Name: I型およびII型FLT3阻害剤への曝露後のFLT3変異体発現32D細胞におけるDNA損傷を定量化するためのコメットアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: 学ぶコメットアッセイを用いて、FLT3変異体32D細胞におけるI型およびII型FLT3阻害剤誘導DNA損傷を定量化する方法。AC220がGilteritinibより強い遺伝毒性を示し、急性骨髄性白血病の治療戦略最適化に貢献する。

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1. FLT3-ITD変異を有する32D細胞におけるDNA損傷モデルの構築 18
<ol>
	<li>細胞回収<ol>
		<li>鉗子を使用して、凍結保存されたFLT3-ITD変異体32D細胞(-80°Cで保存)を迅速に移します。鉗子を使用してクライオバイアルを取り出し、すぐに温度調節されたウォーターバス(37°C±0.5°C)に正確に60秒間浸漬し、制御された解凍を完了します。 注:解凍中は、水浴内で凍結バイアルを断続的に振って、均一な加熱を確保してください。</li>
		<li>凍結保存したサンプルを150 × g で25°C±1°Cで5分間遠心分離します。 細胞ペレットを保持しながら、滅菌血清学的ピペットを使用して上清を慎重に吸引します。</li>
		<li>1 mLの完全増殖培地(RPMI 1640 + 10%ウシ胎児血清+ 1%ペニシリン/ストレプトマイシン)を凍結保存チューブに加えます。10回の連続したピペッティングサイクル(1 mL容量)で穏やかな粉砕を行い、完全な再懸濁を確保します。細胞懸濁液を100 mmの細胞培養皿に移し、7 mLの完全培地を加えて、最終容量8 mLにします。</li>
		<li>培養容器を水平5回、回転5回で穏やかに撹拌します。細胞を37.0°C±0.2°C、5%CO2、95%湿度の加湿インキュベーターに維持します。実験処理の前に24時間インキュベートします。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>細胞生存率評価<ol>
		<li>実験のために、対数成長期のFLT3-ITD変異体32D細胞を、細胞状態が良好なものを選択します。 注:対数成長期の細胞は通常、分裂サイクルが短く、細胞分裂の頻度が高い。<ol>
			<li>FLT3-ITD変異32D細胞の形態や増殖状態を電子顕微鏡で観察します。細胞増殖閾値の基準が満たされていることを確認します:滑らかなエッジ、均一な分散、凝集体が少なく、細胞サイズが均一で、無傷の原形質膜の完全性、および細胞破片が5%&lt;単一の小球の形をしたche細胞を探します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>セルカウンターを使用して、細胞懸濁液の濃度を測定します。 注:細胞懸濁液を混合します(最大ピペット速度50%で1 mL滅菌チップを使用して10回連続ピペッティングサイクル)。</li>
		<li>反復希釈を使用して、完全増殖培地中で細胞懸濁液を2.0×105細胞/mLに標準化します。ピペットを使用して、50 μLのアリコートを96ウェル平底プレートの中央ウェル(B2-G7)に分注します。周辺ウェル(A1-H12)に100 μLの滅菌PBSを充填して、湿度を維持し、エッジ蒸発の影響を最小限に抑えます。</li>
		<li>FLT3阻害剤含有培地の調製:12ウェル細胞培養プレートで9つのウェルを選択し、FLT3阻害剤濃度ラダー(0、3.90625、7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250、500、および1000 nM)に従って標識します。10.0 μMと標識されたウェルに400 μLの完全培地を加え、残りのウェルに200 μLの完全培地を加えます。<ol>
			<li>ギルテリチニブ希釈:ピペットガンを使用して、1000 nMで標識された各ウェルに4 μLの100 μMギルテリチニブ試薬(ジメチルスルホキシド中のギルテチニブ)を加え、溶液を完全に混合します。200 μL の 1000 nM ギルテリチニブを 500 nM と標識されたウェルにピペットで入れ、混合します。次に、200 μLの500 nMギルテリチニブを250 nMと標識されたウェルにピペットで入れて混合します。毎回、前の希釈液200 μLを次のウェルに取り、混合して所望の濃度にします。</li>
			<li>AC220希釈:ピペットガンを使用して、1000 nMを標識した各ウェルに4 μLの100 μM AC220試薬(ジメチルスルホキシド中のAC220)を加えます。他の井戸については、手順1.2.4.1に従います。 注:残留溶液を避けるために、ピペット内のFLT3阻害剤原液がウェルに完全に移されていることを確認してください。希釈を続行する前に、溶液が十分に混合されていることを確認してください。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>インキュベーション:ピペットを使用して、FLT3阻害剤含有培地を指定されたウェル(50 μL /ウェル)に分注します。96ウェルプレートを生理学的培養条件(37.0°C±0.2°C、5%CO2、95%湿度)下で正確に72時間±15分間維持します。</li>
		<li>ピペットを使用して、10 μLのCCK-8試薬をすべての実験ウェルおよびブランクコントロールウェルに分注します。プレートを光から保護し、常酸素条件(37°C、5%CO2)で2.0時間±10分間インキュベートします。 注:気泡の形成を最小限に抑えるために、2 mmのチップ浸漬深さで低速ピペットで試薬を分注します。OD測定値との干渉を防ぐために、サンプル添加中に気泡を避けてください。</li>
		<li>インキュベーターから96ウェルプレートを取り出し、マイクロプレートリーダーを使用して450 nmでの吸光度を測定します。結果を記録します。</li>
		<li>IC50 計算式に従って阻害率を計算します。 阻害(%)= <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68469/68469eq1.jpg" style="margin: auto;"> ×100% 薬物実験井戸は、薬物で処理された細胞井戸を示します。細胞対照井戸は、薬物で処理されなかった細胞井戸を示します。ブランクコントロールウェルは、細胞のない培地のみを示します。</li>
		<li>4 パラメータのロジスティック モデルを使用して、非線形回帰によって正規化された用量反応データを分析します。曲線のフィッティングボタンをクリックして、曲線のフィッティングを行います。モデル収束(R2 &gt; 0.98、残差平方和 &lt; 0.15)から半最大阻害濃度(IC50)を導き出し、1000回の反復ブートストラップリサンプリングを通じて95%信頼区間を計算します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FLT3阻害剤により誘導されたFLT3‐ITD変異を有する32D細胞のDNA損傷実験<ol>
		<li>DNA損傷評価のために、増殖スパート(集団倍加時間&lt;24時間)を示すFLT3-ITD変異32D細胞を選択します。</li>
		<li>セルを数えます(詳細については、手順1.2.2を参照してください)。</li>
		<li>細胞播種:直径6 cmのディッシュとディッシュあたり4 mLの細胞懸濁液を使用して、細胞懸濁液の密度をディッシュあたり1×106個の細胞に調整します。</li>
		<li>阻害剤濃度ごとに3回の繰り返しを調製します:55 nMギルテリチニブ:4 mLの培地+ 2.2 μLの100 μMストック、0.15 nM AC220:4 mLの培地+ 6 μLの100 nMストック。溶液をボルテックス混合し、37°Cで15分間平衡化します。チューブを軽く振って、適切に混合できるようにします。元の培地を吸引し、滅菌血清学的ピペットを使用して、新たに調製した阻害剤含有培地4 mL/ディッシュと交換します。</li>
		<li>処理した細胞を生理学的条件(37°C、5%CO2、95%湿度)で定義された間隔(0、2、4、6時間)インキュベートします。タイムゼロコントロールを即座に処理し、ベースラインのDNA損傷評価を行います。</li>
		<li>トリパンブルー排除アッセイ<ol>
			<li>収集した細胞を150 × g で1分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞を1 mLの培地で再懸濁します。</li>
			<li>100 μLの再懸濁細胞をプラスチック製の遠心分離管にピペットで入れ、100 μLのトリパンブルー染色(2x)を加え、穏やかに混合し、3分間染色します。</li>
			<li>セルを数えます(詳細については、手順1.2.2を参照してください)。</li>
			<li>細胞生存率を次のように計算します。 細胞生存率 = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68469/68469eq2.jpg" style="margin: auto;"> × 100% 注:生存率≥90%のサンプルのみが彗星アッセイ用に処理されました。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 試薬の調製と細胞サンプルの調製
<ol>
	<li>溶解溶液(2.5 M NaCl、100 mM EDTA、10 mM Tris、pH 10、1%Triton X-100、10%DMSOを含む)を冷蔵庫を使用して4°C±0.5°Cで30分間平衡化します。</li>
	<li>低融点アガロース(LMA)を95°Cで15分間溶かし、凝固を防ぐために37°Cのウォーターバスに保管します。</li>
	<li>アルカリ電気泳動バッファー(300 mM NaOH、1 mM EDTA、pH &gt;13)を電子天秤を使用して12 gのNaOHを計量し、2 mLの500 mM EDTA溶液をピペッティングし、次にddH2Oを添加して最大1 Lのバッファーを作ることにより調製します。</li>
	<li>細胞採取<ol>
		<li>細胞懸濁液を15 mL遠心分離管に集めます。細胞懸濁液を800 × g で5分間遠心分離します。真空ろ過を使用して上清を吸引します。<ol>
			<li>広口径の1 mLピペットチップを使用して、細胞を1 mLの完全培地に穏やかに再懸濁し、続いて10回垂直反転させます。</li>
			<li>手順1.2のようにセルを数えます。</li>
			<li>細胞懸濁液を15 mL遠心分離管内で150 × g で5分間遠心分離し、完全な培地を除去します。洗浄した細胞をカルシウムフリーPBSで~5.0×105 細胞/mLに再懸濁します。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 彗星アッセイ手順
<ol>
	<li>事前にコメットアッセイスライドと細胞サンプルを準備します。LMAアガロースと細胞懸濁液(5×105細胞/ mL)の10:1(v/v)混合物をピペットを使用して1.5 mLチューブに調製し、穏やかに混合します。スライド表面から2 mmの距離を保ちながら、45°の角度で保持されたピペットを使用して、アガロース細胞混合物の55 μLアリコートをコメットスライドに分注します。混合物でコーティングしたスライドを4°Cで30分間置き、光を避けます。 注:LMAと細胞混合物をコメットアッセイスライドに添加する際は、懸濁液をゆっくりと均一に分注して、気泡の形成を防ぎ、均一なゲル分布を確保します。</li>
	<li>固化したスライドを予冷した溶解溶液(2.5 M NaCl、100 mM EDTA、10 mM Tris、pH 10、1%Triton X-100、10%DMSOを含む)に沈め、光保護条件下で4°Cで≥1時間溶解します。</li>
	<li>溶解後、ライセートからスライドを取り外し、ピペットガンを使用してパドルの周りの液体をできるだけ多く吸い上げます。次に、スライドをアルカリ電気泳動バッファー(300 mM NaOH、1 mM EDTA、pH &gt;13)に入れ、光を避けるように注意しながら、4°Cで1時間予備平衡化します。</li>
	<li>電気泳動: スライドを電気泳動チャンバーに配置し、スライドを浸すのに十分なアルカリ性電気泳動溶液を加えます。DNA損傷を最小限に抑えるために、事前に平衡化されたバッファー(4°C)を使用して、定電流(300 mA)で24 V(0.74 V / cmに相当)で30分間電気泳動を行います。</li>
	<li>中和:電気泳動後、ピペットガンを使用してスライドからアルカリ電気泳動溶液を吸引し、スライドをdH2Oに2 x 5分間浸し、次に70%エタノールに5分間浸します。スライドをインキュベーターで37°Cで15分間乾燥させます。</li>
	<li>染色:ウェルあたり100 μLの1x YeaRed核酸染色液のアリコートを塗布し、光保護条件下で周囲温度で30分間インキュベートします。穏やかな水洗いに続いて37°Cで熱乾燥させて余分な汚れを取り除きます。</li>
	<li>イメージング:4倍対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を使用して蛍光可視化を実行し、標準化された露光条件下でデジタル画像取得を行います。</li>
</ol>
4. データ処理
<ol>
	<li>定量的画像解析を実行して、尾部 DNA (%)、オリーブ尾モーメント、尾部長 (μm) などの標準的な彗星パラメータを決定します。<ol>
		<li>ソフトウェアのインターフェイスを開きます(図5)。</li>
		<li>イメージをソフトウェアにインポートし、[ ファイル]、[ ファイルの選択 ]の順にクリックして、解析するイメージをソフトウェアにインポートします。次に、マウスボタンを押したまま、青いボックスが表示されるまでドラッグします。青いボックスをドラッグして、分析するセルがボックス内に囲まれていることを確認します。図の [調整] オプションを使用して、セル全体を含めるようにフレームの位置を調整できます (図 5)。</li>
		<li>解析を開始する前に、[ 開始]をクリックし、[ 解析]をクリックします。単一セル分析の結果は、右側の「プロファイル」の下に表示されます。各セルを分析したら、[ 保存] をクリックします。検出可能なパラメータは「プロファイル」の右側に表示され、下部には各種パラメータの数値が表示されます。最後に、[ ファイル] |結果をエクスポートします。得られた結果には、HeadArea、TailArea、HeadDNA、TailDNA、HeadDNA%、TailDNA%、HeadRadius、TailLength、CometLength、HeadMeanX、TailMeanX、TailMoment、およびOliveTailMomentが含まれます。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Swaminathan, M., Wang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapies+for+AML%3A+A+round-up+for+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Novel therapies for AML: A round-up for clinicians.</a> Expert Rev Clin Pharmacol. 13 (12), 1389-1400 (2020).</li>
<li>Daver, N., Schlenk, R. F., Russell, N. H., Levis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+flt3+mutations+in+AML%3A+Review+of+current+knowledge+and+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Targeting flt3 mutations in AML: Review of current knowledge and evidence.</a> Leukemia. 33 (2), 299-312 (2019).</li>
<li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> N Engl J Med. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li>
<li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+FLT3%2FAXL+inhibitor%2C+shows+antileukemic+activity+in+mouse+models+of+FLT3-mutated+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+New+Drugs%22%5BJournal%5D)">a FLT3/AXL inhibitor, shows antileukemic activity in mouse models of FLT3-mutated acute myeloid leukemia.</a> Invest New Drugs. 35 (5), 556-565 (2017).</li>
<li>Papaemmanuil, E., Döhner, H., Campbell, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+classification+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Genomic classification in acute myeloid leukemia.</a> N Engl J Med. 375 (9), 900-901 (2016).</li>
<li>Cortes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quizartinib%3A+A+potent+and+selective+FLT3+inhibitor+for+the+treatment+of+patients+with+FLT3-ITD-positive+AML%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Quizartinib: A potent and selective FLT3 inhibitor for the treatment of patients with FLT3-ITD-positive AML.</a> J Hematol Oncol. 17 (1), 111(2024).</li>
<li>Döhner, H., Wei, A. H., Löwenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+precision+medicine+for+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Towards precision medicine for AML.</a> Nat Rev Clin Oncol. 18 (9), 577-590 (2021).</li>
<li>Kantarjian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukemia%3A+Current+progress+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+J%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukemia: Current progress and future directions.</a> Blood Cancer J. 11 (2), 41(2021).</li>
<li>Miyamoto, K., Minami, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge+molecular+therapy+for+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cutting edge molecular therapy for acute myeloid leukemia.</a> Int J Mol Sci. 21 (14), (2020).</li>
<li>Yang, X., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+therapy+for+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Precision therapy for acute myeloid leukemia.</a> J Hematol Oncol. 11 (1), 3(2018).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Olive, P. L., Banáth, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+Principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: Principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Azqueta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+recommendations+to+perform+the+alkaline+standard+and+enzyme-modified+comet+assay+in+human+biomonitoring+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Genet+Toxicol+Environ+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Technical recommendations to perform the alkaline standard and enzyme-modified comet assay in human biomonitoring studies.</a> Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 843, 24-32 (2019).</li>
<li>Cotelle, S., Férard, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+in+genetic+ecotoxicology%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Comet assay in genetic ecotoxicology: A review.</a> Environ Mol Mutagen. 34 (4), 246-255 (1999).</li>
<li>Tice, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gel%2Fcomet+assay%3A+Guidelines+for+in+vitro+and+in+vivo+genetic+toxicology+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Single cell gel/comet assay: Guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.</a> Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).</li>
<li>Pu, X., Wang, Z., Klaunig, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+comet+assay+for+assessing+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Alkaline comet assay for assessing DNA damage in individual cells.</a> Curr Protoc Toxicol. 65, 3.12.11-13.12.11 (2015).</li>
<li>Liu, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+flt3-itd+length+on+prognosis+of+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Impact of flt3-itd length on prognosis of acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 104 (1), e9-e12 (2019).</li>
<li>Wang, Y., Lin, X., Wang, Y., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+adavosertib+and+fimepinostat+on+acute+myeloid+leukemia+cells+by+enhancing+the+induction+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+New+Drugs%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of adavosertib and fimepinostat on acute myeloid leukemia cells by enhancing the induction of DNA damage.</a> Invest New Drugs. 42 (1), 70-79 (2024).</li>
<li>Kumar, S., Yedjou, C. G., Tchounwou, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+trioxide+induces+oxidative+stress%2C+DNA+damage%2C+and+mitochondrial+pathway+of+apoptosis+in+human+leukemia+%28hl-60%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Arsenic trioxide induces oxidative stress, DNA damage, and mitochondrial pathway of apoptosis in human leukemia (hl-60) cells.</a> J Exp Clin Cancer Res. 33 (1), 42(2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>ビヨタイム</td><td>ST066</td><td></td></tr><tr><td>1x YeaRed 核酸染色</td><td>イェン</td><td>10202ES</td><td></td></tr><tr><td>32Dセル</td><td>コビオエ</td><td>CBP60995</td><td></td></tr><tr><td>AC220</td><td>ターゲットモール</td><td>T2066</td><td></td></tr><tr><td>セルカウンティングキット-8</td><td>道珍島</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>細胞計数プレート</td><td>チウジン</td><td>XB-K-25</td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>熱</td><td>51032872</td><td></td></tr><tr><td>コメットアッセイソフトウェアプロジェクト(CASP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>彗星アッセイキット&nbsp;</td><td>トレヴィゲン</td><td>4250-050-K</td><td></td></tr><tr><td>細胞化5</td><td>バイオテック</td><td>16280004</td><td></td></tr><tr><td>FBSの</td><td>パン</td><td>ST30-3302</td><td></td></tr><tr><td>ギルテリチニブ</td><td>ターゲットモール</td><td>T4409</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad プリズム 9.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高速遠心分離機</td><td>熱</td><td>&nbsp;9AQ2861</td><td></td></tr><tr><td>L-1000XLS+ ピペット</td><td>レイニン</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>L-20XLS+ ピペット</td><td>レイニン</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素タンク</td><td>ムヴェクリオゲ</td><td>YDS-175-216</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan FCマイクロプレート光度計</td><td>熱</td><td>1410101</td><td></td></tr><tr><td>Na2OH</td><td>ダマオ</td><td>1588</td><td></td></tr><tr><td>PBSの</td><td>ソーラービオ</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、100x</td><td>ビヨタイム</td><td>C0222</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 ミディアム</td><td>ギブコ</td><td>C22400500BT</td><td></td></tr><tr><td>三眼生細胞顕微鏡</td><td>モティック</td><td>1.1001E+12</td><td></td></tr><tr><td>超低温冷凍庫</td><td>ヘア</td><td>V118574</td><td></td></tr></tbody></table>

i型およびii型flt3阻害剤への曝露後のflt3変異体発現32d細胞におけるdna損傷を定量化するためのコメットアッセイ

Comet Assay to Quantify DNA Damage in FLT3 Mutant-expressing 32D Cells after Exposure to Type I and Type II FLT3 Inhibitors

コメットアッセイは、FLT3変異細胞株におけるギルテリチニブとAC220によって誘導される異なるDNA損傷プロファイルを定量化するために体系的に採用されました。分析により、ギルテリチニブで未処理の細胞集団と AC220 の間の DNA 損傷の差は統計的に有意ではないことが示されました (P &gt; 0.05)。テールDNA(%)およびオリーブモーメントテール(OMT)値の用量依存的な増加は、2〜6時間の曝露後に統計的有意性(P &lt; 0.05)を達成しました。OMTは、尾部のDNAの割合と「頭尾蛍光の重心間の距離」の積を表します。テールDNA(%)とオリーブモーメントテール(OMT)の違いは、AC220がギルテリチニブよりも細胞に多くのDNA損傷を引き起こすことを示しています(図3および図4)。結論として、この実験パラダイムは、コメットアッセイが変異細胞モデルにおけるFLT3阻害剤のDNA損傷の違いを評価するのに役立つことを決定的に確立します。
<p class="jov...

I型およびII型FLT3阻害剤への曝露後のFLT3変異体発現32D細胞におけるDNA損傷を定量化するためのコメットアッセイ

FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3), a class III receptor tyrosine kinase, exhibits a mutation frequency of approximately 30% in acute myeloid leukemia ...

comet-assay-to-quantify-dna-damage-flt3-mutant-expressing-32d-cells

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオは、有害物質にさらされた後のDNA損傷を検出するための彗星アッセイを示しています。アルカリ性条件下では、DNAは巻き戻されて変性し、電気泳動では、損傷していないDNAと損傷したDNAがアガロースゲル内で異なる方法で移動し、彗星状の構造を形成します。ゆっくりと移動する損傷を受けていないDNAは円形の彗星の頭を形成し、急速に移動する損傷したDNA断片は細長い彗星の尾を形成します。...

細胞内のDNA損傷検出のためのCometアッセイ

コメットアッセイは、アルカリに不安定なサイトや海馬ニューロンを含むすべての細胞のDNAにDNA-DNA/DNA-proteinクロスリンクを含むシングルと二重鎖切断を検出する効率的な方法です。この方法は、DNA損傷の量の違いに起因する電界中のDNAの差のマイグレーションを活用しています。...

コメットアッセイを用いて海馬神経細胞のDNA損傷を測定する

ここでは前例のないスループットDNA損傷のコメットアッセイの検出を可能にするプラットフォームについて説明します。デバイスパターンマイクロアレイへの哺乳動物細胞および96サンプルの並列処理を可能にします。アプローチは、基本レベルのDNA損傷、曝露によって誘導されるDNA損傷とDNA修復の動態の解析を容易にする。...

CometChip：マイクロアレイヒト細胞におけるDNA損傷を測定するためのハイスループット96ウェルプラットフォーム

コメット ・ アッセイは、単一および二重鎖 DNA を含む DNA 損傷の中断を検出する効率的な方法です。化学療法の治療効果を評価するためがん細胞における DNA...

コメットアッセイを用いた DNA 損傷の in Vitro評価

このプロトコルは、DNA損傷を評価するために彗星アッセイで使用するための壊死時に高品質の凍結組織サンプルを調製するためのいくつかの手順を説明します:1)細かい組織、2)消化管からの掻き取られた上皮細胞、および3)立方体組織サンプルは、組織ミンチ装置を用いて均質化を必要とする。...

DNA損傷評価のための彗星アッセイにおける凍結組織の利用

コメットアッセイは、DNA損傷を検出するための一般的な手段です。この研究では、コメットアッセイの代表的なバリアントでスライドを実行するためのアプローチについて説明します。このアプローチにより、サンプル数が大幅に増加し、アッセイの実行時間、スライド操作の回数、およびゲルの損傷のリスクが軽減されました。...

細胞DNA損傷を評価するためのハイスループットコメットアッセイアプローチ

ラットにおけるアクティブ遅延型過敏（DTH）の誘導とモニタリング

制御性T細胞：移植拒絶反応とI型糖尿病を治療するための治療の可能性

ラットにおける養子遅延型過敏症の誘導とモニタリング

詳細なプロトコルは、イメージングのためのDNA修復複合体のリアルタイムの形成を説明しています...

イメージングのミスマッチ修復とのDNA損傷に対する細胞応答枯草菌</em

学ぶコメットアッセイを用いて、FLT3変異体32D細胞におけるI型およびII型FLT3阻害剤誘導DNA損傷を定量化する方法。AC220がGilteritinibより強い遺伝毒性を示し、急性骨髄性白血病の治療戦略最適化に貢献する。

I型およびII型FLT3阻害剤への曝露後のFLT3変異体発現32D細胞におけるDNA損傷を定量化するためのコメットアッセイ

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