Name: DNA蛍光発光アプタマーをシグナルレポーターとして用いたスプリットハイブリダイゼーションプローブによる塩基配列特異的核酸解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学ぶスプリットハイブリダイゼーションプローブを用いた塩基配列特異的核酸解析法。DAP-10-42蛍光アプタマーをシグナルレポーターとして活用し、一本塩基置換を含む標的を高精度で検出するラベルフリー手法を確立した。

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1. DAP-10-42をシグナルレポーターとしたスプリットライトアップアプタマーセンサー(SLAS)の設計
<ol>
	<li>SLASを構成する2本の未修飾DNAオリゴヌクレオチド鎖の配列を設計します。DAP-10-42のヌクレオチド(nts)4,6-39を含むフラグメントを使用してください(表1、図1A)。</li>
	<li>nt 5 の位置で膨らんだチミン残基を除去し、ステムを 4 bp に短縮し (nts 4,6-8 および 36-39)、末端 C-G bp を追加することで、ステム 1 (nts 1-8 および 36-42) の配列をステム 1' に変換します (図 1A、ステップ 1)。さらに、SLASストランドの1つにはDAP-10-42コア配列のnts 9-29が含まれ、別のSLASストランドには配列のnts 30-35が含まれています。</li>
	<li>nts 9-29を含むフラグメントの3'末端配列をd(GGTCAT)で拡張し、nts 30-35フラグメントの5'末端配列をd(ATGACC)で拡張して、6-bpステム2を形成します(図1A、ステップ2)。 注:DAP-10-42のステム1の塩基対T4-A39、A6-T38、C7-G37、およびG8-C36は、アプタマーの点灯機能に必要です。ステム1'の配列は、末端bpでのみ変更でき、G-C、A-T、T-A塩基対にすることも、必要に応じて1-2塩基対で拡張することもできます。ステム 2 の順序は任意であり、変更できます。ただし、分析温度が28°Cを超えない限り、ステム2の熱力学的安定性を維持することをお勧めします。 ステム2を短くするか、または不安定にすることで、SLASベースの蛍光アッセイの高いバックグラウンドが観察された場合、ターゲットなしでの早期な色素結合を防ぐことができます。DAP-10-42ヌクレオチド配列をnts 29-30ではなくnts 28-29、27-28、または26-27に分割することも許可されます(図1B)。</li>
	<li>設計されたSLASを核酸ターゲットまたは関心に合わせて調整するには、d(TT)リンカーを介してターゲット-ターゲット結合フラグメント(アーム)に相補的なDNA配列でステム1'を伸ばします(図1A、ステップ3)。これにより、プローブを構成するストランドSLAS-UおよびSLAS-Sの配列が得られます。</li>
	<li>SLAS-Sのターゲット結合アームをSNS部位を含むターゲットの7-10-ntフラグメントに相補的にし、SLAS-Uのターゲット結合アームをSLAS-Sのターゲット結合アームに隣接するターゲットの15-25ntフラグメントに相補的にします(表1)。 注意: SLAS-SのターゲットバインディングアームをDAP-4-10-42シーケンスのnt4またはnt39に接続するかどうかはオプションです(それぞれ図1、アーム1、またはアーム2)。</li>
	<li>UNAFold Web Server(unafold.org)19を使用して、対象のターゲットとSLAS-SおよびSLAS-Uのターゲット結合アームとの間のデュプレックスの融解温度(Tm)を評価します。<ol>
		<li>Webページの上部にある [DINAMelt ]タブをクリックします。[アプリケーション]に進み、[ Two State Melting Hybridization ]を選択します(補足図3A)。Two-State Melting Hybridizationページで、相互作用する配列の1つを左のボックスに、もう1つを右のボックスに入力します(補足図3B)。両方のシーケンスが5'から3'の順になっていることを確認してください。相互作用するシーケンスの複数のペアを入力するには、それらをセミコロンで区切ります。</li>
		<li>ページの下部に、アッセイ条件に一致するように、アッセイ温度(22°C)、一価および二価のカチオン濃度(それぞれ20 mMおよび25 mM)を示します。相互作用するシーケンスの濃度を示します。</li>
		<li>Submit(送信)を押します(補足図3B)。結合のギブスエネルギー変化、エンタルピー変化、エントロピー変化、および対応する二本鎖のTm値を含む結果を観察します(補足図3B)。</li>
		<li>完全に一致したターゲット(M)とSLAS-SおよびSLAS-Uのターゲット結合アームとの間のデュプレックスのTm値が 、アッセイ温度(現在のプロトコルでは22°C)を超えていることを確認してください。ここで、Tm値は それぞれ32.2°Cと74.4°Cでした(補足図3C)。</li>
		<li>SLAS-SとSNSを含む不一致ターゲット(MM)との間のデュプレックスがアッセイ温度よりTm 低いことを確認してください。これにより、プローブ-ターゲット認識の高い選択性が確保され、SLAS結合フラグメントにSNSが含まれている場合、AOフルオロゲンが標的核酸分析物の存在を知らせるのを防ぎます(図2)。ここで、Tm は21.3°Cであり(補足図3C)、これは一致した複合体との不一致を区別するのに十分でした。</li>
		<li>必要に応じて、ターゲット相補的フラグメントを短縮または延長することにより、ターゲット結合アームの配列を調整し、示された安定性要件を満たす。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>カスタムメイドのDNAオリゴヌクレオチドを供給する商用ベンダーから設計されたストランドSLAS-SおよびSLAS-Uを入手するか、自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用して社内でDNAストランドを合成します。</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig1.jpg"> 
図1:蛍光灯アプタマー(FLAP)DAP-10-42から分割式ライトアップアプタマーセンサー(SLAS)への変換。 (ア)DAP-10-4212の二次構造は、22°C、20 mM Na+、25 mM Mg2+でのUNAFold Web Server19のDNAフォールディングアプリケーションによって予測されます。アプタマーは、ヘアピン二次構造を特徴としており、コアはおそらくステム1によって安定化されたG-四重モチーフに折り畳まれます。DAP-10-42をSLASに変換するには、(1)アプタマーのステム1を4 bpに短縮し、さらにG-C bpを挟んでステム1'にします。(2)コア配列はNTS 29とNTS 30に分割され、分割部位の3'側と5'側は、それぞれ相補的な配列d(GGTCAT)とd(ATGACC)で拡張され、ステム2になります。(3)ステム1'は、目的のターゲットの隣接するフラグメントであるターゲット結合アームに相補的な配列で拡張され、ターゲット結合アームとプローブのシグナル報告ドメインとの間にd(TT)リンカーがあります。(B)コアは、シグナルの大幅な損失および/または蛍光倍増なしに、nts 28〜29、27〜28、または26〜27に分割することもできる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig2v2.jpg"> 
図2:SLAS信号生成メカニズム。 SLASは、SLAS-UとSLAS-Sの2本のストランドと、蛍光色素(Auramine O;AO)です。目的の核酸ターゲットがない場合、両方の鎖は解離状態にあり、色素に結合できません。信号は観測されません(中央)。完全に一致したターゲット M が存在する場合、SLAS-U と SLAS-S の両方が 隣接する M フラグメントにハイブリダイズして、コアフラグメントを近接させます。これにより、色素結合部位の形成が可能になります。AOの結合はその蛍光を増強し、これは蛍光シグナルの読み出しとして測定されます(左)。SLAS-Sと相互作用するフラグメント中に一塩基置換(SNS)を含むミスマッチな標的 MM が存在する場合、SLAS-Uのみが MM 標的にハイブリダイズでき、SLAS-Sは解離状態にあります。これにより、色素結合部位の形成が防止され、シグナルは観察されません(右)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
2. 標的配列の増幅
<ol>
	<li>解析対象の遺伝子のフラグメントをSLASアッセイで増幅します。PCRまたはRPA増幅には、非対称条件(例えば、Forward PrimerをReverse Primerの10倍過剰に添加)を使用して、一本鎖アンプリコンを生成します。Linear After The Exponential(LATE)PCR20を使用してNANOGP8遺伝子由来の126 ntフラグメントを増幅するには、表2にリストされているプライマー配列を使用します。ここでは、遺伝子の126-ntフラグメントに対応する一本鎖DNAテンプレート(テンプレートNANOGP8またはテンプレートG1423C、表2)を使用した。このテンプレートは、Integrated DNA Technologies, Inc.によってカスタム合成されました。<ol>
		<li>10 μL の 10x Standard Taq Reaction Buffer と 2 μL の 10 mM dNTP ミックス (最終濃度が 0.2 mM)、10 μM フォワードプライマー 10 μL と 10 μM リバースプライマー 10 μL を混合して、100 μL の PCR 反応液を調製します (最終濃度が 1 μM および 0.1 μM の場合、10 μM 未満)。 それぞれ)、0.5 μL の 5U/μL Taq DNA ポリメラーゼ、DNA テンプレート、およびヌクレアーゼフリー水。テンプレートなしのコントロールの場合は、テンプレートの代わりに水を追加します。</li>
		<li>次の熱サイクル条件を使用します:95°Cで1分間の初期変性。(1)95°Cで15秒間の変性、(2)60°Cで30秒間のプライマーアニーリング、(3)68°Cで30秒間のプライマー伸長の45サイクル。最後に68°Cで5分間延長します。 注:特にRNAテンプレートが増幅に利用可能な場合は、PCRまたはRPAの代わりにNASBA18 などの転写ベースの増幅技術を使用することができます。NASBAは、マイクロモル範囲の最終製品濃度で一本鎖RNAアンプリコンを生成します。これは、製品濃度なしで下流のSLASアッセイで使用するのに十分な高さです。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0.1倍量の3 M酢酸ナトリウム(pH 5.5)と3倍量のエタノールを加えて、増幅したサンプルをエタノールで沈殿させます。-20°Cで1時間インキュベートし、12,000-18,000 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。</li>
	<li>ペレットを70%エタノールで洗浄し、再遠心分離し、上清を再度廃棄します。ペレットを風乾し、SLASアッセイで使用するヌクレアーゼフリー水10μLに溶解します。</li>
</ol>
3. SLASを用いた蛍光アッセイ
<ol>
	<li>AO (0.1 mM DMSO 溶液中、10x)、SLAS-S (10 μM ヌクレアーゼフリー水溶液、10x)、SLAS-U (10 μM ヌクレアーゼフリー水溶液 10x)、および 4x アッセイバッファー (80 mM Tris-HCl、pH 7.4、100 mM MgCl2、80 mM KCl) のストック溶液を調製します。 注:カリウムイオンは、色素結合部位の一部であるアプタマーの推定G四重鎖モチーフを安定化するために必要です。1xアッセイバッファー中のわずか1 mM KCl(25 mM MgCl2)で、ブランク(非標的サンプル; 補足図2B)。マグネシウムイオンは、核酸鎖(SLAS-S、SLAS-U、および標的間)の相互作用を安定化させます。1x Assay Buffer 中の Mg2+ の濃度は、少なくとも 5 mM (20 mM KCl;補足 図2C、D)。AOの原液(~1 mM)はDMSOで調製します。SLAS-S および SLAS-U のストック濃度は任意であり、ストランドの最終濃度が維持されている限り、必要に応じて調整できます (ディスカッションの最終 SLAS 濃度の選択の根拠を参照してください)。 注意: AOは、飲み込むと有害で、皮膚に接触すると有毒で、がんを引き起こす疑いがあります。AOソリューションを使用するときは、常に手袋を着用してください。AOの秤量およびその標準的な解決の準備は化学フードの下でなされるべきである。</li>
	<li>ターゲットを除くすべてのアッセイ成分を含むマスターミックスを調製します。サンプル容量(60 μL)にサンプル数に1を加えた数(n + 1)を掛けて、マスターミックス容量(Vミックス)を計算します。 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68483/68483eq01.jpg" style="margin: auto;"> サンプル数 n には、必要なネガティブコントロールとポジティブコントロールを含める必要があります。</li>
	<li>0.25x Vmix μL の 4x Assay Buffer、 0.1x Vmix μL の 0.1 mM AO、 0.1x Vmix μL の 10 μM SLAS-S、および 0.1x Vmix μL の 10 μM SLAS-S を組み合わせます。ステップ3.4で追加した目標容量に対応するように、 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68483/68483eq02.jpg" style="margin: auto;"> の最終容量にヌクレアーゼフリーの水を追加します。マスターミックスをボルテックスし、短時間遠心分離します。マスターミックス50μLをn本のサンプルチューブに分注します。 注:サンプル量は、蛍光シグナルの検出に使用される装置の特性に応じて調整できます。サンプルチューブに分注されるマスターミックスの容量は、ステップ3.4で追加された目標容量に基づいて調整できます。マスターミックスを作るために加えられるヌクレアーゼフリー水の量は、それに応じて調整する必要があります。例えば、ターゲットを含むサンプルを最終サンプル量の10%(V/V)で添加する場合、マスターミックスに最大0.9x Vミックスまで水を追加する必要があります。</li>
	<li>1つのサンプルをノーターゲットコントロール(空白)として使用し、1つのサンプルをポジティブコントロールとして使用します。ターゲット含有サンプル10μLをマスターミックス(50μL)に加え、10-1000 nMのターゲットを含む最終サンプル量60μLにします。ブランクには、ターゲットの代わりにヌクレアーゼフリーの水(10μL)を使用してください。ポジティブコントロールには、標的配列を含む合成DNAオリゴヌクレオチドを使用します(例:ターゲットM、 表1)。0.6-3 μMコントロールを10 μL加えて、最終濃度を0.1-0.5 μMにします。 注:このポジティブコントロールの高い蛍光により、テストされた未知サンプルに対して負のシグナルが観察された場合でも、アッセイが期待どおりに機能します。</li>
	<li>サンプルを混合し、微量遠心分離機を使用してスピンダウンします。サンプルを22°Cで10〜60分間インキュベートします。信号は、40分から60分の間に&lt;15%しか増加しません(図3)。</li>
	<li>蛍光分光光度計を使用して、475 nmで励起したサンプルの540 nmでサンプルの蛍光を測定します。 注:薄肉PCRチューブの蛍光を測定するポータブル蛍光光度計を使用することが可能です。蛍光光度計には、AO蛍光の検出に適した励起フィルターと蛍光フィルターが必要です。適切な励起フィルタの例としては、495 nmのショートパスがあります。適切な発光フィルタの例は、510〜580nmである。あるいは、UVまたは青色光源を用いてサンプル中のAO蛍光を励起すると、シグナルを視覚的に観察することができます。 注意: UVの場合amp 使用される場合は、UV保護ゴーグルを着用してください。</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig3.jpg"> 
図3:SLAS-29U/30Sの信号生成の時間依存性 AO、SLAS-29U、SLAS-30Sを含む試料を、蛍光分光光度計の速度論モード(475 nm励起、540 nm発光、5 nm励起/発光スリット)を用いて60分間にわたって分析しました。5分後(矢印で示される)に、ターゲット M をサンプルに加えました。データは、2つの独立した試験から平均化されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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<li>Chen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+of+free+and+protein-bound+auramine+O%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fluorescence of free and protein-bound auramine O.</a> Arch Biochem Biophys. 179 (2), 672-681 (1977).</li>
<li>Klymchenko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvatochromic+and+fluorogenic+dyes+as+environment-sensitive+probes%3A+Design+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Solvatochromic and fluorogenic dyes as environment-sensitive probes: Design and biological applications.</a> Acc Chem Res. 50 (2), 366-375 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>オーラミンO</td><td>MPバイオメディカル&nbsp;</td><td>195064</td><td>シグナルレポートに使用される蛍光色素</td></tr><tr><td>ケーリー・エクリプス蛍光光度計</td><td>アジレントテクノロジーズ</td><td>G9800A</td><td>サンプルの蛍光シグナルを測定するため</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>MPバイオメディカル&nbsp;</td><td>196055</td><td>Auramine Oの原液を調製するための溶媒</td></tr><tr><td>DNAオリゴヌクレオチド(プライマー、SLAS鎖、PCR用合成テンプレート)</td><td>IDTの</td><td>該当なし</td><td>ベンダーによってカスタムメイドおよび脱塩され、それ以上の精製なしで使用されます</td></tr><tr><td>dNTPミックス、10 mM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R0191</td><td>LATE PCR反応用</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>インビトロゲン</td><td>AM9530G</td><td>バッファコンポーネント;プローブの鎖と分析対象物との正しい関連付けに必要</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ(1.5mL)</td><td>フィッシャーブランド</td><td>02-681-320</td><td>サンプル前処理用プラスチック</td></tr><tr><td>マイクロピペット(0.1-2.5&micro;L)</td><td>エッペンドルフ</td><td>K56877G</td><td>サンプル前処理に使用</td></tr><tr><td>マイクロピペット (100-1000 & micro;L)</td><td>エッペンドルフ</td><td>K13160F</td><td>サンプル前処理に使用</td></tr><tr><td>マイクロピペット(20-200&micro;L)</td><td>エッペンドルフ</td><td>J05253M</td><td>サンプル前処理に使用</td></tr><tr><td>マイクロピペット(2-20&micro;L)</td><td>エッペンドルフ</td><td>G24675G</td><td>サンプル前処理に使用</td></tr><tr><td>ミニ遠心分離機</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>6770</td><td>サンプル&NBSPをスピンダウンするために使用されます。</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水(DEPC処理されていない)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9932</td><td>PCRおよびSLASアッセイのサンプルに使用</td></tr><tr><td>PCRチューブ(0.5mL)</td><td>インビトロゲン</td><td>AM9932</td><td>Quantus蛍光光度計を使用して蛍光を測定する</td></tr><tr><td>ピペットチップ(20-200&micro;L)</td><td>VWRの</td><td>76322-150</td><td>サンプル前処理用プラスチック</td></tr><tr><td>ピペットチップ(1-10 uL)</td><td>VWRの</td><td>76322-528</td><td>サンプル前処理用プラスチック</td></tr><tr><td>塩化カリウム&nbsp;</td><td>インビトロゲン</td><td>AM9640G</td><td>バッファコンポーネント;プローブの蛍光ライトアップアプタマードメインを正しく折りたたむために必要</td></tr><tr><td>Quantus蛍光光度計</td><td>プロメガ</td><td>E6150</td><td>蛍光測定に使用できるポータブル低コスト蛍光光度計</td></tr><tr><td>クォーツキュベット</td><td>スターナ</td><td>16.50F-Q-10/Z15</td><td>Cary Eclipse蛍光光度計を使用した蛍光測定に使用します。</td></tr><tr><td>標準Taqバッファーを含むTaq DNAポリメラーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0273S</td><td>SLASアッセイ&nbspで分析する遺伝子断片の増幅用。</td></tr><tr><td>Tris-HClバッファー(pH 7.4)</td><td>ボストンバイオプロダクツ</td><td>R-314</td><td>バッファコンポーネント</td></tr><tr><td>UVランプ</td><td>UVP (紫外線)</td><td>95-0016-14</td><td>視覚信号観察のためのAOを励起する</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>VWRの</td><td>10153-838</td><td>サンプルの混合に使用</td></tr></tbody></table>

dna蛍光発光アプタマーをシグナルレポーターとして用いたスプリットハイブリダイゼーションプローブによる塩基配列特異的核酸解析

Split Hybridization Probe Utilizing a DNA Fluorescent Light-up Aptamer as a Signal Reporter for Sequence-Specific Nucleic Acid Analysis

DAP-10-42コアをシグナルレポーターとして用いたSLASの性能は、侵攻性の脳腫瘍である多形性膠芽腫(GBM)の進行に重要なNANOGP8遺伝子の断片を調べるように設計されたプローブを用いて実証された21。この断片は、がん細胞に由来するエクソソームのDNAカーゴにSNSが含まれていることが報告された22。そのため、SLASは遺伝子のSNS部位に合わせて調整されました。このプロトコルでSLAS性能を実証するために、それぞれnt 1423(GenBank NM_001355281.2)のGまたはCのいずれかを含むNANOGP8遺伝子の配列を模倣する合成DNAターゲットMまたはMMを使用しました。ターゲットMはSLAS-S鎖と完全に相補的でしたが、ターゲットMMはSLAS-SとG&gt;Cの不一致を含んでいました(表1)。SLAS-Uのターゲット結合フラグメントの配列は、Mターゲットと<...

DNA蛍光発光アプタマーをシグナルレポーターとして用いたスプリットハイブリダイゼーションプローブによる塩基配列特異的核酸解析

DNA-based fluorescent light-up aptamers (FLAPs) are promising for bioanalytical assays because they provide a low-cost fluorescent signal readout without ...

split-hybridization-probe-utilizing-dna-fluorescent-light-up-aptamer

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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日立F - 7000蛍光分光光度計とPicoGreen色素を使用してdsDNAの定量化

このビデオでは、MCPyVビリオンに感染した細胞をin situハイブリダイゼーション連鎖反応にかけ、MCPyV特異的なゲノムを検出しました。さらに、DNA-HCR技術をFISHと組み合わせて、感染したヒト皮膚細胞のMCPyV...

HCR-DNA FISH:感染細胞中のウイルスDNAを検出するための蛍光In Situハイブリダイゼーション技術

このビデオでは、mRNAプローブを特定の標的mRNAにハイブリダイズするシーケンシャルハイブリダイゼーション戦略について説明しています。プローブハイブリダイゼーションに続いて、組織学的サンプルのRNA-CISH中にシグナル対ノイズ比を減少させることにより分解能を向上させるために、シグナル増幅が行われます。...

RNA In Situハイブリダイゼーションにおけるプローブハイブリダイゼーションとシグナル増幅:組織切片中の特定のRNA配列を検出するための技術

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直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH

ここでは、スライドマウント染色体上の反復ヘテロクロマティック配列を可視化するために、蛍光DNAのin situハイブリダイゼーション(DNA...

蛍光DNAための簡単​​な方法<em&gt;その場で</em&gt;ぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション

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光安定シアニン色素を用いた波長シフトDNAハイブリダイゼーションプローブの合成

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DNAzymeベースのナノマシンは、核酸の高選択性と高感度な検出に使用できます。この記事では、フリーソフトウェアを使用した10-23コアのDNAzymeベースのナノマシンの設計に関する詳細なプロトコルと、例としてEpstein-Barrウイルスフラグメントの検出におけるそれらのアプリケーションについて説明します。...

DNAzyme 10-23 - 核酸認識用ナノマシン

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核酸は、生物学的システムを評価するための一般的な分析物ですが、酵素操作によるバイアスが懸念を引き起こす可能性があります。ここでは、ポリアニリンを用いた核酸のラベルフリー検出法について説明します。この高感度で費用対効果の高いセンサー技術は、分子間の一塩基の違いを区別することができます。...

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