Name: 急性骨髄性白血病患者由来異種移植の細胞内リン酸化流サイトメトリー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学ぶ リン酸化流サイトメトリーによる急性骨髄性白血病細胞内シグナル伝達解析法。mTORC1・JAK/STAT5・MAPK経路の高感度測定で、標的治療開発に貢献する研究手法を習得できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Ferrara, F., Schiffer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukaemia+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukaemia in adults.</a> Lancet. 381 (9865), 484-495 (2013).</li>
<li>Döhner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+AML+in+adults%3A+2017+ELN+recommendations+from+an+international+expert+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel.</a> Blood. 129 (4), 424-447 (2017).</li>
<li>Chung, Y. R., Kim, E., Abdel-Wahab, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femoral+bone+marrow+aspiration+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Femoral bone marrow aspiration in live mice.</a> J Vis Exp. (89), e51660(2014).</li>
<li>Haas, A., Weckbecker, G., Welzenbach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Phospho-Flow+cytometry+reveals+novel+insights+into+TCR+proximal+signaling+events.+A+comparison+with+Western+blot%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Intracellular Phospho-Flow cytometry reveals novel insights into TCR proximal signaling events. A comparison with Western blot.</a> Cytometry A. 73 (9), 799-807 (2008).</li>
<li>Perbellini, O., Cavallini, C., Chignola, R., Galasso, M., Scupoli, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-specific+flow+cytometry+reveals+signaling+heterogeneity+in+t-cell+acute+lymphoblastic+leukemia+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Phospho-specific flow cytometry reveals signaling heterogeneity in t-cell acute lymphoblastic leukemia cell lines.</a> Cells. 11 (13), 2072(2022).</li>
<li>Kornblau, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+activation+of+multiple+signal+transduction+pathways+confers+poor+prognosis+in+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Simultaneous activation of multiple signal transduction pathways confers poor prognosis in acute myelogenous leukemia.</a> Blood. 108 (7), 2358-2365 (2006).</li>
<li>Perl, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+targeted+therapy+in+the+management+of+patients+with+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am+Soc+Hematol+Educ+Program%22%5BJournal%5D)">The role of targeted therapy in the management of patients with AML.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2017 (1), 54µ65(2017).</li>
<li>Márton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+phosphorylation+of+signaling+proteins+in+the+prognosis+of+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Oncol+Res%22%5BJournal%5D)">The roles of phosphorylation of signaling proteins in the prognosis of acute myeloid leukemia.</a> Pathol Oncol Res. 30, 1611747(2024).</li>
<li>Levis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLT3+mutations+in+acute+myeloid+leukemia%3A+what+is+the+best+approach+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am+Soc+Hematol+Educ+Program%22%5BJournal%5D)">FLT3 mutations in acute myeloid leukemia: what is the best approach in 2013.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 220-226 (2013).</li>
<li>Roux, P. P., Topisirovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+involved+in+the+regulation+of+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways involved in the regulation of mRNA translation.</a> Mol Cell Biol. 38 (12), e00070-e00118 (2018).</li>
<li>Nepstad, I., Hatfield, K. J., Grønningsæter, I. S., Reikvam, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PI3K-Akt-mTOR+signaling+pathway+in+human+Acute+Myeloid+Leukemia+%28AML%29+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The PI3K-Akt-mTOR signaling pathway in human Acute Myeloid Leukemia (AML) Cells.</a> Int J Mol Sci. 21 (8), ijms21082907(2020).</li>
<li>Jia, X., Zhou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-eIF4E%3A+A+new+target+for+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protein+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Phospho-eIF4E: A new target for acute myeloid leukemia.</a> Curr Protein Pept Sci. 22 (4), 328-335 (2021).</li>
<li>Ghosh, J., Kapur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mTORC1-S6K1+signaling+pathway+in+regulation+of+hematopoietic+stem+cell+and+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Role of mTORC1-S6K1 signaling pathway in regulation of hematopoietic stem cell and acute myeloid leukemia.</a> Exp Hematol. 50, 13-21 (2017).</li>
<li>Park, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+resistance+in+acute+myeloid+leukemia+cells+is+mediated+by+a+novel+ATM%2FmTOR+pathway+regulating+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Therapeutic resistance in acute myeloid leukemia cells is mediated by a novel ATM/mTOR pathway regulating oxidative phosphorylation.</a> Elife. 11, 79940(2022).</li>
<li>Oki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+mTORC1+pathway+activity+in+vivo+reveals+marked+shifts+that+support+time-specific+inhibitor+therapy+in+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic mTORC1 pathway activity in vivo reveals marked shifts that support time-specific inhibitor therapy in AML.</a> Nat Commun. 12 (1), 245(2021).</li>
<li>Lee, H. J., Daver, N., Kantarjian, H. M., Verstovsek, S., Ravandi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+JAK+pathway+dysregulation+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The role of JAK pathway dysregulation in the pathogenesis and treatment of acute myeloid leukemia.</a> Clin Cancer Res. 19 (2), 327-335 (2013).</li>
<li>Liu, A. C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+STAT5+signaling+overcomes+resistance+to+IDH+Inhibitors+in+acute+myeloid+leukemia+through+suppression+of+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting STAT5 signaling overcomes resistance to IDH Inhibitors in acute myeloid leukemia through suppression of stemness.</a> Cancer Res. 82 (23), 4325-4339 (2022).</li>
<li>Sung, P. J., Sugita, M., Koblish, H., Perl, A. E., Carroll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cytokines+mediate+resistance+to+targeted+therapy+in+FLT3-ITD+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cytokines mediate resistance to targeted therapy in FLT3-ITD acute myeloid leukemia.</a> Blood Adv. 3 (7), 1061-1072 (2019).</li>
<li>Song, P., Yang, F., Jin, H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+protein+translation+and+its+implications+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">The regulation of protein translation and its implications for cancer.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 68(2021).</li>
<li>This Standard Operating Procedure (SOP) describes methods for anesthetizing mice. , McGill University. 
 <a target="_blank" href="https://www.mcgill.ca/research/files/research/110-mouse_anesthesia-2024-06-17.pdf">https://www.mcgill.ca/research/files/research/110-mouse_anesthesia-2024-06-17.pdf</a> (2024).</li>
<li>Tech Team Tips: Preparing a Sample with AO/PI. , DeNovix. 
 <a target="_blank" href="https://www.denovix.com/webinars/tech-team-tips-preparing-a-sample-with-ao-pi">https://www.denovix.com/webinars/tech-team-tips-preparing-a-sample-with-ao-pi</a> (2021).</li>
<li>Suni, M. A., Maino, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+cell+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of cell signaling proteins.</a> Methods Mol Biol. 717, 155-169 (2011).</li>
<li>Krutzik, P. O., Irish, J. M., Nolan, G. P., Perez, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+phosphorylation+and+cellular+signaling+events+by+flow+cytometry%3A+techniques+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein phosphorylation and cellular signaling events by flow cytometry: techniques and clinical applications.</a> Clin Immunol. 110 (3), 206-221 (2004).</li>
<li>Chen, W., Luu, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+by+multiparameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping by multiparameter flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1633, 51-73 (2017).</li>
<li>Perez, O. D., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-proteomic+immune+analysis+by+flow+cytometry%3A+From+mechanism+to+translational+medicine+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Phospho-proteomic immune analysis by flow cytometry: From mechanism to translational medicine at the single-cell level.</a> Immunol Rev. 210, 208-228 (2006).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 mLシリンジ25G x 5/8 TW&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>#309626</td><td>骨髄吸引用注射器</td></tr><tr><td>1.7 mLマイクロ遠心チューブ</td><td>フロッガバイオ</td><td>#LMCT1.7B</td><td>骨髄吸引で回収した細胞を分注する</td></tr><tr><td>BD Horizon ブリリアント ステイン バッファー</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>#563794</td><td>染色プロセス用</td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td>フィデリスアニマルヘルス</td><td>エティカXR</td><td>マウスの鎮痛</td></tr><tr><td>セルドロップFLアンリミテッド</td><td>フロッガバイオ</td><td>#CellDrop FL-UNLTD</td><td>細胞数の場合</td></tr><tr><td>D-PBSの</td><td>株式会社ウィセント</td><td>#311-425-CL型</td><td>骨髄吸引により回収された細胞用培地</td></tr><tr><td>エッペンドルフ遠心分離機 5427 R</td><td>ミリポアシグマ</td><td>#EP5429000260</td><td></td></tr><tr><td>胎児ウシ血清熱不活化プレミアム CA</td><td>株式会社ウィセント</td><td>#090-450</td><td>染色プロセス用</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液</td><td>ミリポアシグマ</td><td>#F1635</td><td>細胞透過処理</td></tr><tr><td>ヒトCD45 [HI30]抗体&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>#563792</td><td>BUV395と結合した抗体</td></tr><tr><td>ID7000 スペクトルセルアナライザ</td><td>ソニー</td><td></td><td>スペクトルフローサイトメーター分析装置</td></tr><tr><td>イソフルラン 99.9% 液体</td><td>マッケソン</td><td>#803250</td><td>マウスの麻酔</td></tr><tr><td>イソスピア(イソフルラン)吸入麻酔薬</td><td>デクラ</td><td></td><td>マウスの麻酔</td></tr><tr><td>生/死のAO/PI</td><td>フロッガバイオ</td><td>CD-AO/PI-1.5</td><td>細胞数の場合</td></tr><tr><td>生/死ゾンビNIR</td><td>バイオレジェンド+B6:C12</td><td>#423106</td><td>スペクトルフローサイトメトリー用</td></tr><tr><td>メタノール溶液</td><td>ミリポアシグマ</td><td>#179957</td><td>細胞固定</td></tr><tr><td>P-4EBP1 (Thr37/46) [236B4] 抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>#2846</td><td>Alexa Fluor 488と結合した抗体</td></tr><tr><td>p-Erk1/2 (Thr202/Tyr204) [197G2] 抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>#13148</td><td>Alexa Fluor 647と結合した抗体</td></tr><tr><td>p-RPS6 (Ser240/244) [D68F8] 抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>#9468</td><td>Alexa Fluor 594と結合した抗体</td></tr><tr><td>p-STAT5 (Tyr694) [D47E7] 抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>#14603</td><td>PEと結合した抗体</td></tr><tr><td>ウサギIgGコントロール [DA1E]</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>#2975</td><td>Alexa Fluor 488と結合した抗体</td></tr><tr><td>ウサギIgGコントロール [DA1E]</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>#2985</td><td>Alexa Fluor 647と結合した抗体</td></tr><tr><td>ウサギIgGコントロール [DA1E]</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>#8760</td><td>Alexa Fluor 594と結合した抗体</td></tr><tr><td>ウサギIgGコントロール [DA1E]</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>#5742S</td><td>PEと結合した抗体</td></tr><tr><td>消毒ワイプ</td><td>ユナイテッド・カナダ</td><td>#UCDWPR-9022</td><td>骨髄吸引のための消毒</td></tr></tbody></table>

急性骨髄性白血病患者由来異種移植の細胞内リン酸化流サイトメトリー

Intracellular Phosphoflow Cytometry of Acute Myeloid Leukemia Patient-Derived Xenotransplants

この実験デザインは、治療開始前1日と治療開始後15日など、さまざまな時点における対象タンパク質のリン酸化状態をモニタリングすることを目的としています。このベースラインは、治療後のシグナル伝達経路活性化のその後の変化の信憑性を検証するための重要なコントロールとして機能します。15日間の治療後、2回目の比較を行い、治療したマウスとビヒクルで処理した対照の経路調節を評価します(図4)。この 2 段階のアプローチにより、治療誘発効果とベースラインの変動性を区別することができます。
この研究では、AML PDXマウスモデルを使用しました。マウスには、変異対立遺伝子分画(VAF)が48%の DNMT3AMR882H 、 NPM1W288fs VAFが36%、 FLT3ITD VAFが10%、 IDH2R140Q VAFが44%の変異を特徴とする患者由来のAML細胞を移植しました。移植後、治療を開始する前に腫瘍の成長に3週間の猶予が与えられた。FLT3変異体移植PDXマウスは、プラセボ、ギルテリチニブ(15 mg / kg日)、またはベネトクラクス(50 mg / kg日)、5-アザシチジン(2.5 mg / kg日)、およびセダリズジン(3 mg / kg日)の3つのレジメンのいずれかで15日間治療されました(図4A)。
得られた結果に関して、ベネトクラクスベースのレジメンによる治療がSTAT5およびRPS6リン酸化を有意に増強したことに言及することは注目に値し、これらの経路が治療抵抗性に寄与することを示唆しています(図4E)。対照的に、FLT3を標的とする薬剤であるギルテリチニブは、変異型FLT3エフェクターのリン酸化状態を低下させませんでした。試験したAML検体では、FLT3-ITD以外の追加の二次変異(IDH2など)の存在がこれらの経路の活性化に寄与している、または2週間にわたる薬物治療により、シグナル伝達が減少したAML細胞の選択的排除につながる可能性がある。分析したすべてのリン酸化タンパク質は同じ細胞集団からゲートされているため、リン酸化タンパク質の活性化を比較することができます。この実験では、リン酸化タンパク質染色における最も強い相関関係は、p-STAT5とp-RPS6の間にあるようです(補足図1A)。これらは両方とも、処理後にこの実験グループでアップレギュレーションされます(図4E)。p-STAT5とp-ERKの間には、より小さな関係があるようです(補足図1B)。重要なことに、細胞サイズ(FSC-Aを使用して評価)は全体的なp-STAT5陽性率に大きく寄与しておらず、染色陽性が単に細胞サイズの産物ではないことが強調されています(補足図1C)。この実験フレームワークにより、シグナル伝達経路の調節に対するこれらの治療の影響を包括的に評価できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig01.jpg"> 
図1:標的シグナル伝達経路の可視化とその解析戦略。 (A)p-STAT5(Tyr694)、p-4EBP1(Thr37/46)、p-RPS6(Ser240/244)、およびp-ERK1/2(Thr202/Tyr204)が関与するシグナル伝達経路の概要。p-STAT5経路では、JAKは自己リン酸化を受けて触媒活性を高め、特定のチロシン残基をリン酸化してSTATタンパク質のドッキング部位を作り出します。リン酸化STAT5(Tyr694)は、ホモ二量体化して核内に移動し、標的遺伝子のプロモーター領域にある特定のSTAT応答性要素に結合します。RAS-RAF-MEK-ERKカスケードでは、リガンド結合時にFLT3受容体または他の受容体チロシンキナーゼ(RTK)が自己リン酸化されると、RAS上のGDPとGTPが交換され、RASが活性化されます。活性化されたRAS-GTPはRAFを原形質膜に動員し、そこでRAFは構造変化を受けて活性化します。その後、RAFは二重特異性キナーゼであるMEK1/2をリン酸化して活性化し、さらにThr202/Tyr204残基でERKをリン酸化します。活性化されたERK1/2は核内に移動し、そこで特定の転写因子をリン酸化します。ERK1/2は、中間シグナル伝達経路を通じて、mTORC1活性を増加させ、特定の部位でeIF4Eをリン酸化して翻訳活性を高めることもできます。mTORC1は、FLT3やその他のRTKを介して栄養素や成長因子によって活性化され、S6K1や4E-BP1などの下流の標的をリン酸化します。次に、S6K1はRPS6をリン酸化し、リボソーム機能を強化して翻訳を活性化します。4E-BP1の過剰リン酸化はeIF4Eを放出し、翻訳開始複合体eIF4Fの集合とキャップ依存性翻訳の活性化を可能にします。これらの経路はすべてAMLに深く関与しており、細胞の増殖、代謝、およびアポトーシスシグナルに対する抵抗性を高めることにより、獲得的適応に貢献しています。(B)骨髄吸引および細胞内ホスホフロー染色結合プロトコルの主なステップを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig02.jpg"> 
図2:骨髄穿刺処置中の重要なステップの視覚化。 手術領域と必要な材料は、層流フードの下に設置されます。イソフルラン吸入 (A) による麻酔後、大腿骨関節面は吸引 (B、C) のために準備されます。大腿骨は、大腿骨の中央に配置された最初の注射器によって穿刺されます(D)。針に強い圧力を加えることを避け、代わりに回転式の穴あけ動作を実行することが重要です。これは通常、針が骨の表面を穿孔し、大腿骨腔の経路をたどるのに十分です。次に、骨髄を 2 本目の注射器で穿刺部位 (I、J) を通して吸引します。骨髄穿刺液を微量遠心チューブ(K)に移した後、その領域(L)の出血を止めるために穏やかな圧力を加え、マウスを温かく清潔なケージに入れて回復させます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig03.jpg"> 
図3:アイソタイプコントロールを含むゲーティング戦略分析のワークフロー。 (A)は、生細胞、ダブレットの排除、およびhCD45陽性AML細胞のゲーティング戦略を表しています。(B)は、各リン酸化タンパク質のシグナルを茶色で、アイソタイプコントロールのシグナルを黒色(2つの生物学的複製)で示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig04.jpg"> 
図4:生存骨髄AML細胞の免疫状態後の細胞内リン酸化タンパク質の検出と分析のためのワークフロー (A)患者提供のAML細胞を移植したNSG-SGM3マウスを、ビヒクル(コントロール)またはベネトクラクス、5-アザシチジン、およびセダズリジン(ベネ/アザ/CDZ)またはギルテリチニブで処理しました。15日後、骨髄(BM)吸引物が処理されました。(B)は、治療の15日後に生存可能なAML細胞(例:hCD45/Zombie-NIR陽性)を分析するためのゲーティング戦略を表しています。(C,D)は、ベネトクラクス/5-アザシチジン/セダズリジンまたはビヒクル(B)またはギルテリチニブまたはビヒクル(C)で処理したマウスから単離された10,000個のAML細胞における、示されている各リン酸化抗体のシグナルの正常化を表す。トレースは、ビヒクル(水色)、vene/aza/CDZ(赤)、またはギルテリチニブ(紫)で処理した対照マウスから単離されたAML細胞のシグナルを表しています。(E)ヒストグラムは、3匹のマウスとSDの生きたヒトAML CD45+ 細胞で試験した各リン酸化タンパク質の染色強度の平均値の変化を表しています。エラーバーは標準偏差を表しています。アスタリスクは、 p 値が0.05(*)および0.01(**)未満のANOVAによって評価された染色強度の有意差を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>抗体</td>
			<td>蛍光色素</td>
			<td>希釈</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-RPS6 (Ser240/244)</td>
			<td>AF594</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-4EBP1 (Thr37/46)</td>
			<td>AF488</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-STAT5 (Tyr694)</td>
			<td>PEの</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)</td>
			<td>AF647</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ウサギIgGコントロール</td>
			<td>AF594</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ウサギIgGコントロール</td>
			<td>AF488</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ウサギIgGコントロール</td>
			<td>PEの</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ウサギIgGコントロール</td>
			<td>AF647</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:抗体の最適化された希釈液のリスト。
補足図1: 代表的なAML PDXサンプルにおけるp-STAT5、p-RPS6、p-ERK1/2、およびFSC-Aの比較。この図は、ベネトクラクス/5-アザシチジン/セダズリジンによる治療の15日目におけるマウス「E9」のp-STAT5、p-ERK、およびp-RPS6の関係の例を示しています( 図4Cの結果)。このサンプルでは、リン酸化タンパク質染色における最も強い相関関係は、p-STAT5とp-RPS6(A)の間にあるようで、処理後にこの実験グループで両方ともアップレギュレーションされます(図4E)。p-STAT5とp-ERKの間には、より小さな関係があるようです(B)。重要なことに、細胞サイズ(FSC-Aを使用して評価)は、全体的なp-STAT5陽性率に大きく寄与しておらず、染色陽性が単に細胞サイズ(C)の積ではないことが強調されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/Figure%20S1%20jove.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

To adapt and resist approved treatments, acute myeloid leukemia (AML) cells activate specific molecular pathways that lead to changes in gene expression, ...

私たちの研究は、急性骨髄性白血病が承認された治療法に対してどのように耐性を発達させるかを理解することを目的としています。代謝が重要な役割を果たすという仮説に基づいています。最終的な目標は、この抵抗を効果的に克服できる戦略を特定することです。白血病研究で広く使用されているフローサイトメトリーは、白血病細胞などの浮遊細胞の分析に最適です。その適応性により、データ分子メカニズムの強力なツールになります。AML研究における主な実験的課題は、治療薬耐性の根底にあるメカニズムを理解し、正確にモデリングするための細胞である分子蘇生に最適なin vivoプロトコルを開発することです。[ナレーター]まず、マウスの膝を曲げ、利き手ではない手を使って脚を固定し、穿刺側が位置する大腿骨の関節面を露出させます。親指を脛骨に、人差し指を大腿骨に、中指を骨の外側に置き、骨を安定させます。固定を維持しながら、膝の部分をイソプロピルアルコールで消毒して、残った毛を脇に移動させ、骨構造の視覚化を高めます。最初の乾式 25 ゲージ注射器を使用して、針を大腿骨関節の中央に配置し、力を加えずに大腿関節面に穴を開けるようにゆっくりと回転させます。針が骨髄に入ったら、注射器を回転させながら徐々に抜いていきます。2番目のフラッシュシリンジを最初の針によって作成された穴に挿入します。大腿骨に挿入された2番目の注射器に真空を当てながら、ゆっくりと回転させ、徐々に引き抜きます。抽出した骨髄を、シリンジの内容物を500マイクロリットルのPBSを含む冷却マイクロ遠心チューブに洗い流して移します。サンプルを氷の上に置いてください。イソプロパノール綿棒を使用して穿刺部位に 30 秒間穏やかな圧力を加え、出血を止めます。細胞を摂氏4度で5分間500Gで遠心分離します。真空吸引システムを使用して、上清を穏やかに吸引して廃棄します。蛍光細胞染色液のサンプルあたり200マイクロリットルを追加します。PBSで1〜100に希釈して、死んだ細胞を標識しました。ピペットで細胞をそっと再懸濁します。次に、光から保護して、氷上で細胞を10分間インキュベートします。10分後、細胞を500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。真空システムを使用して上清を吸引して廃棄し、2%ウシ胎児血清を含むPBSに1〜100に希釈したHCD 45ブリリアント紫外線395抗体のサンプルあたり100マイクロリットルを加えて、ヒト造血細胞を標識します。細胞を氷上で15分間インキュベートし、光から保護します。細胞を摂氏4度で5分間500Gで遠心分離します。真空システムを使用して上清を吸引して廃棄します。ペレットをPBS溶液中の1ミリリットルの1.6%ホルムアルデヒドに再懸濁します。光から保護して、室温で10分間インキュベートします。10分後、細胞を500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。真空システムを使用して上清を吸引して廃棄します。次に、摂氏マイナス20度で事前に冷却した100%メタノール1ミリリットルを2つに直接加えます。サンプルを摂氏マイナス20度で30分間インキュベートし、光から保護します。細胞を摂氏4度で5分間500Gで遠心分離します。真空システムを使用して、上清を吸引して廃棄します。各サンプルに50マイクロリットルの抗体混合溶液またはアイソタイプコントロール混合溶液を加えます。ピペットを使用して細胞をそっと再懸濁し、すべてのサンプルを摂氏4度で一晩インキュベートし、光から保護します。次に、細胞を摂氏4度で5分間500Gで遠心分離します。上清を廃棄した後、細胞をピペットで穏やかに再懸濁して、1000マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄します。細胞を再び500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を廃棄した後、1000マイクロリットルのPBSを使用して2回目の洗浄を行い、細胞をピペットで穏やかに再懸濁してから、細胞を摂氏4度で再度遠心分離します。上清を吸引した後、最終サンプルを200マイクロリットルのPBSに再懸濁します。この図は、ベネトクラクスベースの療法で15日間治療された急性骨髄性白血病患者由来の異種移植マウスの骨髄細胞における細胞内リンタンパク質シグナルのワークフロー、ゲーティング戦略、および正常化を示しています。ゲーティング戦略は、前方および側面散乱プロファイルとCD45陽性に基づいて、生存可能なヒト急性骨髄性白血病またはAML細胞を同定することに成功し、すべての治療グループにわたって一貫した分析を可能にしました。ベネトクラクス 5-アザシチジンと CDZ ウリジンの治療は、AML 細胞における STAT5 および RPS6 のリン酸化の増加をもたらし、耐性に関連する生存経路の活性化を示唆しています。興味深いことに、マウスにギルテリチニブを投与した場合、治療はFLT3経路タンパク質のリン酸化を有意に減少させず、標的療法にもかかわらずシグナル伝達が持続したことを示しています。リン酸化 STAT5 とリン酸化 RPS6 は、ベネトクラクスベースの治療後に発現レベルの相関関係が最も強く増加し、これらの経路の共活性化を示しています。

intracellular-phosphoflow-cytometry-acute-myeloid-leukemia-patient

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオは、白血病細胞における間質サイトカインによるタンパク質の細胞内リン酸化の評価を示しています。これらの細胞内リン酸化タンパク質は、リン酸化フローサイトメトリー技術を用いて定量されます。...

リン酸化フローサイトメトリーを用いた間質性サイトカイン誘導性細胞内タンパク質リン酸化の評価

フローサイトメトリーによる主な急性骨髄性白血病細胞白血病幹細胞マーカーの同時発現を検出するためのプロトコルの概要を説明します。3 前駆細胞集団と増加する成熟の程度と推定される LSC...

フローサイトメトリーを診断とフォローで主に急性骨髄性白血病、白血病幹細胞患者由来異種での見積もりに

実験マウスの同所性同種 PDAC 移植の診療には、腫瘍免疫微小環境のプロファイリングを目指しています。腫瘍は、手術を介して注入したがんです。200-600 mm3の大きさの腫瘍は、収穫され、異なる蛍光標識抗体を用いて免疫マルチ マーカー FACS...

同所性同種 (同系) マウスのプライマリ KPC 膵管腺癌のフローサイトメトリーによる診療

急性骨髄性白血病(AML)のマウスモデルから、マウスの健康な造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)におけるミトコンドリア活性酸素種(ROS)を検出するために多パラメータフローサイトメトリーを用いる方法について説明する。MLL-AF9.

マウス造血幹細胞および前駆細胞およびMLL-AF9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析

ヒトの原発性急性骨髄性白血病(AML)サンプルにおけるNKG2Dリガンド(NKG2DL)検出用の2つの異なる染色プロトコルを提示する。最初のアプローチは融合タンパク質に基づいており、既知であり、潜在的に未知のリガンドをすべて認識することができ、第2のプロトコルは複数の抗NKG2DL抗体の添加に依存する。...

急性骨髄性白血病におけるバルク亜集団と幹細胞を区別するNKG2Dリガンド表面検出の2つのフローサイトメトリックアプローチ

ここでは、急性リンパ芽球性白血病患者由来の異種移植片モデルを、CD19標的キメラ抗原受容体T細胞関連毒性を評価および監視するための戦略として使用するプロトコルについて説明します。...

急性リンパ芽球性白血病患者由来異種移植マウスモデルを用いたキメラ抗原受容体T細胞関連毒性の評価

細胞増殖染色を用いて、ゼブラフィッシュT急性リンパ芽球性白血病モデルにおける静止細胞を同定しました。染色は非分裂細胞に保持され、細胞増殖中に減少するため、さらなる調査のために休眠細胞を選択できます。このプロトコルは、細胞の静止の文脈で自己複製を研究するための機能的なツールを提供します。...

細胞増殖染色を用いたゼブラフィッシュT細胞急性リンパ芽球性白血病モデルにおける静止細胞の同定 

このプロトコールは、一過性免疫抑制ゼブラフィッシュ胚の細胞株および新鮮な患者材料からヒト急性リンパ芽球性白血病(ALL)異種移植片を作製およびトラブルシューティングするためのステップバイステップの手順と、フローサイトメトリーを使用した薬物反応評価のガイドラインを提供します。実験パイプラインは、固形腫瘍にも適応できます。...

ゼブラフィッシュ胚における白血病細胞移植片を用いた迅速な in vivo 薬物応答予測

このプロトコルは、注射の 4 日後に行われる患者由来の B および T 急性リンパ芽球性白血病 (ALL) 細胞の卵子異種移植...

Ovoに位置 患者由来急性リンパ芽球性白血病 (ALL) 細胞の異種移植 (PDX-ALL)

このビデオでは、マウスの骨髄から骨髄樹状細胞を区別するための手順を示しています。マウス脛骨と大腿骨、および骨髄の処理の分離が実証されています。細胞の表現型とのCpGを用いてIL -...

骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞の培養

学ぶ リン酸化流サイトメトリーによる急性骨髄性白血病細胞内シグナル伝達解析法。mTORC1・JAK/STAT5・MAPK経路の高感度測定で、標的治療開発に貢献する研究手法を習得できます。

急性骨髄性白血病患者由来異種移植の細胞内リン酸化流サイトメトリー

さらに動画を探す