Name: ハイスループット足場ベースの培養プラットフォームとしてのSPOTの再現性のある製造 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: 学ぶSPOTプラットフォームの製造法。96/384ウェル形式の足場ベース培養システムを作製し、自動液体ハンドラーを用いた細胞播種技術を習得できます。創薬スクリーニングやオルガノイド培養の再現性向上に貢献します。

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<ol><li>Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Cell+Culture%3A+A+Breakthrough+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Cell Culture: A Breakthrough in vivo.</a> Int J Mol Sci. 16 (3), 5517-5527 (2015).</li>
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<li>Young, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRACER+3D+Co-Culture+tumour+model+for+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A TRACER 3D Co-Culture tumour model for head and neck cancer.</a> Biomaterials. 164, 54-69 (2018).</li>
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</ol>

生物医学研究の進歩にもかかわらず、生理学的に関連する in vitro アッセイの開発は依然として困難です。理想的なアッセイは、さまざまな分野の研究者のニーズを満たすために、多様な細胞タイプ、治療製剤、タイムスケール、市販機器、分析読み出しに対応する必要があります。しかし、適切なツールが不足しているため、研究者は不死化細胞株の2D単層などの単純なモデルに依存することが多く、特にがん研究において、複雑さと臨床的関連性を要約できません1,2。これに対処するために、大規模な腫瘍バイオバンキングと臨床医の協力により、細胞株と比較してより患者固有の遺伝的および治療的プロファイルを保持する患者由来腫瘍オルガノイド(PDO)などの忠実度の高いin vitroモデルの開発が推進されています3,4,5。一方、ラボの自動化と創薬の進歩により、ハイスループット ワークフローにシームレスに統合できるプラットフォームが求められています。既存のプラットフォームは生物学的忠実度またはスケーラビリティのいずれかに対処していますが、両方の課題を同時に解決できるものはほとんどありません6,7,8。主要な疾患の特徴を再現する自動化されたハイスループットモデルの開発は、生物医学研究を進歩させ、トランスレーショナルアプリケーション向けのデータ生成を加速するために不可欠です。
多くの新しいモデルは、PDOなどの特殊な細胞型をハイスループットで培養することに関連する課題に対処することを目的としています(図1)。オルガノイドを96ウェルまたは384ウェルプレートでヒドロゲルと混合する標準プラットフォームには、いくつかの制限があります:(i)細胞ゲルの体積が多いと栄養素のアクセスが一貫しない、(ii)メニスカスの曲率がイメージングアーティファクトと細胞勾配を生み出す、(iii)ヒドロゲル播種はバッチや人員間で均一性を欠いており、(iv)自動製造および自動顕微鏡との非互換性、(v)通常は柔らかく壊れやすいリスクサンプルである細胞外マトリックス(ECM)の使用生理学的組織密度での破壊または収縮性細胞型の取り込み 1,9。現在、プレートベースのPDO研究の大部分は、細胞ゲルをプレート10,11に手動で播種するか、ヒドロゲルを粘度の低い培地で希釈し、細胞をウェル底に遠心分離して適切な光学面12,13に配置するゲルオーバーレイ法のいずれかによって実施されています.どちらのアプローチも、長期的な培養のための機械的サポートを提供できません。以前の観察(未発表データ)に基づくと、標準ウェルプレート内の細胞と混合された市販のヒドロゲルは、12ウェルのうち9ウェルで12日間にわたってウェルの表面から収縮しますが、ゲルオーバーレイ法には生理学的細胞とマトリックスの相互作用が欠けています。さらに、得られた培養物は、ウェル内のスペースの制限により長期間維持することができず、高い試薬対細胞培地比を必要とするアッセイと互換性がありません14,15,16。これらの実際的な障壁は 3D モデルの採用を妨げ、現場全体での実験の再現性を制限します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68405/68405fig1.jpg"> 
図1:スケーラビリティと生物学的関連性に基づく培養モデルの評価。 プレートスループットと生物学的関連性(x軸)によって定義されるスケーラビリティ(y軸)に沿ったさまざまな in vitro および in vivo 培養システムの相対的な位置付けは、スループットの可能性と生理学的忠実度の間のトレードオフを強調しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68405/68405fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
これらの課題に動機付けられて、薄いセルロース足場の高い気孔率と機械的強化を利用して、96ウェルと384ウェルの両方のフォーマットで利用可能なオルガノイドベースの組織用足場支持プラットフォーム(SPOT)を開発しました。SPOTは、プレートレイアウトに一致する以前に開発された浸潤法17を使用してポリマーのプレパターン足場を組み込んでおり、正確な細胞ゲル液滴の配置を可能にし、ヒドロゲル相の構造的サポートを提供します(図2A)。足場への毛細管吸湿発散性は、細胞ゲル溶液を導き、機械的に強制された生体複合ネットワークを形成します(図2B)。足場の多孔質構造により、細胞ゲルが浸透して薄い層(厚さ約70μm)を形成し、ウェル14の底を覆うために必要な細胞ゲルの量が10倍少ない。SPOT と播種膵管腺癌 (PDAC) PDO との適合性は、代謝アッセイと画像ベースの測定を使用してそれらの成長を評価することによっても実証されました。SPOTは開発以来、オルガノイド培養に携わる研究者にとって大きな汎用性と使いやすさを実証してきました。さらに、SPOTの設計は、平らでメニスカスのないミクロゲル形状により、試薬量の削減とイメージング機能の向上により、ユーザーフレンドリーな拡張性に対応し、均一な光の透過と正確なハイコンテントイメージングを保証します14(図2C、D)。SPOTは、線維芽細胞などの他の関連細胞型との共培養もサポートし、腫瘍微小環境をよりよく再現します18。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68405/68405fig2.jpg"> 
図2:96-SPOTデバイスと画像解析ワークフローの概要。 (A)SPOTプレート製造の概略図:デバイスは、両面ポリアクリル接着剤(黄色で表示)の層を使用して、市販の底なしウェルプレート(上)、PMMAパターンの足場(青で表示)、およびポリカーボネートフィルム(下)を照合することによって組み立てられます。(B)足場ウェルへの細胞播種:細胞を非重合ヒドロゲル(ピンク色で表示)に懸濁し、足場に浸透する各ウェルにピペットで浸透させます。次に、ヒドロゲルをゲル化させて、足場で支持されたヒドロゲル内に細胞をカプセル化します。(C)顕微鏡検査:得られた微小組織は、自動広視野顕微鏡を使用して画像化できます。(D)画像ベースの分析:ゲル中に懸濁した蛍光細胞(緑色)の取得画像は、標準的な画像分析パイプラインを使用して分析できます。1つの96-SPOTウェルにおけるGFP発現KP4細胞の代表的な落射蛍光顕微鏡画像。スケールバーは500μmです。この数値は14から修正されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68405/68405fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
SPOTのもう一つの利点は、システムをオープンソースのリキッドハンドラーと統合できるため、PDO培養物の自動化された再現性のある作製を容易にすることです。この進歩により、ユーザーのばらつきが減り、ハイスループット薬物スクリーニングや個別化医療アプローチなどの複雑な実験計画がサポートされます18。SPOTは、不均一な腫瘍環境における細胞表現型の単一細胞ベースの多重特性評価、および消化によるSPOTからのオンデマンド細胞の回収と互換性があることも以前に示されました18。これらの機能により、SPOTは、生理学的に関連する条件下での薬効と細胞挙動を評価するために縦断的な高解像度データが不可欠なスクリーニングアプリケーションのための汎用性の高いツールとして位置づけられています14,18。これらの技術革新を組み合わせることで、SPOTは従来の3D培養システムの重大な制限に対処します。
このプロトコルは、堅牢で再現性のある3Dオルガノイド培養のためのSPOTコンポーネントの作製、プレートの組み立て、および播種方法のための包括的なガイドを提供します。マイクロピペットを使用した手動プレート播種と、96ウェルと384ウェルの両方のフォーマットをサポートするリキッドハンドラーによる自動播種ワークフローの詳細な手順が含まれています。さらに、このプロトコルでは、高い実験基準を維持するために、均一なゲル分布や足場の完全性の検証など、重要な品質管理措置の概要が説明されています。不完全なゲル浸潤、播種中の蒸発、足場の剥離などの一般的な問題に対処するためのトラブルシューティング戦略も提供され、研究者がワークフローを最適化し、信頼できる結果を達成するための実用的なソリューションを提供します。
SPOTは、ゲルの完全性を維持しながらアッセイの実施や培地の変更に関連する課題など、従来のオルガノイドアッセイが直面するギャップを埋めるように設計されています10,11,12,13。この方法の全体的な目標は、12日間にわたってオルガノイド培養をサポートする足場支持プラットフォームを製造することです。さらに、この方法は、手動またはリキッドハンドラー支援播種によるSPOTでの組織アレイの生成もカバーしており、ユーザーは薬物IC50アッセイや低分子スクリーニングなどの下流の摂動を実行できます。

<table><tbody><tr><td>0.2mL PCRチューブ(8本入り)&nbsp;</td><td>ザルシュテット</td><td>72.985.002</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL遠心分離管</td><td>フロッガバイオ</td><td>LMCT1.7B</td><td></td></tr><tr><td>1000-&ミュー;Lピペットチップ</td><td>食</td><td>4-1019-260-000</td><td></td></tr><tr><td>10mL血清ピペット</td><td>フロッガバイオ</td><td>394010</td><td></td></tr><tr><td>10mLシリンジ</td><td>BD, カナダ</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>10x 最小必須培地 (MEM 10x)</td><td>ギブコ</td><td>11430030</td><td></td></tr><tr><td>150mm皿</td><td>コーニング</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロック接続付き16ゲージディスペンスチップ</td><td>米国イリノイ州マクマスターカー</td><td>6699A2</td><td></td></tr><tr><td>20&マイクロ;Lフィルターチップラック</td><td>オープントロン</td><td>999-00099</td><td></td></tr><tr><td>200&マイクロ;Lフィルターチップラック</td><td>オープントロン</td><td>999-00081</td><td></td></tr><tr><td>200-&ミュー;Lピペットチップ</td><td>食</td><td>4-1030-260-000</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロック接続付き20ゲージディスペンスチップ</td><td>米国イリノイ州マクマスターカー</td><td>6699A4</td><td></td></tr><tr><td>384ウェル底なしウェルプレート(黒)</td><td>グライナー</td><td>82051-544</td><td></td></tr><tr><td>3mLシリンジ&nbsp;</td><td>BD, カナダ</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>50mLポリプロピレン製コニカル遠心分離管</td><td>VWRの</td><td>CA21008-940</td><td></td></tr><tr><td>50mLポリプロピレン製コニカル遠心分離管</td><td>VWRの</td><td>CA21008-940</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル無底ウェルプレート(黒)</td><td>グライナー</td><td>82050-714</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A18-1</td><td></td></tr><tr><td>分析天びん</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>Inkscape の AxiDraw 拡張機能 (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>AxiDraw Python API (https://axidraw.com/doc/py_api/#installation)&nbsp;</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>AxiDraw V3 高性能個人用筆記および描画機</td><td>Evil Mad Scientists、アメリカ</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>ウシコラーゲン(PureCol 3 mg/ml)</td><td>アドバンストバイオマトリックス</td><td>5005</td><td></td></tr><tr><td>選択した細胞株</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>クリップイーゼル(AxiDraw V3パッケージに含まれています)</td><td>Evil Mad Scientists、アメリカ</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>最適な培地</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>汚れを捕らえる保護テープ</td><td>3メートル</td><td>6851 PN36851</td><td></td></tr><tr><td>両面ポリアクリル粘着テープ(800mm×1200mm)</td><td>接着剤研究、ARcare</td><td>90106NB</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>ギブコ</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>フィナムティーフィルターXL&nbsp;</td><td>リエンシュ&リエンシュHeld GmbH &Co. KG、ハンブルク、ドイツ</td><td>420.69.00</td><td></td></tr><tr><td>0.2mL PCRチューブ用フラットキャップ(8本入り)</td><td>ザルシュテット</td><td>65.989.002</td><td></td></tr><tr><td>頑丈なプラスチックスプリングクランプ</td><td>ベンチマーク</td><td>1024-554</td><td></td></tr><tr><td>HEPAモジュール&ndash;110-130V 60Hzモデル</td><td>オープントロン</td><td>999-00109</td><td></td></tr><tr><td>保冷剤(冷凍、1400mm×1800mm)</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>Inkscapeソフトウェア</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>レーザーカッター</td><td>ユニバーサルレーザーシステム</td><td>VLS3.75</td><td></td></tr><tr><td>外径0.07インチのミニチュア酢酸エチルビニル(EVA)チューブ</td><td>米国イリノイ州マクマスターカー</td><td>1883T3</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネル電動ピペット P20 (Gen2)</td><td>オープントロン</td><td>999-00005</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネル電動ピペット P300 (Gen2)</td><td>オープントロン</td><td>999-00006</td><td></td></tr><tr><td>ネールポリッシュ</td><td>サリー・ハンセン</td><td>SBS-006861</td><td>オプション、PMMAインクの着色用</td></tr><tr><td>オープントロン OT-2</td><td>オープントロン</td><td>999-00111</td><td></td></tr><tr><td>P1000ピペット</td><td>ギルソン</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>P200 8チャンネルピペット</td><td>ギルソン</td><td>F144072</td><td></td></tr><tr><td>P200ピペット</td><td>ギルソン</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>ペーパータオル</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>株式会社ベミスカンパニー</td><td>52859-079</td><td></td></tr><tr><td>クッキングシート&nbsp;&nbsp;</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>VWRの</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(メタクリル酸メチル)(PMMA)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>182230</td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネートフィルム(760mm×1300mm)</td><td>マクマスター・カー</td><td>85585K102</td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサンモノマーおよび架橋剤(PDMS、1500 mm x 2700 mm)</td><td>エルズワース接着剤</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>精密ナイフ</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>硬質アクリルサポート(ウェルプレートの底にフィットするサイズ)</td><td>マクマスター・カー</td><td>8560K239</td><td></td></tr><tr><td>硬質段ボールサポート</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>ルーラー</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>はさみ&nbsp;</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム(蒸留水中0.8M)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>アルミブロック付き温度デッキ(Gen2)</td><td>オープントロン</td><td>999-00097</td><td></td></tr><tr><td>トレースホイール&nbsp;</td><td>HEEPDD(アマゾン)</td><td>B07YQWB284</td><td></td></tr><tr><td>透明テープ&nbsp;</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>ギブコ</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>ギブコ</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー&nbsp;</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td></td></tr></tbody></table>

ハイスループット足場ベースの培養プラットフォームとしてのspotの再現性のある製造

Reproducible Manufacturing of SPOT as a High-throughput Scaffold-based Culture Platform

紙足場のPMMAパターニングは、ウェル間の内容物交換を防ぐ物理的な障壁として機能します。この設計は、隣接するウェルが化学的および生物学的に分離されたままであることを保証し、培地、薬物、分泌因子、さらには細胞の意図しない拡散を防ぐために重要です14。PMMAを組み込むことで正確な区画化が可能になり、SPOTはクロスコンタミネーションを最小限に抑える必要があるハイスループットスクリーニングおよび共培養研究のための信頼できるプラットフォームになります14,18。推奨される品質保証および品質管理実験を表3および表4に示します。細胞-ゲル混合物の播種実践と長期オルガノイド培養を進める前に実施すべき最も重要な品質保証実験の1つは、組み立てられたプレートの構造的完全性とPMMAバリアの有効性を保証するためのリークテストです。正常に製造されたプレートでは、媒体の漏れは観察されません。フルオレセインとPBSを交互のウェルに添...

ハイスループット足場ベースの培養プラットフォームとしてのSPOTの再現性のある製造

Patient-derived organoids (PDOs) are becoming increasingly used in the field of cancer research to model tumors. They combine the benefits of in vivo and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

主に単層培養 -  - 多くの場合、分化初代細胞は比較的短い寿命を持っていて、培養中に脱分化している欠点に苦しんで体外培養システムにおける過去の多くの。結果として、彼らの臓器特異的な機能のほとんどが急速に失われていた。従って、in...

インタビュー：幹細胞研究のためのバイオリアクターと浮上し、修正3D -足場

タンパク質治療薬を製造するための製造の細胞株開発のハイスループット、自動化されたプラットフォームが記載されている。 BD...

タンパク質治療薬の製造細胞株の開発のためのハイスループット自動化されたプラットフォーム

記載されているプロトコルにより、実験室はプログラム可能なリキッドハンドリングロボットと96ウェルプレートを使用して、最小限の労力、経験、設備投資コストでスケーラブルな接着性幹細胞培養を高スループットで行うことができます。 このシステム上で20回以上継代したiPS細胞は、多能性を維持し、核型が正常で、心筋細胞に分化しました。...

ロボット液体ハンドリングシステムを用いたiPS細胞培養および生産ベースのスケーラブルな96ウェルプレート

この資料は、物理と化学の高スループット操作キューが模倣した生体内で細胞微小と多重化人工細胞微小環境 (MACME) 配列を準備する詳細な方法についてを説明します単一セルのプロファイリングとひと多能性幹細胞 (hPSCs)...

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

このプロトコルは、粘性材料を新しいオープンソースの自動化技術と標準化された再現可能な混合のための包括的なチュートリアルとして機能します。新しく開発されたオープンソースワークステーションの操作、オープンソースプロトコル設計者の使用、および再現可能な混合物を識別するための検証と検証に関する詳細な手順が提供されています。...

ヒドロゲルベースの3D培養モデルを自動化および標準化された方法で製造するためのオープンソース技術プラットフォーム

幹細胞由来の心筋細胞を用いてバイオエンジニアリングされた3次元心臓組織は、健康なヒト心筋と病気のヒト心筋を in vitro...

人工心臓組織のデータ取得とモデルスループットを向上させるバイオリアクターの設計

この論文は、オルガノイドを培養し、高解像度顕微鏡を使用して観察できる、mm2あたり数百のマイクロコンテナを備えた新しいタイプの培養基質の製造プロトコルを提示します。細胞播種および免疫染色プロトコルも詳述されています。...

オルガノイドの培養および3Dイメージングのためのハイスループットプラットフォーム

ここでは、自動細胞培養システムのプロトコールを紹介します。この自動培養システムは、iPS細胞の維持管理から各種細胞への分化まで、人工多能性幹細胞(iPS細胞)の取り扱いに不慣れな研究者など、ユーザーの手間を軽減し、メリットがあります。...

ヒト人工多能性幹細胞の維持・分化のための自動培養システム

このプロトコルは、産業用微生物向けの標準的な高スループットスクリーニングワークフローを提供します。これはARTP変異誘発による変異体ライブラリの構築、自動マイクロ流体解析による陽性液滴スクリーニングを行い、その後結果を検証する過程を含みます。ワークフローの信頼性は、高収量の B. coagulans...

自動液滴マイクロ流体プラットフォームを用いたL-乳酸高産生 バチルス凝固変 異体の高スループットスクリーニング

伝統的な、二次元細胞培養技術は、しばしば、分化マーカー、サイトカインおよび増殖因子に関する変更特性になる。...

ヒト細胞培養のための回転細胞培養システム：モデルとしてのヒト栄養膜細胞

学ぶSPOTプラットフォームの製造法。96/384ウェル形式の足場ベース培養システムを作製し、自動液体ハンドラーを用いた細胞播種技術を習得できます。創薬スクリーニングやオルガノイド培養の再現性向上に貢献します。

ハイスループット足場ベースの培養プラットフォームとしてのSPOTの再現性のある製造

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