デュアルモダリティ分子地図作成:マルチプレックスmRNA検出とタンパク質イメージングマスサイトメトリーの統合
2025年11月14日
このプロトコルは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片におけるタンパク質イメージングマスサイトメトリーによるマルチプレックスmRNA検出の方法論を詳述しています。
卵巣がんの分子メカニズムをさらに理解し、新たな治療標的や生存率を予測するバイオマーカーを見つけるため、特殊生物学に注力しています。現在のIMCの課題の一つには、低存在量タンパク質の解剖、抗体の検証と滴定の作業、そして解析中の複雑で時間のかかるピクセル分類が含まれます。まず、準備済みのFFPEスライドから余分な液体を取り除きます。
湿度管理トレイをオーブンから取り出し、スライドホルダーをトレイに入れます。次に、ボルテックスRNA-ISH増幅3を徹底的に使い、スライド上の各組織断片を完全に覆うための試薬を加えます。トレイを閉じて、40度のハイブリダイゼーションオーブンに30分間入れます。
培養中は、金属オリゴヌクレオチド混合物を1対15の比率で希釈して準備します。金属オリゴをよく混ぜてボルテックスし、室温で放置して使用します。さて、湿度管理トレイをオーブンから外します。
スライドホルダーをトレイから取り出し、トレイをオーブンに戻します。その後、ヌクレアーゼフリーの水で洗浄された透明なスライドホルダーにスライドを置きます。スライドをウォッシュバッファーで軽くかき混ぜて2分間洗います。
スライドから余分な液体を取り除いた後、湿度管理トレイをオーブンから取り出し、スライドホルダーをトレイに入れます。事前に準備した混合金属オリゴヌクレオチドを加え、各組織切片を完全に覆います。トレイを完全に閉じて、40度で45分間ハイブリダイゼーションオーブンに入れます。
ハイブリッドオーブンから湿度管理トレイを取り出し、スライドホルダーを取り出し、空のトレイをオーブンに戻します。非特異的結合部位をブロックするには、スライド上の各組織切片を完全に覆うのに十分な量のブロッキングバッファーを追加し、室温で30分間培養します。スライドがインキュベーションされている間、抗体希釈バッファーを使って抗体を希釈して抗体混合物を準備します。
培養終了後、組織スライドからバッファーを捨て、事前に準備された抗体混合物を十分に投与して組織切片を完全に覆います。その後、スライドを湿度室に入れ、4度の温度で一晩培養します。新鮮なイリジウムインターカレーター溶液を準備するには、RNaseフリーTBSを使って500マイクロモルのストック溶液から1対2,000希釈します。
スライドをヌクレアーゼフリー水で事前に洗浄した透明なスライドホルダーに入れ、TBS-Tバッファーで軽く攪拌して5分間洗います。次にスライドを染めるために、準備済みのイリジウム作業液を加え、室温で5分間培養します。その後、スライドをヌクレアーゼフリーの水で事前に洗浄した透明なスライドホルダーに入れます。
スライドをTBS-Tバッファーで2回、軽くかき混ぜて5分間洗います。その後、TBSによる塩分結晶を防ぐためにスライドを二重蒸留水に素早く浸します。スライドを化学フードの下で10分間乾燥させ、画像取得まで4度の温度で保存します。
準備済みスライドを画像質量細胞計検査システムのアブレーションチャンバーに装填します。関心のある領域を特定するためにスライドのパノラマ画像を撮影してください。画像取得ソフトウェアを使い、パノラマ画像上で目的の関心領域をマークしてください。
画像取得ソフトウェアで取得テンプレートを適用してください。そして、サンプルの種類に応じてレーザーの出力を調整してください。さあ、レーザーアブレーションのプロセスを始めてください。
検出器を使って各同位体の量を測定し、データをデジタル形式に変換して分析します。CD8 T細胞の活性化状態は、mRNAおよびタンパク質レベルでのグランザイムBの共検出とインターフェロン・ガンマ陽性を用いて評価されました。がん関連線維芽細胞はMFAP5タンパク質とPOSTN mRNAを発現し、いずれもがん関連線維芽細胞の攻撃性を示すマーカーを示しました。
CD4 T細胞はIL17AとIL6 mRNAを共発現することが示され、これはTH17細胞の同一性と一致しています。CD4 T細胞はIL13 mRNAを発現することが観察されました。CD8 T細胞の近くにケラチン陽性のCD47陽性腫瘍細胞が認められました。
活性化されたCD8 T細胞はCD25タンパク質を発現することが示されました。金属共役プロトコルと蛍光標識プロトコル間でTHBS2とCD47のmRNA染色が類似して観察されました。
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概要
本プロトコルでは、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織切片を用いた、タンパク質イメージング質量サイトメトリーによるマルチプレックスmRNA検出の手法について詳述します。ここでは、新たな治療標的およびバイオマーカーを同定するため、卵巣癌の分子メカニズムを解明することに焦点を当てています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- 腫瘍学
背景
- 卵巣がんを分子レベルで理解すること。
- 低発現タンパク質の検出における課題。
- 抗体のバリデーションおよびタイトレーションの必要性。
- 解析中のピクセル分類の複雑さ。
研究目的
- 卵巣がんの新しい治療標的を見つけること。
- 患者の生存率を予測するバイオマーカーを特定すること。
- 組織試料におけるタンパク質検出の手法を改善すること。
使用された手法
- FFPEスライドの作製。
- ハイブリダイゼーションにおける湿度制御トレイの使用。
- RNA-ISH Amplifier 3試薬の適用。
- 制御された温度下でのハイブリダイゼーション。
主な結果
- マルチプレックスmRNAおよびタンパク質の検出に成功。
- 組織切片の解析における手法の改善。
- 卵巣癌の分子メカニズムに関する知見。
- 新規バイオマーカーを同定できる可能性。
結論
- このプロトコールは、卵巣がんの生物学的理解を深めるものです。
- タンパク質検出における課題に対処しています。
- 将来的な治療法の開発に向けた基礎を築きます。
よくある質問
産業界における重要性
マルチプレックスmRNA検出とタンパク質イメージング質量サイトメトリーを統合することで、単一の組織切片において空間的トランスクリプトームおよびプロテオームのプロファイリングを同時に行うことが可能となり、腫瘍学研究におけるメカニズムのリスク低減およびターゲット検証を促進します。このデュアルモダリティアプローチは、抗体のみによる検出や蛍光スペクトルのオーバーフローという制限を克服し、バイオマーカーおよび治療ターゲットの同定においてより高い予測信頼性を提供します。本手法は、初期探索およびトランスレーショナル研究において不可欠な、定量的な空間分解分子知見を提供することで、リスク調整後のポートフォリオ決定を支援します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見とターゲット検証
- 同一の細胞微小環境内におけるmRNAとタンパク質発現の直接的な相関を可能にします。
- 転写プライミングとタンパク質レベルのシグナリングの両方を明らかにすることで、機能的なターゲットバリデーションをサポートします。
- 疾患関連組織におけるパスウェイ活性と細胞状態を明確にすることで、メカニズム的なリスク低減を促進します。
- 候補ターゲットおよびバイオマーカーの優先順位付けにおける予測的な信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 下流のスクリーニングおよび化合物評価に向けた、検証済みでマルチプレックス化された組織系を調製します。
- mRNAおよびタンパク質分析物の両方について、in situで定量的かつ再現性のある出力を提供します。
- 単一のワークフローに分析物検出を統合することで、アッセイの冗長性を低減します。
- 蛍光ベースの手法と比較して、後処理および補正の必要性を最小限に抑えます。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患に関連する組織構造と空間的分子プロファイリングを整合させ、トランスレーショナルなバイオマーカー探索を可能にします。
- マルチプレックスで空間的に分解された読み取りをサポートすることで、探索から前臨床検証までの継続性を実現します。
- 臨床的に関連のあるサンプルから堅牢なマルチアナライトデータを提供し、リスク調整後の進展決定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このデュアルモダリティのワークフローは、FFPE組織切片における包括的な分子マッピングを可能にすることで、初期探索、ターゲットバリデーション、およびトランスレーショナルリサーチを橋渡しします。
- 探索生物学：mRNAとタンパク質の共発現をin situでマッピングすることにより、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：定量的な出力を持つ、アッセイにそのまま利用可能なマルチプレックス組織切片を提供し、ダウンストリームの評価を可能にします。
- アナリティクス：細胞表現型の堅牢な統計比較のため、同位体ベースのデジタル測定値を生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：複雑な組織微小環境におけるバイオマーカーの整合および疾患に関連したバリデーションを促進します。
- エンタープライズ再利用：腫瘍学および免疫学のポートフォリオにわたる、多分析物の空間的プロファイリングのための拡張可能で再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ターゲットおよびバイオマーカー探索における予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値：マルチプレックス検出ワークフローを標準化し、蛍光または抗体の制限に起因する技術的なアーティファクトを最小限に抑えます。
- 戦略的価値：堅牢な分子データに基づき、より十分な情報に基づいたgo/no-go判断および資本効率の高いポートフォリオの選別を可能にします。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後の優先順位付けを行い、信頼性の高いターゲットおよびバイオマーカーの推進をサポートします。
実施上の検討事項
- イメージング質量サイトメトリーおよびin situハイブリダイゼーション技術の専門知識が必要です。
- 金属プローブを用いた検出およびデジタル解析のための専用装置へのアクセスが求められます。
- 特異性と感度を確保するため、抗体およびプローブの厳格なバリデーションが必要です。
- 分析物の量や組織構造に基づき、異なる組織型や疾患モデルへの適応が必要な場合があります。
- プレキシティ（同時検出数）および空間分解能が高くなるにつれて解析の複雑さが増し、高度な計算ツールが必要となります。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:32
Hybridizing RNA-ISH Amplifier 3 to Ovarian Cancer FFPE Sections
1:47
Hybridizing Metal Oligos to the Tissue Sections
2:30
Hybridizing Metal Conjugated Antibodies to the Tissue Sections
3:20
DNA Staining to Prepare Tissue Sections for Imaging
4:33
Image Acquisition
5:35
Results
