ハイスループット足場ベースの培養プラットフォームとしてのSPOTの再現性のある製造

私たちの研究は、薬物スクリーニングアッセイのワークフローを改善し、高度な疾患モデリングを支援するために、堅牢で再現性のある患者由来のオルゴノミクス培養のためのハイスループットの足場支持プラットフォームの開発に焦点を当てています。

自動リキッドハンドラー、足場支持ヒドロゲルプラットフォーム、オルガンオンチップ技術、フローサイトメトリーやCYTOPなどの単一細胞アッセイは、現在利用可能な技術の一部である。

現在の課題には、ヒドロゲルの完全性の維持、リアルタイムイメージングのためのゲルメニスカスの克服、長期のオルガノイドベースのアッセイにおける均一な細胞分布の確保などがあります。

当社のプロトコルは、一貫した足場で支持されたヒドロゲルのローディングを可能にし、メニスカスの問題を最小限に抑え、長期のオルガノイド培養をサポートし、自動リキッドハンドラーおよびハイコンテントイメージングシステムとスムーズに統合します。

私たちは、疾患モデリングプラットフォームを使用して、がんにおける疾患の進行メカニズムと肥満の発症を調査することに最も興奮しています。

[講師]まず、96または384 SPOTのPMMAパターン足場を取ります。足場の青い領域の周りの余分な紙を切り取り、周囲に 5 ミリメートルの白い余白を残します。得られたシートのサイズが約 760 ミリメートル x 1,300 ミリメートルであることを確認します。組み立て用の 96 SPOT 足場を準備するには、硬いアクリル サポートの上にポリエチレン フィルムを置きます。このフィルムで覆われたサポートを作業面に置き、ポリエチレンフィルムの上に足場を置きます。足場の最初の 2 列の間に定規の端を合わせて、井戸にトレースされないようにします。トレースホイールを足場の下部に置き、定規の誘導を受けながら上に転がします。384 SPOT足場の場合は、ミシン目を行わないでください。次に、粗い面を上に向けて足場を PDMS スラブの上に置き、列が水平になるようにします。プライミングラインを使用してどちら側が粗いかを判断し、足場をスラブの上に滑らかにしてしわや気泡を取り除きます。両面テープの刻印されていない面から保護層を剥がします。テープを中央に少し留め、テープの中央の2列を足場に合わせます。次に、テープの中央を足場に押し付けて位置を合わせます。テープを中心から外側に滑らかにして均一に貼り付けます。ピンセットを使用して、足場をPDMSスラブからそっと持ち上げます。将来の使用のためにスラブを保管してください。足場を2番目のウェルテープに取り付けるには、足場を裏返して、テープで留められていない滑らかな面が作業台を上に向くようにします。2 番目のテープの刻印面から中央の保護層を取り外して、中央の 2 つの柱を露出させます。2 番目のテープの中央を少しバックルで締め、足場の中央の柱に合わせ、テープの中心を押して所定の位置に固定します。刻印テープを使用する場合は、露出した中心に隣接する残りの保護層を除去します。テープを真ん中から外側に向かって滑らかにします。足場を底なしプレートに取り付けるには、保護層を取り外します。底なしプレートの下の足場を蓋で合わせます。位置合わせしたら、その中央をプレートに押し下げます。刻印テープを使用する場合は、隣接する層を取り除き、足場をプレートの中心から外側に滑らかにします。足場をポリカーボネートフィルムに取り付けるには、ピンセットを使用してポリカーボネートフィルムの片側から保護層を慎重に緩め、フィルムにくぼみを作らずに保護層をゆっくりと剥がします。2面目もこのプロセスを繰り返し、フィルムを作業台に置いておきます。プレートの底から保護テープ層を剥がし、ポリカーボネートフィルムを中央から外側に向かって足場に押し付けます。次に、ポリカーボネートフィルムを足場にしっかりと押し付けて、各ウェルに明確な境界が設定されていることを確認します。精密ナイフを使用して、プレートの底から余分な材料を慎重に切り取ります。完全に組み立てられたら、96 SPOTプレートを透明で再密封可能なビニール袋に入れ、バイオセーフティキャビネットの外に持ち出します。プレートの下に硬いアクリルサポートを置き、両方を反対側の角でクランプします。プレートは、さらに使用するまで清潔で乾燥した場所に保管してください。384 SPOTプレート内の交互ウェルを30日間の試験期間中にフルオレセインとPBSで充填した場合、培地の漏れや交換は観察されず、ウェル間分離の維持におけるPMMAバリアの有効性が確認されました。96枚のSPOTプレートに播種されたGFP発現膵臓腫瘍オルガノイドは生存性を維持し、培養の0日目から12日目まで徐々に増殖しました。12日目に、SPOT増殖オルガノイドは、内部内腔構造の存在とともに、強力なサイトケラチン19およびオクルーデン帯-1の発現を示しました。384枚のSPOTプレートにおける次善および最適の組織播種結果は、エッジの定義と細胞分布の均一性によって視覚的に区別できました。自動リキッドハンドラーを使用して、96 SPOTプレートと384 SPOTプレート全体で一貫して均一な播種が達成されました。