ウイルス学における走査型透過型電子顕微鏡断層撮影:高圧凍結凍結置換サンプルの3Dイメージング

ウイルス感染は細胞インフラに大きな変化をもたらす可能性があります。これらの変化を三次元で可視化するために、ウイルス感染細胞の画像化にSTEM断層撮影を用います。STEM断層撮影は時間がかかり、労力もかかります。

そのため、ウイルス感染したセットなどの生物製サンプルに対して最適なサンプル準備が不可欠です。従来のSTEM断層撮影は約200ナノメートルのサンプル疾患に限定されます。当社のプロトコルにより、より厚い断片の3Dイメージングが可能です。

これにより、ウイルス感染細胞や超構造的変化をより包括的に可視化することが可能になります。多くのがん溶解ウイルスはすでに臨床試験段階にあり、世界中の研究者と開発者が協力し、がん治療の限界を押し広げています。電子顕微鏡やSTEM断層撮影などの最先端技術が新たな知見をもたらしています。STEM断層撮影と新しい調製プロトコル、他の顕微鏡技術を組み合わせることで、ウイルス学的な疑問に引き続き答えていきます。

まず、LNボックスに液体窒素を充填し、高圧凍結またはHPFホルダーから貯蔵カプセルへ凍結したサファイアディスクを移す準備をします。冷凍の際に必要に応じてLNボックスに補充できるように、液体窒素を入れたデュワーを近くに置いておくと良いでしょう。断熱ピンセットを用意しておきましょう。

HPF後にサファイアディスクを入れるサンプル容器を用意してください。蓋をつけて、液体窒素が流れるようにいくつかの穴があり、浮かばないように小さな重りを用意してください。ラベル容器を使用前にLNボックスに入れて予冷してください。

その後、サンプルをインキュベーターに入れます。高圧凍結を始める前に、逆光顕微鏡でサファイアディスクを検査し、十分な細胞と良好な細胞質を確認しましょう。HPFを行うには、培養皿からサファイアディスクを1枚取り、フィルターペーパーに素早く軽く叩いて余分な媒体を除去します。

ディスクをHPFホルダーに入れ、カーボンコーティング面を上に向けて、数字の2が読み取れるようにします。金のスペーサーをヘキサデケーンに浸し、そっとサファイアディスクの上に置きます。2つ目のサファイアディスクをスペーサーの上に置き、カーボンコーティングされた側が下向きにしてサンドイッチ構成を作り、セル同士が互いに向かって配置し、空気が詰まらないようにします。

HPFホルダーは慎重に素早く閉じて、サンプルへの負荷を軽減してください。HPFホルダーを高圧冷凍庫に差し込みます。メーカーの指示に従ってロックし、冷凍処理を開始してください。

次に、HPFホルダーをLNボックスに移します。次に、サファイアディスクを載せた先端を予備冷却のLNボックスに移します。慎重にディスクをホルダーから取り出してください。

自由置換溶液で満たされた密閉クライオバイアルを、マイナス90度Cまで冷却された自由置換装置に入れます。溶液が同じ温度になるまで待ちます。ピンセット、メス、ペンチ、または大型ピンセットを液体窒素に浸してサファイアディスクの転移に使います。

高圧で凍結されたサンプルを自由置換装置に移します。サファイア円盤を一つずつ分離し、液体窒素に浸したまま保存してください。そして、各ディスクを個別にフリー置換液付きのクライオバイアルに素早く移し、ディスクが完全に浸かるようにします。

クライオバイアルを閉じた後、すぐに自由置換装置に戻します。すべてのサンプルが置かれたら、置換プロセスを始めます。サンプルが20度に達したらすぐに。

サンプルを100%アセトンで3回、それぞれ30分間洗い続けます。サンプルを事前に埋め込むには、サンプルを3分の1のエポキシ樹脂と3分の2のアセトンで1時間培養します。サンプルを3分の2のエポキシ樹脂と1/3のアセトンで1時間培養した後、溶液を100%エポキシ樹脂と交換し、バイアルの蓋を開けて一晩培養し、翌日に残りのアセトンが蒸発するのを待つ。サファイアディスクを新たに標識された反応チューブに移し、新たに準備されたエポキシ樹脂を充填する。

円盤をチューブの壁に水平に支えた位置に置き、セルのある側が上を向くようにします。次に、反応チューブを蓋を開けた状態で60度のオーブンに入れ、樹脂が少なくとも48時間重合します。エポキシ樹脂が重合した後、閉じた反応チューブの先端を液体窒素に約10秒浸します。

テーブルの反応チューブを叩いて樹脂ブロックを解放します。サファイアディスクはカーボンコートから簡単に分離し、カーボンは埋め込まれたセルに付着したままです。埋め込みサンプルの関心領域を選択し、サンプルサイズを対象領域に絞り込みます。

ダイヤモンドナイフを用いたウルトラマイクロトーンを用いて、ポリL-リジン処理された膠片を帯電した平行棒グリッド上で約1マイクロメートルの厚さの断片を採取し、STEMイメージングおよびSTEM断層撮影を行います。コロイド金を基点として処理し、カーボンコーティングを施します。超薄片を切断・検査した後、試料はイメージングの準備が整います。

研究の質問に基づいて、明視野検出器、暗視野検出器、またはその両方を挿入してください。スキャンモードを起動して、サンプルのテスト画像を取得してください。最終的な望む倍率より80万倍以上の倍率を選びます。

関心のある領域付近では、ピントを調整し乱視を修正しつつ、重要な試料部分への直接ビーム曝露を避けます。偏心高度を設定して、関心のある領域(ROI)が傾き範囲全体で中心に保たれるようにします。ROIに近い特徴を選び、中央に合わせて乱視を矯正し、ステージをマイナス72度まで段階的に傾けます。

視野角を選ぶには、ROIに戻ってピントを合わせて全体像をキャプチャしてください。ティルトシリーズの取得に最終的な倍率を設定してください。マイナス72度からプラス72度までの画像の自動チルト取得を設定し、画像は1.5度ごとに撮影します。

自動ティルトシリーズの取得を開始してください。STEMサーモグラムの代表的な仮想スライスは、ビリオンの向きが2次元ビューにおける特徴的な弾丸形状の可視性にどのように影響するかを示しました。観察面に平行に整列したビリオンだけが弾丸の完全な形態で現れ、他のものは傾き角度に応じて円形または細長い形を呈しました。

2Dイメージングの向きの制限を克服するため、STEM断層撮影を用いて、出芽中の組換え小胞性口内炎ウイルスウイルスウイルスの大規模なクラスターを捕捉し、方向バイアスなしに三次元でビリオン形状を評価できるようにしました。サーモグラムの側面図は、STEM断層撮影が600ナノメートル厚さの単一の切片内に多数の完全なウイルスを捕捉する体積的優位性を確認しました。これは、200ナノメートルのTEM切片で可能な限られたサンプリングとは対照的です。