心筋細胞のアライメントの変化を促進するためのマイクロパターン化された磁気レオロジーエラストマー

心筋細胞が機械的環境の動的可逆変化にどのように反応するかを調査しており、生体内で経験する剛性や構造の変動を模倣しています。MRE導入以来、私たちは循環器学の分野でいくつかの重要な研究を発表してきました。これらの材料を用いて、成人心筋細胞における硬性による肥大は微小管ネットワークに依存していることがわかりました。

最近では、心線維芽細胞およびiPSC由来心筋細胞における機械的記憶に関するさらなる情報が明らかになりました。磁気流質エラストマーの最も良い点は、そのシンプルさです。私たちのプロトコルは、見た目通りシンプルで、市販の製品が組み合わさって強力なものを作り出すだけです。

これは使いやすいアプローチで、最先端の科学を誰にでもアクセスできるようにします。これにより、特に心不全のように組織の力学が常に変化する疾患において、より現実的な疾患モデルの道が開かれました。また、研究者が高度に調整可能で動的かつ可逆的なより賢いバイオマテリアルを設計するのにも役立ちます。

私たちのチームは主に心臓病に注力してきましたが、最近ではMRE(軍用口糧)の動的で最も剛性の大きさの範囲を5キロパスカルから最大400キロパスカルに拡大しました。この突破口は、私たちの研究を拡大し、心臓以外の臓器に関する共同研究の扉を開きます。まず、ベース剤と硬化剤を10対1の比率で混ぜて、184ポリジメチルシロキサン(PDMS)10グラムを準備します。

184 PDMSを5グラムを35ミリのペトリ皿に注ぎます。その後、皿を乾燥機に入れ、泡がすべて消えるまで約5〜10分間デガスします。184 PDMSを60度のオーブンで30分間部分熟成させます。

硬化まで残り5分が残ったら、回折格子の表面にさらに184PDMSの薄層を塗布します。乾燥機に入れて約5分間脱ガスします。さて、部分的に硬化した184 PDMSを入れた35ミリペトリ皿をオーブンから取り出してください。

PDMS付きの回折格子を、ディテナ内の部分硬化した184PDMSに反転させます。回折格子を軽く押し、少量のPDMSが周囲に巻きつくまで押し当てます。残りの未硬化の184PDMSを使ってグレート周辺の皿を埋め戻し、硬化中に固定できるようにします。

その後、60度のオーブンに入れて1.5時間加熱します。熟成後は、おろし器をオーブンから取り出します。回折格子の周りにメスで切り込みを入れます。

回折格子の下に少量のイソプロピルアルコールを浸透させます。パターンに平行な方向にグレーティングをPDMSから外します。余分なPDMSは除去し、パターン化された部分だけを残します。

次にPDMSスタンプを希望のサイズに切ります。MRE皿のパターンの方向をマークしてください。シランで切手をコーティングするには、製造した184 PDMSスタンプを、模様のある表面を上向きにして酸素プラズマクリーナーに入れます。

表面を45ワットの酸素プラズマで30秒間処理します。処理済みの184PDMSスタンプを、排気フード内に設置した乾燥器に入れます。次に、マイクロ遠心分離機のチューブの蓋を破りましょう。

マイクロ遠心分離機の蓋を乾燥器内のPDMSスタンプの隣に置きます。マイクロ遠心機のチューブの蓋にシラン20マイクロリットルをピペットで注ぎます。乾燥器を閉じて真空を吸い込み、蒸気コーティングを開始します。

MREの調製では、シリコーンシンナーとECOエラストマーBの必要な量を測定します。これらをスピードミキサーで毎分2,500回転で1分間混ぜます。ECOエラストマーのAとカルボニル鉄粒子を加え、2,500回転毎分で1分間再度混合します。先端カットオフ付きのトランスファーピペットを使い、5グラムのMRE混合物を新しい35ミリペトリ皿に注入します。

乾燥機で約5分間脱ガスし、その後60度のオーブンで10分間部分的に硬化させます。硬化まで残り5分が残ったら、移送ピペットを使って未硬化のMREを加え、PDMSスタンプのパターン面をコーティングします。コーティングされた切手を乾燥器に入れて5分間脱ガスします。

半熟したMREの皿をオーブンから取り出します。ピンセットを使って、コーティングされたスタンプを裏返してMREの表面に押し付け、軽く押します。MRE皿のパターンの方向をマークしてください。

組み立て物を60度のオーブンに戻し、さらに25分間加熱します。材料が完全に硬化したら、メスで切手の下端にMRE(メス)をパターン線に垂直に刻みます。切手の周囲の切断部分に少量のイソプロピルアルコールを塗布します。

その後、ピンセットを使ってパターンと平行な方向にPDMSスタンプをMREから剥がします。MREの表面は70%エタノールで3回洗い、3回目の洗浄は20分間放置して滅菌します。その後、MREの表面を滅菌PBSで3回洗います。

MRE表面に10マイクログラム/ミリリットルのフィブロネクチンを、マグネシウムとカルシウムを含むPBSを37度の環境で1時間塗布し、細胞のデバイスへの接着を促進します。最後に、MRE表面をマグネシウムとカルシウムを含むPBSで3回洗浄し、新生児ラットの心筋細胞に密度20,000細胞/平方センチメートルでシードします。マスターモールドからMRE基板へのマイクロパターン転写の忠実度は、正規化された高さプロファイルと特徴のピッチおよび高さの定量的測定を通じてこの図で示されています。

Xプロファイル比較の結果、MREの正規化された特徴高さプロファイルはマスターモールドにほぼ一致していましたが、ピーク高さがやや低く、形状が広がっています。MRE基材の平均ピッチは約10マイクロメートルで、マスターモールドのピッチと有意な違いはありませんでした。MRE基材の平均特徴高さはマスターモールドよりも有意に低く、平均値はそれぞれ3.81マイクロメートルと5.49マイクロメートルでした。