July 8th, 2025
このプロトコールでは、蛍光灯アプタマーDAP-10-42をシグナルレポーターとして利用するスプリットハイブリダイゼーションプローブの設計と、核酸検出および単一ヌクレオチド置換を持つターゲット間の分化への応用について概説します。
配列特異的核酸解析用の新しいタイプの蛍光ハイブリダイゼーションプローブを開発しています。最近では、ハイブリダイゼーション分析ツールがCRISPR-Casシステムを活用したアッセイで拡大しています。現在、核酸標的の分析には、TaqManなどの最先端のハイブリダイゼーションプローブや分子ビーコンプローブが最もよく使用されています。
一塩基置換と核酸標的の正確な検出は、依然として実質的に困難です。当社のプロトコルは、ラベルフリーの蛍光シグナルを読み出しながら、必要なレベルの細胞活性を保証します。まず、SLASを構成する2本の未修飾DNAオリゴヌクレオチド鎖の配列を設計します。
DAP-10-42の6〜39にヌクレオチドを含むフラグメントを使用します。ヌクレオチド1〜8および36〜42からなるステム1を、位置5の膨らんだチミンを除去し、ステムを4塩基対に短縮し、末端シトシン-グアニン塩基対を追加することにより、ステム1プライムに変換します。一方のSLAS鎖にヌクレオチド9〜29を、もう一方のSLAS鎖にヌクレオチド30〜35を含めます。
デオキシGGTCATを添加することにより、ヌクレオチド9から29でフラグメントの3つのプライム末端配列を拡張します。次に、30〜35フラグメントの5つのプライム末端配列をデオキシTGACCで拡張して、6塩基対ステム2を形成します。次に、デオキシTTリンカーと核酸標的に相補的なDNA配列を使用して、両方の鎖でステム1プライムを延長します。
これにより、プローブを構成する鎖 SLAS-U と SLAS-S の配列が得られます。SLAS-Sを7〜10ヌクレオチド領域に補完します。これには、一塩基置換部位が含まれます。
次に、SLAS-Uの標的結合アームが、SLAS-S領域に隣接する15〜25ヌクレオチドフラグメントに相補的であることを確認します。UNAFold Web サーバーを使用して、標的結合二本鎖の融解温度を評価します。[INAMelt]タブをクリックします。
[アプリケーション]に移動し、[2 状態融解ハイブリダイゼーション]を選択します。相互作用するシーケンスを、左右のボックスに5つの素数から3つの素数の順序で入力します。次に、アッセイ温度を摂氏22度に調整し、一価および二価の陽イオン濃度をそれぞれ20ミリモルイオンと25ミリモルイオンに入力します。
対応するボックス内の相互作用する配列の濃度を調整します。送信を押して、対応する二本鎖のギブスエネルギー変化、エンタルピー、エントロピー、および融解温度の値を確認します。完全に一致したターゲットと SLAS-S および SLAS-U のターゲット結合アームの融解温度がアッセイ温度である摂氏 22 度を超えていることを確認します。
特異性を維持するために、SLAS-Sと不一致のターゲットの間の二本鎖がアッセイ温度を下回る融解温度が得られることを確認します。必要に応じて、これらの条件を満たすようにターゲットバインディングアームの長さを調整します。最終化されたSLAS-UおよびSLAS-Sオリゴヌクレオチド鎖を市販のDNAサプライヤーから入手するか、自動DNAシンセサイザーを使用して社内で合成します。
Auramine O、SLAS-S、SLAS-U、およびアッセイバッファーのストック溶液を調製します。ターゲットを除くすべてのアッセイ成分を含むマスターミックスを調製します。マスターミックスの最後の5〜6巻にヌクレアーゼフリーの水を加えます。
次に、マスターミックスをボルテックスして回転させます。各サンプルチューブに50マイクロリットルを分注します。次に、1つのサンプルをターゲットなしのブランクとして、もう1つのサンプルをポジティブコントロールとしてラベル付けします。
マスターミックスの入ったチューブに10マイクロリットルのターゲット含有サンプルを加えて、60マイクロリットルのサンプルを作ります。ブランクには、10マイクロリットルのヌクレアーゼフリーの水を加えます。次に、標的配列を含む10マイクロリットルの合成DNAオリゴヌクレオチドをポジティブコントロールチューブにピペットで入れます。
微量遠心分離機を使用して、遠心分離機ですべてのサンプルを短時間混合します。次に、チューブを摂氏22度で10〜60分間インキュベートします。蛍光分光光度計を使用して、475ナノメートルで励起すると、540ナノメートルでの蛍光を測定します。
SLASは、NANOGP8遺伝子の特定のフラグメントを標的とするように調整されました。ターゲットMはSLAS-S鎖に完全に相補的でしたが、ターゲットMMはシトシンヌクレオチド位置1、423を有し、SLAS-Sとのミスマッチをもたらしました。完全に相補的なターゲットMを追加すると、蛍光は着実に増加し、45〜50分後に頭打ちになりました。
しかし、10分以内に明確なシグナルを検出でき、シグナル対ブランク比10 SLASは、完全に一致したターゲットに対して高い蛍光シグナルを示しましたが、不一致のターゲットまたはブランクでは高蛍光シグナルを示しませんでした。蛍光出力は、目標濃度とともに直線的に増加し、最大500ナノモルまで増加し、検出限界の定量化と決定が可能になりました。PCR増幅サンプルはさまざまなレベルのシグナルを示し、蛍光閾値2を超えたのはサンプル2のみでした。
検量線に基づいて、サンプル2中のNANOGP8アンプリコンの濃度は124+または13ナノモルと推定されました。SLASシグナルの蛍光検出は、卓上型分光光度計とポータブル蛍光光度計の両方で一貫していました。20を超えるシグナル対ブランク比も、UV光を使用して視覚的に観察されました。
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このプロトコルは、特定の核酸分析のための蛍光ハイブリダイゼーションプローブの開発を説明し、DAP-10-42をシグナルリポーターとして使用することに焦点を当てています。単一ヌクレオチド置換の検出における課題に対処しています。
Sequence-specific nucleic acid analysis using split hybridization probes with DNA fluorescent light-up aptamers (FLAPs) addresses the persistent challenge of detecting single-nucleotide substitutions with high specificity and quantitative confidence. This approach enables label-free, cost-effective, and scalable fluorescence-based readouts, supporting robust target validation and mechanistic de-risking in early discovery and screening workflows. The method's selectivity and quantitative outputs are directly relevant for portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions in biopharma R&D.
This split hybridization probe platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing, assay development, and translational biomarker validation.