インビトロ H5N1特異的アヒルT細胞の培養と細胞内サイトカイン染色法による免疫応答の検出

H5N1特異的アヒルT細胞を培養し、細胞内サイトカイン染色を用いてIFN-γ分泌を定量化するためのin vitroプロトコルを確立することを目指しています。最近の研究では、ウイルス感染の制御における鳥のT細胞免疫の重要性が強調されていますが、アヒルの標準化された培養方法はまだ不足しています。私たちは、H5N1特異的アヒルT細胞の培養に成功し、アヒルのIFN-γ発現を検出するための新しいフローセグメントベースのICSプロトコルを開発しました。他の家禽種における抗原特異的T細胞応答を調査し、ワクチン評価と抗ウイルス研究のための鳥免疫学的ツールを開発します。

[ナレーター]まず、28日前にH5N1ウイルスに感染したアヒルから記憶末梢血単核細胞(PBMC)を分離し、単離された細胞の濃度を10の3倍の6細胞/ミリリットルの6乗に調整します。次に、1 ミリリットルの培地を 48 ウェルプレートの各ウェルに分注します。次に、H5N1鳥インフルエンザウイルスをPBMCに感染の多重度5で添加して細胞を同時感染させ、共培養を摂氏37°Cで1時間インキュベートします。15 分ごとにプレートを手で軽く振って、均一に分散するようにします。感染から1時間後、PBMCをPBSで2回洗浄して、結合していないウイルス粒子を除去します。洗浄したPBMCを1ミリリットルのT細胞培地に再浮遊し、懸濁液を摂氏37°で5時間インキュベートします。次に、細胞を室温で440 x g で5分間遠心分離します。ペレット化された抗原提示細胞(APC)を100マイクロリットルのT細胞培養培地に再懸濁し、再懸濁したAPCをエフェクター細胞に1〜5の比率で添加します。次に、共培養物を摂氏37度の5%二酸化炭素雰囲気中で14日間インキュベートします。2日ごとに、ピペットで上清の半分を取り除きます。細胞を含む使用済み培地を廃棄し、同量の新鮮なT細胞培地を追加します。7日目に、光学顕微鏡で細胞を100倍で観察します。メモリAPCの別のセットをPBSで処理し、これらを刺激されていない対照群として使用します。7日目に、H5N1特異的T細胞の培養物をインキュベーターから取り出し、チューブ内の各ウェルからすべての細胞を回収します。次に、インキュベートしたAPCとブレフェルジンAを1〜1000希釈でエフェクターセルに加え、摂氏39度のインキュベーターで6時間共インキュベートします。次に、細胞を清潔な遠心分離管に移し、室温で440 x g で5分間回転させます。遠心分離後、上清を廃棄します。マウス抗アヒルCD8抗体を含む抗体カクテル100マイクロリットルを細胞に加え、摂氏4度の暗所で30分間インキュベートします。ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁します。細胞を摂氏4°Cで5分間400 x g で遠心分離します。上清を廃棄した後、FITC結合ヤギ抗マウスIgG2b抗体を加え、4°Cの暗所で30分間インキュベートします。次に、細胞を摂氏4°Cで5分間、400 x g で再度回転させます。上清を廃棄した後、細胞を100マイクロリットルの固定バッファーに再懸濁し、混合物を摂氏4°Cの暗所で20〜25分間インキュベートします。次に、前述のように、1ミリリットルの1x透過処理バッファーで細胞を2回洗浄します。次に、上清を廃棄し、細胞を100マイクロリットルの透過処理バッファーに再懸濁します。細胞を1〜10に希釈したマウス抗アヒルIFN-γ抗体とともに、摂氏4°Cの暗所で30分間インキュベートします。細胞を洗浄した後、1〜250に希釈したPE結合ヤギ抗マウスIgG3抗体100マイクロリットルを加え、摂氏4度の暗所で30分間インキュベートします。最後に、FlowJoソフトウェアを使用して処理されたサンプルを分析します。抗原提示細胞との共培養後、ウイルス特異的T細胞はクラスター増殖を示し、増殖の成功を示しました。カルボキシフルオレセインサクシンイミジルエステル標識により、刺激されたサンプル中の細胞分裂の複数のピークが明らかになり、アヒルのメモリーT細胞の広範な増殖が確認されました。CD4+およびCD8+ T細胞の割合は、14日後にH5N1刺激培養物で非刺激対照よりも有意に高かった。培養7日目の増殖T細胞は、グランザイムAやインターフェロンガンマなどの細胞毒性関連遺伝子の発現の上昇を示し、細胞傷害性表現型を示しました。フローサイトメトリーにより、抗原刺激後のCD8高T細胞集団とCD8低T細胞集団の両方におけるインターフェロンガンマ陽性細胞の割合が大幅に増加することが明らかになりました。