Name: インビトロ H5N1特異的アヒルT細胞の培養と細胞内サイトカイン染色法による免疫応答の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 学ぶH5N1特異的アヒルT細胞のインビトロ培養と細胞内サイトカイン染色法によるIFN-γ産生の定量。流式細胞計測を用いた鳥類免疫応答の解析手法を確立し、家禽のウイルス感染防御メカニズムの理解に貢献する。

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<ol><li>Almeida, L., Lochner, M., Berod, L., Sparwasser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathways+in+T+cell+activation+and+lineage+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathways in T cell activation and lineage differentiation.</a> Semin Immunol. 28 (5), 514-524 (2016).</li>
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<li>Faulkner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+in+vitro+culture+methods+to+characterize+primary+T-cell+responses+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">The development of in vitro culture methods to characterize primary T-cell responses to drugs.</a> Toxicol Sci. 127 (1), 150-158 (2012).</li>
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<li>Ding, H., Wang, G., Yu, Z., Sun, H., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+interferon-gamma+%28IFN-%CE%B3%29+and+IFN-%CE%B3+receptor+1%2F2+%28IFN%CE%B3R1%2F2%29+in+regulation+of+immunity%2C+infection%2C+and+cancer+development%3A+IFN-%CE%B3-dependent+or+independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Role of interferon-gamma (IFN-γ) and IFN-γ receptor 1/2 (IFNγR1/2) in regulation of immunity, infection, and cancer development: IFN-γ-dependent or independent pathway.</a> Biomed Pharmacother. 155, 113683(2022).</li>
<li>Gong, Z., Li, Q., Shi, J., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Artifact+in+Intracellular+Cytokine+Staining+for+Studying+T+Cell+Responses+and+Its+Alleviation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">An Artifact in Intracellular Cytokine Staining for Studying T Cell Responses and Its Alleviation.</a> Front Immunol. 13, 759188(2022).</li>
<li>Yu, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+assays+show+human+gamma-delta+T+cells+specific+for+common+allergens+are+Th1-polarized+in+allergic+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo assays show human gamma-delta T cells specific for common allergens are Th1-polarized in allergic donors.</a> Cell Rep Methods. 2 (12), 100350(2022).</li>
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<li>Letsch, A., Scheibenbogen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+characterization+of+specific+T-cells+by+antigen-specific+cytokine+production+using+ELISPOT+assay+or+intracellular+cytokine+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining.</a> Methods. 31 (2), 143-149 (2003).</li>
<li>Dai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duck+CD8%28%2B%29+T+Cell+Response+to+H5N1+Highly+Pathogenic+Avian+Influenza+Virus+Infection+In+Vivo+and+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Duck CD8(+) T Cell Response to H5N1 Highly Pathogenic Avian Influenza Virus Infection In Vivo and In Vitro.</a> J Immunol. 209 (5), 979-990 (2022).</li>
<li>Jabbari, A., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+and+modulation+of+antigen-specific+memory+CD8+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The generation and modulation of antigen-specific memory CD8 T cell responses.</a> J Leukoc Biol. 80 (1), 16-23 (2006).</li>
<li>Puleo, A., Carroll, C., Maecker, H. T., Gupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+Using+Vacutainer+Cellular+Preparation+Tubes+%28CPT%28TM%29%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Vacutainer Cellular Preparation Tubes (CPT(TM)).</a> Bio Protoc. 7 (2), e2103(2017).</li>
<li>Chometon, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rapid+monocyte+isolation+and+generation+of+singular+human+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells.</a> PLoS One. 15 (4), e0231132(2020).</li>
<li>Qin, S., Zhang, Y., Tian, Y., Xu, F., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+metabolomics%3A+Isolation%2C+measurement%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Subcellular metabolomics: Isolation, measurement, and applications.</a> J Pharm Biomed Anal. 210, 114557(2022).</li>
<li>Pertoft, H., Johnsson, A., Wärmegård, B., Seljelid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+human+monocytes+on+density+gradients+of+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Separation of human monocytes on density gradients of Percoll.</a> J Immunol Methods. 33 (3), 221-229 (1980).</li>
<li>Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. W., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+proteasomes+function+to+increase+viral+peptide+diversity+and+broaden+antiviral+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mixed proteasomes function to increase viral peptide diversity and broaden antiviral CD8+ T cell responses.</a> J Immunol. 191 (1), 52-59 (2013).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dominant+CD4%28%2B%29+T-cell+response+to+Helicobacter+pylori+reduces+risk+for+gastric+disease+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A dominant CD4(+) T-cell response to Helicobacter pylori reduces risk for gastric disease in humans.</a> Gastroenterology. 144 (3), 591-600 (2013).</li>
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<table><tbody><tr><td>1.5 mL MICRO遠心分離管</td><td>Biosharp</td><td>Cat#BS-15-M</td><td></td></tr><tr><td>15 mL遠心分離管</td><td>Labselect</td><td>Cat#CT-002-15A</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール(55 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>48ウェル組織培養プレート(未処理、平底)</td><td>Biofil</td><td>Cat#TCP000048</td><td></td></tr><tr><td>50 mL遠心分離管</td><td>Labselect</td><td>Cat#CT-002-50A</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルアンスカートqPCRプレート</td><td>Labselect</td><td>Cat#PP-96-NS-0100</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm kit</td><td>BD Bioscience</td><td>Cat#BD 554714</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A (BFA)</td><td>BD Bioscience</td><td>Cat#347688</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養 CO2 インキュベーター</td><td>Thermo Fisher</td><td>Heracell 150i GP</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>CFSE標識キット</td><td>Abcam</td><td>Cat#ab113853</td><td></td></tr><tr><td>ChamQ SYBR qPCR マスターミックス</td><td>Vazyme</td><td>Cat#Q341-02</td><td></td></tr><tr><td>アヒル末梢血リンパ球分離キット</td><td>Tbdscience</td><td>Cat#LTS1090D</td><td></td></tr><tr><td>Evo M-MLV RT Premix</td><td>Accurate Biotechnology</td><td>Cat#AG11706</td><td></td></tr><tr><td>FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolationキット V2</td><td>Vazyme</td><td>Cat#RC112-01</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>Cat#10437-028</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>Beckman Coulter</td><td>BA43347</td><td></td></tr><tr><td>フローチューブ</td><td>Beyotime</td><td>Cat#FFC005</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.8.1</td><td>Tree Star</td><td>https://www.flowjo.com</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse 488、1:50 希釈</td><td>Abbkine</td><td>Cat#A23210</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG2b、FITC、1:50 希釈</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat#1091-31</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG3、PE、1:250 希釈</td><td>Southern Biotech&nbsp;</td><td>Cat#1100-09S</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad プリズム 8.0.2</td><td>GraphPad ソフトウェア</td><td>https://www.graphpad-prism.cn</td><td></td></tr><tr><td>H5N1 AIV 株 DK383</td> 人<td>獣共通感染症予防および制御の医療のための国立および地域共同工学研究所</td><td>A/Duck/Guangdong/383/2008</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>Cat#25030081</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Motic</td><td>AE2000</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗アヒルCD4、1:50希釈</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat#MCA2478</td><td></td></tr>マウス<tr><td>抗アヒルCD8&α;、1:50希釈</td><td>GeneTex&nbsp;</td><td>Cat#GTX41834</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗アヒルIFN-&ガンマ;mAb、1:10希釈</td><td>当研究室で調製&nbsp;</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One 分光光度計</td><td>Thermo Fisher</td><td>AZY1603209</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (非必須</td><td>Gibco</td><td>Cat#11140-050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>Cat#10010023</td><td></td></tr><tr><td>PCR サーマルサイクラー</td><td>Biometra Biometra</td><td>Tone 96G</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン溶液</td><td>Gibco</td><td>Cat#15070063</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ABI7500</td><td></td><td>組</td></tr><tr><td>換えヒト IL-2 (10 &g)</td><td>USCNK</td><td>Cat#RPA111Ga01</td><td></td></tr><tr><td>赤血球溶解バッファー</td><td>TBDSCIENCE</td><td>Cat#NH4CL2009</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>Cat#11875-119</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>Cat#11360-070</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>Cat#93595</td><td></td></tr> 生<tr><td>後 2 週間のマガモ (シェルドレイク)</td>ア<td>ヒル農場広州</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> NA

インビトロ h5n1特異的アヒルt細胞の培養と細胞内サイトカイン染色法による免疫応答の検出

In Vitro Culture for H5N1-Specific Duck T Cells and Detection of Immune Responses Using Intracellular Cytokine Staining Method

このプロトコルは、アヒル20における抗原特異的T細胞エフェクター応答の検出に関する以前の研究に基づいて開発されました。実験の最初のステップは、その後のエフェクター応答研究の基礎となるウイルス特異的T細胞の in vitro 培養です。最初に、APCをインキュベートし、エフェクター細胞と共培養しました。形態学的観察により、増殖後、細胞はクラスター増殖を示すことが明らかになりました(図2A)。CFSE標識は、細胞分裂の複数のピークを示すことにより、増殖の成功をさらに確認しました(図2B)。最後に、アヒル特異的細胞マーカーCD8/CD4を用いて細胞20の割合と絶対数を評価し、抗原特異的T細胞の in vitro 培養が成功したことを確認しました(図2C)。
培養7日目に、細胞を採取...

インビトロ H5N1特異的アヒルT細胞の培養と細胞内サイトカイン染色法による免疫応答の検出

The in vitro culture of T cells is a critical method for studying immune responses, viral infections, and potential therapeutic strategies. However, no ...

in-vitro-culture-for-h5n1-specific-duck-t-cells-detection-immune

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Immunology and Infection

免疫学と感染症

無細胞HIV-1粒子とは異なり、感染したCD4 + T細胞を効果的に形質細胞様樹状細胞（pDC）によって感知されます。この原稿は、I型​​IFNの放出によって評価した末梢血単核細胞（PBMC）または単離されたpDCは、pDCにすることにより先天的センスを評価するためにHIV-1感染T細胞と共培養する方法が記載されています。...

HIV-1感染CD4の生得センシングを評価<sup&gt; +</sup&gt;使用して形質細胞様樹状細胞によるT細胞<em&gt;エクスビボ</em&gt;共培養系。

インビボで詳細に T細胞応答をモニターする能力は、免疫応答の我々の理解の開発のために重要である。ここでは、フローサイトメトリーで同時に&gt; 250のパラメータを評価するin vivoでの T細胞アッセイにおける蛍光の標的配列（のFTA）の使用を記載している。...

T細胞応答の評価のための蛍光ターゲット配列の使用<em&gt;インビボ</em

2つのフローサイトメトリーベースの方法 - in vitro...

西ナイルウイルス変異株の感染に対するMyD88非介在細胞性免疫応答のインビトロ分析

ワクチンがどのように機能するかについての知識は全体的に不足しています。ここでは、逆遺伝学と骨髄キメラマウスの併用を提案するとともに、樹状細胞とT細胞免疫に特に焦点を当てて、ワクチンに対する初期の宿主免疫応答についての洞察を得ることを提案します。...

キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、

インフルエンザ A ウイルス (IAVs) は、重要な人間の呼吸器病原体です。IAVs の病原性を理解して新しいワクチン接種のアプローチの臨床テストを実行するには、人間の生理を模倣した動物モデルが必要です。ここでは、IAV...

感染症のマウスモデルでの A 型インフルエンザ ウイルス研究

インフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンを対象とする抗体による Fc を介したエフェクターの機能の活性化を測定する手法を提案します。この試金は、Fc...

インフルエンザ血球凝集素抗体による Fc を介したエフェクター機能を評価する方法

モルモット PBMCs のインターフェロン-γ しなさい測定法の開発では、感染症を研究するためこの関連性の高いモデルで T 細胞の反応特性をことができます。我々 は、関連付けられている DNA ワクチンの皮内送達 T...

ワクチン接種後のモルモット モデル メジャー T 細胞反応に最適化されたインターフェロン-γ しなさいアッセイ

本論文では、インフルエンザウイルス感染のマウスモデルにおけるTfhおよびGC...

マウスにおけるインフルエンザAウイルス感染時のT濾胞ヘルパー細胞と胚葉センター応答の評価

このプロトコルは、2つのインフルエンザA株からエンベロープ糖タンパク質を有する高力性ウイルス性偽型粒子(pp)を生成する実験プロセスと、その感染性を決定する方法を記述する。このプロトコルは、異なるエンベロープ糖タンパク質を持つエンベロープウイルスの他のタイプのppsを開発するために非常に適応性があります。...

高病原性H5N1および鳥類H7N9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産

このプロトコルは、ウイルス感染した鼻上皮細胞と先天性細胞活性化との間の初期の相互作用の調査を詳述する。免疫細胞の個々のサブセットは、ウイルス感染に応答したそれらの活性化に基づいて区別することができる。その後、それらをさらに調査して、早期の抗ウイルス反応に対するそれらの効果を決定することができる。...

呼吸器ウイルス感染時の自然免疫細胞活性化研究のための非接触共培養モデル

ここでは、偽ウイルスパッケージングのプロトコルと抗体中和活性の測定について述べる。...

リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いた擬似型H5鳥インフルエンザウイルスの作製と抗体中和活性の測定

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