くようにカバースリップで覆い、カバースリップの端がチップの端のラベルと揃うようにします。次に、サンプルの数に応じて200マイクロリットルの遠心分離管、または8つのウェルストリップを準備し、適切にラベルを付けます。キットのハイブリダイゼーションバッファーを完全に溶けるまで摂氏50度で加熱します。十分に混合した後、マイクロ遠心分離機で素早く遠心分離します。9マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーを、調製した各チューブまたはストリップに分注します。対応するPCR産物を各チューブに6マイクロリットルを加え、反応混合物あたり15マイクロリットルの最終容量を作ります。ハイブリダイゼーション反応混合物を摂氏95度に5分間加熱し、PCR装置またはウォーターバスを使用して変性させます。変性処理後、すぐに混合物を氷水混合物に浸し、3分間インキュベートします。ハイブリダイゼーション反応混合物を氷浴から取り出し、上下に2回ピペッティングして混合します。白色の凝集性沈殿物が残らない場合は、カバースリップのローディング穴から13.5マイクロリットルの反応混合物を加えます。ハイブリダイゼーションボックスをすばやく覆って密封し、チップ番号、マイクロアレイ位置、およびサンプル番号を記録します。次に、密閉されたハイブリダイゼーションボックスを摂氏50度に予熱した恒温水浴に水平に置きます。すべての箱を中に入れたら、120分間タイマーを開始します。ハイブリダイゼーション反応が終わったら、ハイブリダイゼーションボックスを水平に取り出し、分解し、チップを取り出します。すぐに、室温に平衡化したチップ洗浄液I.を入れた容器内のスライドラックにチップを置き、恒温シェーカーで80〜100RPMで室温で3分間洗浄します。チップを80〜100 RPMに設定したシェーカーでチップ洗浄液IIで室温で3分間再度洗浄します。次に、チップを遠心分離機に入れ、室温で100gで5分間回転させます。スキャナーの電源を入れます。そして、対応するソフトウェアを開きます。[レーザー制御]ボタンをクリックして、10分間予熱します。サンプル関連情報をソフトウェアに入力します。スキャナの予熱が終了したら、[取り出し]ボタンをクリックします。乾燥したチップを小さなブラケットピースにしっかりと置きます。チップをスキャナーコンパートメントにゆっくりと水平に押し込み、[ロード]ボタンをクリックします。次に、チップ番号をソフトウェアに入力し、クリックして検出領域マイクロアレイ1〜4を選択します。[サンプルの選択]をクリックして、各マイクロアレイに対応するサンプルを選択します。次に、[検出の開始] をクリックして、チップ スキャンを開始します。スキャン結果が画面に表示され、自動的に保存されます。データクエリページを使用して、データクエリと印刷操作を実行します。すべての操作が完了したら、レーザーの電源を切り、ソフトウェアを終了し、最後にスキャナーの電源を切ります。 実験結果の妥当性は品質管理によって確認され、陽性対照では結核菌複合体の検出結果が得られ、陰性対照ではマイコバクテリウムが検出されませんでした。テストサンプルの解釈は、シグナル値が最も高いプローブを含むすべてのプローブが陰性であり、マイコバクテリウムがないという報告が得られる場合から始まります。結核菌複合体プローブのみが強いシグナルを示すサンプルでは、結果はその種グループに対して陽性として識別されます。マイコバクテリウム・アビウムに対応するプローブが強いシグナルを持つ唯一のプローブである場合、サンプルはマイコバクテリウム・アビウムに対して陽性として識別されます。内部対照プローブのみが陽性で、他のすべてが陰性の場合、結果は不確定として報告され、検出キットでカバーされていないマイコバクテリウム種の存在を示します。