急性骨髄性白血病患者由来異種移植の細胞内リン酸化流サイトメトリー

私たちの研究は、急性骨髄性白血病が承認された治療法に対してどのように耐性を発達させるかを理解することを目的としています。代謝が重要な役割を果たすという仮説に基づいています。最終的な目標は、この抵抗を効果的に克服できる戦略を特定することです。白血病研究で広く使用されているフローサイトメトリーは、白血病細胞などの浮遊細胞の分析に最適です。その適応性により、データ分子メカニズムの強力なツールになります。AML研究における主な実験的課題は、治療薬耐性の根底にあるメカニズムを理解し、正確にモデリングするための細胞である分子蘇生に最適なin vivoプロトコルを開発することです。

[ナレーター]まず、マウスの膝を曲げ、利き手ではない手を使って脚を固定し、穿刺側が位置する大腿骨の関節面を露出させます。親指を脛骨に、人差し指を大腿骨に、中指を骨の外側に置き、骨を安定させます。固定を維持しながら、膝の部分をイソプロピルアルコールで消毒して、残った毛を脇に移動させ、骨構造の視覚化を高めます。最初の乾式 25 ゲージ注射器を使用して、針を大腿骨関節の中央に配置し、力を加えずに大腿関節面に穴を開けるようにゆっくりと回転させます。針が骨髄に入ったら、注射器を回転させながら徐々に抜いていきます。2番目のフラッシュシリンジを最初の針によって作成された穴に挿入します。大腿骨に挿入された2番目の注射器に真空を当てながら、ゆっくりと回転させ、徐々に引き抜きます。抽出した骨髄を、シリンジの内容物を500マイクロリットルのPBSを含む冷却マイクロ遠心チューブに洗い流して移します。サンプルを氷の上に置いてください。イソプロパノール綿棒を使用して穿刺部位に 30 秒間穏やかな圧力を加え、出血を止めます。細胞を摂氏4度で5分間500Gで遠心分離します。真空吸引システムを使用して、上清を穏やかに吸引して廃棄します。蛍光細胞染色液のサンプルあたり200マイクロリットルを追加します。PBSで1〜100に希釈して、死んだ細胞を標識しました。ピペットで細胞をそっと再懸濁します。次に、光から保護して、氷上で細胞を10分間インキュベートします。10分後、細胞を500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。真空システムを使用して上清を吸引して廃棄し、2%ウシ胎児血清を含むPBSに1〜100に希釈したHCD 45ブリリアント紫外線395抗体のサンプルあたり100マイクロリットルを加えて、ヒト造血細胞を標識します。細胞を氷上で15分間インキュベートし、光から保護します。細胞を摂氏4度で5分間500Gで遠心分離します。真空システムを使用して上清を吸引して廃棄します。ペレットをPBS溶液中の1ミリリットルの1.6%ホルムアルデヒドに再懸濁します。光から保護して、室温で10分間インキュベートします。10分後、細胞を500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。真空システムを使用して上清を吸引して廃棄します。次に、摂氏マイナス20度で事前に冷却した100%メタノール1ミリリットルを2つに直接加えます。サンプルを摂氏マイナス20度で30分間インキュベートし、光から保護します。細胞を摂氏4度で5分間500Gで遠心分離します。真空システムを使用して、上清を吸引して廃棄します。各サンプルに50マイクロリットルの抗体混合溶液またはアイソタイプコントロール混合溶液を加えます。ピペットを使用して細胞をそっと再懸濁し、すべてのサンプルを摂氏4度で一晩インキュベートし、光から保護します。次に、細胞を摂氏4度で5分間500Gで遠心分離します。上清を廃棄した後、細胞をピペットで穏やかに再懸濁して、1000マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄します。細胞を再び500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を廃棄した後、1000マイクロリットルのPBSを使用して2回目の洗浄を行い、細胞をピペットで穏やかに再懸濁してから、細胞を摂氏4度で再度遠心分離します。上清を吸引した後、最終サンプルを200マイクロリットルのPBSに再懸濁します。この図は、ベネトクラクスベースの療法で15日間治療された急性骨髄性白血病患者由来の異種移植マウスの骨髄細胞における細胞内リンタンパク質シグナルのワークフロー、ゲーティング戦略、および正常化を示しています。ゲーティング戦略は、前方および側面散乱プロファイルとCD45陽性に基づいて、生存可能なヒト急性骨髄性白血病またはAML細胞を同定することに成功し、すべての治療グループにわたって一貫した分析を可能にしました。ベネトクラクス 5-アザシチジンと CDZ ウリジンの治療は、AML 細胞における STAT5 および RPS6 のリン酸化の増加をもたらし、耐性に関連する生存経路の活性化を示唆しています。興味深いことに、マウスにギルテリチニブを投与した場合、治療はFLT3経路タンパク質のリン酸化を有意に減少させず、標的療法にもかかわらずシグナル伝達が持続したことを示しています。リン酸化 STAT5 とリン酸化 RPS6 は、ベネトクラクスベースの治療後に発現レベルの相関関係が最も強く増加し、これらの経路の共活性化を示しています。