ターゲットエンリッチメントワークフローを使用した臨床サンプルからの全細菌ゲノムの生成

ゲノムは、病原体の祖先、伝播、および能力に関する情報を提供できます。培養不可能な細菌の場合、この情報はターゲット濃縮によってのみ取得できます。臨床サンプルから直接細菌性病原体の配列決定を行うことは、圧倒的なヒトDNA、多様な微生物叢、および細菌負荷が極めて低いため、困難です。

多くの場合、サンプリング方法と気難しい細菌のために、培養は選択肢にありません。この技術を性感染症菌に適用する中で、ompA遺伝子型L4と呼ばれるクラミジア・トラコマチスLGV系統を発見し、優性LGV系統の世界的な拡大を確認し、分子診断・疫学サーベイランスに重要な知見をもたらしました。このプログレスエンリッチメントプロトコルにより、陽性と診断されたSTI臨床サンプルから完全なゲノム回復が可能になります。

この技術は、メタゲノムディープシーケンシング、宿主DNA枯渇、ナノポア適応シーケンシングよりも優れていることがわかりました。私たちは、ヨーロッパとアルゼンチンでこれらの病原体の流行株を調査しています。これは、感染と抗菌薬の管理に関する情報を提供する可能性があります。

まず、高感度で正確な蛍光ベースの方法を使用して、臨床サンプルからの DNA 抽出物の DNA 濃度を測定します。ヌクレアーゼフリーの水を使用して各DNAサンプルを10〜200ナノグラムに希釈し、各PCRチューブストリップの最終容量は17マイクロリットルになります。17マイクロリットルの希釈DNAを含む各ウェルに3マイクロリットルのフラグメンテーションマスターミックスを加えます。

上下に20回ピペットで十分に混合します。次に、PCRチューブストリップを密封します。ストリップを10秒間高速で渦にし、短く回転させて内容物を集めます。

次に、PCRチューブストリップをサーマルサイクラーに入れ、フラグメンテーションとインキュベーションのために事前にプログラムされたプロトコルを開始します。次に、表に示すようにエンドリペアとdAテーリングマスターミックスを準備します。先ほど示したようにチューブをボルテックスして回転させ、氷の上に置いたままにします。

次に、20マイクロリットルの末端修復とdAテーリングマスターミックスを、50マイクロリットルのDNAフラグメントを含む各ウェルにピペットで入れます。ストリップをシールし、高速で8秒間ボルテックスします。ストリップを短時間回転させた後、サーマルサイクラーに戻します。

サーマルサイクラープログラムが終了したら、PCRチューブストリップを氷の上に置きます。次に、30〜45分前に調製した25マイクロリットルの室温ライゲーションマスターミックスを、DNA断片を含む各ウェルに加えます。NBCタグ付きライブラリー用のアダプターオリゴミックスを5マイクロリットルの各ウェルに加えます。

すぐにPCRチューブストリップをサーマルサイクラーに戻し、プログラムを続行します。DNA精製を開始するには、磁気ビーズを摂氏4度から回収し、使用前に室温に戻します。次に、各サンプルウェルに80マイクロリットルを加えます。

PCRチューブストリップを磁気スタンドに置き、200マイクロリットルの70%エタノールで各ウェルを2回洗浄します。各洗浄中に1分間待って、磁気ビーズを乱さずにエタノールを慎重に取り除きます。ビーズを35マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水と5分間混合してインキュベートした後、各ウェルから透明化した上清を慎重に吸引し、新しいPCRチューブストリップ内の対応するウェルに移します。

新しいPCRチューブストリップを氷の上に置き、磁気ビーズを捨てます。調製したプレリキャプチャPCR反応ミックスを取り、精製されたDNAライブラリを含む各サンプルウェルに11マイクロリットルを加えます。選択したインデックスプライムリペアを各反応に5マイクロリットル追加し、PCRチューブストリップを密封します。

表に指定されているように、PCR増幅用のサーマルサイクラープログラムを開始して、プレキャプチャPCRを実行します。PCRチューブストリップは、サーマルサイクラーが摂氏98度に達した場合にのみ追加してください。プレキャプチャPCRが完了したら、別のビーズベースのクリーンアップを実行してライブラリを精製します。

PCR産物を磁気ビーズでインキュベートします。次に、PCRストリップチューブを磁気分離装置に置き、溶液が透明になるまで5〜10分待ちます。ストリップをマグネットスタンドに残したまま、各ウェルから透明な上清を慎重に取り除き、廃棄します。

次に、15マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水でDNAを溶出し、精製されたDNAライブラリーのDNA濃度を測定します。サンプルハイブリダイゼーションの場合は、ここで指定されているプロトコルに従ってサーマルサイクラーをプログラムします。プログラムを開始し、すぐに実行を一時停止します。

調製したDNAライブラリーの500〜1, 000ナノグラムをヌクレアーゼフリーの水を使用して12マイクロリットルの最終容量に希釈する。オリゴヌクレオチドブロッカー混合物をボルテックスしてスピンダウンさせた後、各サンプルチューブに5マイクロリットルを加えます。PCRチューブストリップを密封し、サーマルサイクラーに入れます。

サーマルサイクラーがプロトコルのステップ3に達したら一時停止します。ストリップをサーマルサイクラー内に保ちながら、調製した室温プローブハイブリダイゼーションミックスを各サンプルに13マイクロリットル加えます。ゆっくりと上下に8〜10回ピペットで混ぜます。

気泡がないことを確認し、ストリップをサーマルサイクラーに戻します。次に、すべてのチューブがしっかりと密閉されていることを確認します。ハイブリダイズしたライブラリーを捕捉するには、各チューブから200マイクロリットルのプレ洗浄ストレプトアビジンビーズを含む対応するチューブに全容量を移します。

ストレプトアビジンビーズを室温洗浄バッファーで洗浄する前に収集します。PCRチューブストリップを磁気分離器から取り外したら、摂氏70度に予熱した200マイクロリットルの高温洗浄バッファーを加え、上下にピペッティングしてビーズを再懸濁します。チューブストリップを密閉し、高速でボルテックスし、前述のように素早く回転させます。

密閉されたチューブストリップを摂氏70度のサーマルサイクラーブロックに入れ、5分間インキュベートします。PCRチューブストリップをサーマルサイクラーから室温で磁気分離器に戻します。溶液が明確になるまで1分間待ちます。

次に、上清を慎重に取り除き、廃棄します。次に、ビーズを含む各チューブに25マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えます。ここに示す表の指定に従ってサーマルサイクラーをプログラムします。

調製したキャプチャー後PCR反応ミックス25マイクロリットルを各サンプルチューブに加えます。懸濁液が均一になるまで反応を混合し、PCRチューブストリップを回転させずにしっかりと密閉します。密封されたPCRチューブストリップをサーマルサイクラーに入れます。

PCR産物を新しいチューブに移した後、各サンプルチューブに50マイクロリットルのビーズ懸濁液を加え、前述のようにDNAクリーンアップを実行します。蛍光ベースの定量法を使用して、最終精製されたライブラリーDNAのDNA濃度を測定します。ターゲットエンリッチメントにより、クラミジア・トラコマチス、淋菌、梅毒トレポネーマ、マイコプラズマ・ジェニタリウムなど、試験したすべての病原体で直接配列決定と比較して、オンターゲットリードの割合が有意に高くなり、完全なゲノムが得られました。

ゲノム配列決定の成功は、主に4つの病原体すべてでqPCRサイクル閾値が30未満のサンプルで観察されました。クラミジア・トラコマチスのCT値とオンターゲットリードの割合との間には明確な逆相関があります。ハイブリダイゼーション温度を従来の摂氏65度と比較して摂氏62.5度にすることで、他の標的病原体のパフォーマンスを低下させることなく、マイコプラズマ・ジェニタリウムのゲノムカバレッジを改善しました。

アルゼンチン産クラミジア・トラコマチスゲノムの系統解析では、L2bクレード内に多くのサンプルがクラスター化していることが示され、約600の一塩基多型によって以前のすべてのLGVゲノムから分離されたompA遺伝子型L4として提案された新しい系統が明らかになりました。