生きたラベルフリー乳がん細胞の表現型解析を進めるためのマルチモーダルイメージングフレームワーク

現在、私たちのプロトコルでは、共焦点ラマン顕微分光法と断層撮影位相顕微鏡法を使用して、ネイティブの生理学的環境におけるヒト乳がん細胞の迅速かつ偏りのない形態化学的表現型解析を行うマルチモーダルイメージングを提示します。ラマン顕微鏡分光法と断層撮影位相顕微鏡を組み合わせることで、生理学的条件下でのラベルフリーイメージングが可能になり、細胞に関する生化学的および形態学的情報が得られ、蛍光標識や化学固定などの従来の摂動法の限界に対処できます。私たちの結果は、乳がん細胞の形態化学的表現型解析を提供する上でマルチモーダルアプローチを実装する高い可能性を示しています。さらに、その多用途性、再現性、非侵襲性により、基礎的な細胞生物学研究から診断に至るまで、幅広い生物医学応用に有望なツールとなりました。

再生医療や疾患研究を進めるために、非侵襲的な胚の品質管理、細胞老化の検出、オルガノイドモデルにおける薬物スクリーニングのための光学バイオマーカーのアトラスを作成することを目指しています。

[講師]まず、MDA-MB-231ヒト乳がん細胞サンプルをオンステージインキュベーターに入れます。水浸の目的に水を追加します。自動水浸フィーダーのスイッチを入れて、対物レンズに水を供給します。蒸発を避けるために水位を定期的にチェックし、測定全体を通じて一貫した画像状態を確保してください。次に、ポンプレーザーをオンにし、その出力を調整して、サンプル面で75ミリワットのレーザー出力を達成します。Micro-Manager顕微鏡制御ソフトウェアを開きます。構成設定で [BF] を選択し、ソフトウェア ウィンドウの左側にある [ライブ] をクリックします。目的の単一セルを選択し、[停止] をクリックして明視野の視覚化を終了します。CCDカメラ制御ソフトウェアを開きます。実験設定では、露光時間を1.5秒に設定します。実験ツールバーの[実行]をクリックし、レーザービームをオンにします。次に、Z位置を調整して、指紋領域の信号数を600〜1,800逆センチメートルに最大化し、レーザーをオフにします。実験ツールバーの停止をクリックし、ソフトウェアを終了します。多次元測定でラマン チャネルを自動的に管理し、データを保存する MATLAB スクリプトを使用してデータ集録プロセスを開始します。視野を 50 x 50 マイクロメートル四方に設定し、解像度は 40 x 40 ピクセルで、各ピクセルは 1.25 x 1.25 マイクロメートル四方をカバーします。各ラマンスペクトルの露光時間を 1.5 秒に設定し、MATLAB スクリプトを実行します。ラマンハイパースペクトルマップの後処理には、RamApp Webベースのツールを起動します。[マイ分析]タブの[新規]をクリックしてハイパースペクトルデータをインポートし、空間データ変数とスペクトルデータ変数を含む.matファイルをX軸変数とともにアップロードします。スペクトルを切り捨てるには、クロップと回転メニューでスペクトルクロップを選択します。ラマンシフト領域の下境界と上境界をそれぞれ600と1,800の逆センチメートルと定義します。宇宙線を補正するには、ノイズ除去に移動し、スパイクをクリックし、方法として Z スコアを選択し、しきい値を 8 に設定します。オプション [最初の差分を使用] と [スパイクを補正] にチェックを入れ、[実行] をクリックして補正を適用します。マップからノイズを削除するには、[スムーズマップ]をクリックし、中央値フィルターを選択し、正方形のサイズを 3 ピクセルに設定して、[実行]をクリックします。各ピクセルのスペクトルを滑らかにするには、Savistky-Golayフィルターを選択します。フィルターウィンドウの長さを 7 に設定し、多項式の次数を 2 に設定し、[実行] をクリックします。平均バックグラウンド信号を差し引くには、光学基板除去を開き、基板の識別をクリックします。2つのクラスターを持つ方法としてk-meansを設定します。次に、「詳細オプション」をクリックします。形態学的クリーニングを選択して、フォアグラウンドから小さなブロブを削除し、[実行]をクリックします。平均バックグラウンド信号を削除するには、[基質の削除]をクリックし、グローバル平均または中央の95%の値の平均法を選択して、[実行]をクリックします。ベースライン蛍光を補正するには、ベースラインパネルを開き、正しいベースラインをクリックし、適応平滑度PLSを選択し、ラムダを500万に設定して実行をクリックします。各ラマンハイパースペクトルマップの正規化については、[その他] に移動し、[正規化] を選択し、[Frobenius 法] を選択して、[実行] をクリックします。細胞内分布を示す偽色画像を生成するには、画像パネルで、強度画像の下にあるメニューを開く記号をクリックし、画像の編集をクリックします。編集パネルで、単一バンドを選択し、スペクトル範囲を定義します。次に、カラーマップで二重色を選択し、色、強度しきい値、不透明度を定義してから、「確認」をクリックします。単一点スペクトルをダウンロードするには、目的のピクセルを選択し、スペクトルの凡例パネルで [スペクトルのダウンロード] をクリックします。最後に、前景と基板のスペクトルをエクスポートするには、スペクトルの凡例に移動し、前景と基板の両方のセクションのスペクトルのダウンロードをクリックします。顕微鏡の対物レンズに蒸留水を一滴垂らします。サンプルを顕微鏡の移動ステージに配置し、サンプルの位置を調整して対物レンズに合わせます。 顕微鏡の電源を入れ、イメージングソフトウェアを起動します。ツールバーの顕微鏡アイコンをクリックします。初期化後、設定をクリックし、ジョブパネルでライブセルを選択し、培地としてPBSを選択します。次に、イメージングソフトウェアのコントロールパネルのキャリブレーションタブにアクセスします。対物レンズとコンデンサーレンズの軸位置は、それぞれ焦点と表面を選択して設定します。次に、スキャン モードをクリックしてレンズを手動で調整し、照明パターンが中央に配置され、ほぼ静的であることを確認します。通常モードを選択し、移動ステージを調整してセルを視野に入れ、サンプルに焦点を合わせます。移動ステージを調整して、セルのない領域を見つけます。[キャリブレーション] を選択して、さまざまな照明角度で複数の 2D ホログラムをキャプチャします。変換ステージを調整してセルを中央に配置し、[取得]タブに移動して[3Dスナップショット]を選択して、セルの断層撮影をキャプチャします。ホログラフィック断層撮影を視覚化するには、データナビゲーションパネルでデータを選択し、右クリックして [開く] をクリックします。データマネージャーパネルで、[RI断層撮影]をクリックします。ボリュームビジュアライゼーションパネルで [RI] を選択し、RI キャンバス内に 4 つの長方形のカラーボックスを描画します。各カラー ボックスの RI 範囲の最小値と最大値を設定し、不透明度とカラーを各ボックスに関連付けます。[保存] をクリックして、定義した RI 範囲とカラー ボックスを保存します。細胞形態の定量的記述子を取得するには、分析インターフェイスを利用します。セグメンテーションパネルで「手動」を選択し、RIしきい値として1.3450を設定して「適用」をクリックします。[保存]をクリックして、計算された形態学的指標を保存します。ラマンスペクトルマッピングにより、個々のMDA-MB-231細胞内の細胞質、核、フェニルアラニン、脂質の空間分布が明らかになりました。細胞質、核、フェニルアラニン、脂質に対応する明確なラマンスペクトルピークが、600〜1,800逆センチメートルの指紋領域で確認されました。単一細胞の屈折率ヒートマップにより、軸方向のXY面、矢状面YZ面、および冠状XZ面における細胞内成分の内部分布が明らかになりました。3D断層撮影再構成により、内部下部構造に対応する体積屈折率の領域が同定された。単一のMDA-MB-231細胞の定量的形態学的測定では、総体積4024.189立方マイクロメートル、表面積2383.707平方マイクロメートル、平均屈折率1.356で、細胞形態の異なる記述子が示されました。