Stereo-seq による 種に依存しないトランスクリプトームの包括的な空間プロファイリング
2025年10月31日
この記事では、組織構造を維持しながら多様なトランスクリプトームの高解像度マッピングを可能にするStereo-seqを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片から宿主、ウイルス、真菌、およびマイクロバイオームRNAの包括的な空間トランスクリプトームプロファイリングを実行するプロトコルを紹介します。
私たちの研究は、卵巣腫瘍の微小環境を詳細に特徴づけ、予測および治療バイオマーカーを特定することに焦点を当てています。例えば、化学療法の反応や抵抗性を予測するマーカー、あるいは第二選択治療の新規治療標的を見つけたいと考えています。実験上の課題には、サンプルの取り扱い、サンプルの品質評価、サンプルの処理にかかる時間の長さが含まれます。
データ分析側では、他の単一セルプロセスと同様のデータの希薄さや、特に反復的な領域のマッピングなどが課題となっています。ステレオシーケンスNチップをパッケージから取り出した後、チップ識別番号を記録します。Nチップの表面に触れずに、ガラススライドを100%エタノールで洗浄してください。
マイクロピペットを使い、ステレオシーケンスNチップの縁に10マイクロリットルの紫外線硬化セラミック樹脂を慎重に塗布します。密封されたフォーム綿棒で余分な樹脂を取り除き、チップの縁に細い線だけを残します。スライドを紫外線硬化装置に入れ、チップ表面に触れないようにします。
次に、樹脂を塗布したチップを不透明なマスクの上に置き、405ナノメートルの紫外線光源に照射し、スライドの裏側を照らし、5分間硬化させます。硬化後は、100%分子エタノールに浸した密封フォーム綿棒を使い、その後70%エタノール、最後にヌクレアーゼフリーの水で樹脂塗布された縁を洗浄します。50ミリリットルの円錐形チューブを使って、チップをヌクレアーゼフリーの新鮮な水に3回浸します。
圧縮空気を使い、約60〜80度の角度でチップを乾燥させ、表面を斜めに約5センチ離れた位置から移動させます。次に、チップ表面全体に150マイクロリットルのポリLリジン溶液を均等に塗布し、室温で10分間培養します。次にポリLリジン溶液をチップから取り除きます。
2回目の洗浄後は、チップの表面に触れずにスライドの端を慎重に乾かします。先ほど示したように、圧縮空気でチップをしっかり乾燥させます。FFPE組織を切片する際は、チップに直接触れず、チップの80%だけを組織で覆ってください。
SSCバッファーで2マイクロリットルの単鎖DNA染色溶液を調製するには、Qubit単鎖DNA試薬を5倍SSCバッファーで希釈します。リボヌクレアーゼ阻害剤を1から20希釈し、単鎖DNA溶液を1から200希釈し、残りの体積に5×SSCバッファーを用いてマスターミックスを作ります。各チップに150マイクロリットルの染色液を加え、室温の暗闇で5分間培養します。
次に、ピペットで各チップの角にある染色液を優しく取り除きます。チップを0.1倍のSSCバッファーで2回10〜15秒洗った後、スライドの端を慎重に乾かします。スライドに約3〜5マイクロリットルのグリセロールを加えて取り付けます。
スライドの約1センチ上からカバースリップを落とし、スライドを水平に保ち、チップの表面に触れないようにします。広視野顕微鏡を用いてDNA染色された一本鎖組織の蛍光画像を撮影し、画像タイル間の10%の重なりを確保します。ImageJのような画像処理ソフトウェアで、理論的な重なりを使っておおよそタイル位置を生成し、その後ピクセルマッチング計算重なりを適用してタイルを微調整することで、取得した画像を縫い合わせます。
縫い合わせた画像をStereoMapソフトウェアで処理し、画像品質管理がクリアされたか確認してから続けてください。ステレオシーケンススライドを0.1倍のSSCバッファー30ミリリットルに浸し、カバースリップが外れるまで浸します。FFPE脱架剤が室温であることを確認し、粒子の有無を検査してください。
サーモサイクラーを起動し、平衡のために30度、30分間の潜伏で95度、4度で無限に維持します。カセットガスケットを組み立て、ステレオシーケンスチップスライドをカセットに差し込みます。次に、ステレオシーケンシングスライドカセットのウェルにFFPE脱橋試薬を注入し、カセットにシーリングテープを貼って密閉されていることを確認します。
30分間の潜伏を95度Cから始めます。10分後、25ミリリットルのメタノールを50ミリリットルの容器に入れ、20度の冷凍庫に入れ、後で使用するために1枚あたり約1ミリリットル準備します。チップをサーモサイクラーから取り外した後、スライドカセットを作業台に移し、シーリングテープを剥がします。
ピペットを使って、カセットからFFPE脱架剤を取り出して捨てます。試薬が完全に除去されたら、カセットとガスケットを外して廃棄します。滅菌フードの下でスライドの縁を乾燥させ、必要に応じて新しいシリコーンチャンバーを取り付けます。
20度の冷凍庫から500マイクロリットルの冷却メタノールを加え、全体を水没させます。使用前に37度のドライブロックでPR溶液を10分間予温してください。固定後、フルームフード内でスライドの余分なメタノールを拭き取り、チップ上の残りのメタノールが蒸発するのを待ちます。
新しいカセットエンドガスケットを組み立ててください。蒸発が完了したら、ステレオシーケンスチップスライドをカセットに挿入します。チップに予熱された透水試薬200マイクロリットルを加えます。
ステレオシーケンシングスライドカセットにシーリングテープを貼り、しっかり密閉してください。逆転写を行い、その後、ここに示された手順に従ってCDNA放出と精製を行います。ヌクレアーゼフリーの水を37度まで予熱します。
チップのシールを外してください。削ったり触ったりせず、チップの四隅と中央を力強くピペットで組織の上に擦りつけます。チップからすべての相補的なDNA放出混合物を採取し、1.5ミリットルまたは2.0ミリリットルの遠心分離機チューブに移します。
チップの表面に直接予熱された予熱されたヌクレアーゼフリー水350マイクロリットルを加えます。小さなピペットで力強くピペットを動かし、先端を角度を変えて組織に触れたり削ったりすることなく、強い力をかけます。ウォッシュと、先に採取した400マイクロリットルの相対的なDNA放出ミックスを組み合わせ、単一のチップの物質のみを組み合わせます。
チップにヌクレアーゼフリーの水を100マイクロリットル置きます。ステレオシーケンススライドを密封し、プロトコル終了まで冷蔵庫で保管してください。SAWパイプラインを用いた単細胞セグメンテーションはFFPE切片で実現され、tRNAやTRDMT1などの非ポリアデニル化RNAへのマッピングが可能となりました。
インタラクティブな空間可視化では、独自のソフトウェアStereoMapを用いて推定される細胞タイプが示され、組織の拡大領域に様々な色でクラスターが表示されました。非ポリアデニル化RNAであるTRDMT1の全組織発現をStereoPiを用いて可視化しました。プロトコルの適応は、脂肪組織や脆弱組織のフルトランスクリプトミクス空間プロファイリングで抱えていた問題に対処し、組織の接着性、RNAのアクセス性、そしてこれらの難しい組織タイプに対するステレオシークシーク序の取り扱いを改善しました。
ステレオシークエンは現在、他の空間トランスクリプトミクス手法よりも高い解像度を提供し、解像度は2ミクロンに対し500ナノメートルです。また、マイクロバイオーム、ウイルス、非ポリアデニル化転写物の研究に必要な偏りのない捕捉も提供します。
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概要
この記事では、Stereo-seqを使用してホルマリン固定パラフィン埋め込み組織切片から宿主、ウイルス、真菌、およびマイクロバイオームのRNAの包括的な空間的トランスクリプトームプロファイリングを行うプロトコルを提示します。これにより、組織構造を保存しながら多様なトランスクリプトームの高い解像度のマッピングが可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学
- トランスクリプトーム学
背景
- 卵巣腫瘍の微小環境の特徴付け。
- 予測的および治療的バイオマーカーの同定。
- サンプル処理と品質評価の課題。
- データの疎さによるデータ分析の課題。
研究の目的
- 化学療法の反応と耐性を予測するマーカーを見つけること。
- 第二次治療の新しい治療標的を同定すること。
- 腫瘍微小環境の理解を深めること。
使用された方法
- Stereo-sequencing N-Chipプロトコル。
- サンプル処理および品質評価技術。
- 疎さとマッピングに対処するデータ分析方法。
- ホルマリン固定パラフィン埋め込み組織切片の使用。
主要な結果
- 多様なトランスクリプトームの成功したマッピング。
- 分析中の組織構造の保存。
- 治療反応の潜在的なバイオマーカーの同定。
- トランスクリプトーム学におけるデータ分析の課題への洞察。
結論
- このプロトコルはRNAの包括的なプロファイリングを可能にします。
- 高い解像度のマッピングはバイオマーカーの発見に役立ちます。
- 実験上の課題に対処することは成功に不可欠です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Stereo-seq enables comprehensive spatial transcriptomic profiling of both host and non-host RNA species in FFPE tissues, addressing a critical gap in unbiased, high-resolution mapping of cellular and microbial transcriptomes. This capability supports predictive confidence in target validation and biomarker discovery, particularly in complex tissue microenvironments such as tumors. The method's species-agnostic approach enhances portfolio decision-making by revealing intra- and inter-actome interactions relevant to therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially resolved interrogation of transcriptomic heterogeneity within disease-relevant tissues.
- Supports identification of predictive and therapeutic biomarkers by mapping cell-type and pathogen interactions.
- Facilitates mechanistic de-risking through unbiased detection of coding and non-coding RNAs, including microbial and viral species.
- Improves predictive confidence for target selection in complex microenvironments.
Screening & Assay Development
- Prepares validated spatial transcriptomic maps for downstream functional screening workflows.
- Standardizes assay outputs with subcellular resolution and quantitative spatial data.
- Enables reproducible detection of diverse RNA species, supporting robust assay development.
- Provides high-content data for reliable compound evaluation in tissue context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial transcriptomic data with translational biomarker strategies in oncology and infectious disease models.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by capturing host-pathogen and cell-cell interactions.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by revealing tissue-specific transcriptomic signatures.
- Enhances predictive de-risking for late-stage biological risk assessment.
Pipeline & Workflow Integration
Stereo-seq integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling spatially resolved, species-agnostic transcriptomic profiling from FFPE tissues, supporting both early discovery and translational research inflection points.
- Discovery Biology: Provides hypothesis testing and pathway clarification through unbiased RNA detection at subcellular resolution.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible spatial transcriptomic outputs for assay readiness.
- Analytics: Generates high-content spatial data enabling comparative analysis of cell types and microbial loads.
- Translational Research: Connects spatial transcriptomic signatures to preclinical biomarker validation and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for spatial profiling across diverse tissue types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes spatial transcriptomic workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in spatial transcriptomics and FFPE tissue handling.
- Demands advanced imaging, sequencing, and bioinformatics infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation and data analysis.
- Adaptation may be needed for fatty or fragile tissues to ensure RNA accessibility and tissue adhesion.
- Careful contamination control is essential to distinguish true tissue signals from environmental artifacts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:58
Stereo-Seq Random Oligonucleotide Capture Chip (N-Chip) Preparation
3:06
Nuclear Imaging and ssDNA Staining of the FFPE Tissue Sections
5:08
Decrosslinking Process of the Stained FFPE Sections
7:43
Collection of the cDNA Release Mix
8:56
Results
9:36
Conclusion
